细胞生物学实验二细胞器的分级分离
细胞器的分离、纯化实验ppt课件
实验方法
玉米黄化幼苗线粒体的分别〔整个过程坚持在0-4℃ 〕
1.将玉米黄化幼苗剪下，称重每小组约5g，在冰箱中 放置1小时
2.将幼苗剪碎直接倒入研钵中以1:3(分量体积比g:ml) 比例参与离心匀浆介质，快速研磨，留意先参与少 许介质液，研碎后将余液参与
3.用双层尼龙网过滤，除去残渣。 4.取滤液在低温高速离心机伤2300rpm离心10min弃
该法的优点是：①分别效果好，可一次获得较纯颗 粒；②顺应范围广，既能分别具有沉淀系数差的颗 粒，又能分别有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会 积压变形，能坚持颗粒活性，并防止已构成的区带 由于对流而引起混合。
缺陷：① 离心时间较长；②需求制备梯度；③操 作严厉，不宜掌握。
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半径
方法： 两点一 线法
4. 试剂：
5.
① 线粒体离心匀浆介质。
6.
② 1%詹纳斯绿B的0.25M蔗糖溶液。
7.
③ 0.05M Tris-HCl液体 Ph=8.0
8.
④ 0.35mol/L NaCl
匀浆介质，普通为一定浓度的蔗糖溶液参与其它
9离. 子成分，可以维持亚细胞组分的浸透压。
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概述
离心机
！
制备性
分析性
普通离心机
细胞器的分别、纯化 — 细胞分级分别法
—秦川
实验目的
实验原理
实验用品
实验方法
运用范围： 1.病毒及亚细胞 组份分别 2.蛋白梯度分别 3.脂蛋白分别 4.RNA梯度沉淀 5.质粒DNA提纯
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实验目的
• 认识离心机及学习离心机的运用方法 • 学习细胞器的分别及纯化的普通原理和
方法
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细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离
实验二细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离与观察一、实验目的：1、了解细胞器分离的一般原理和方法；2、掌握分级分离的原理和注意事项;3、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光.4、线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B超活染色的方法.二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法.细胞组分的分离在等渗溶液〔0.35mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液〕中进行.●将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min以全除组织残渣和未破碎的细胞.●在3000r/min的条件下离心5 min,即可获得沉淀的叶绿体〔混有部分细胞核〕.●上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.三、实验步骤：第一部分细胞核与叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜叶,洗净搽干后去除叶梗和粗脉,称30g于150ml0.35mol/L Nacl溶液中,放入组织捣碎机<间歇>；低速匀浆1min；间歇匀浆.2、将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中.3、每小组取滤液4 ml在1000r/min的条件下离心2 min；4、取上清液在3000r/min的条件下离心5 min；沉淀即为叶绿体〔混有部分细胞核〕；上清夜转入干净的离心管中用于线粒体分离.5、叶绿体观察：➢将沉淀用0.35mol/L Nacl悬浮.〔浓度不要太高,不利于观察〕➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,加盖玻片即可在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察；➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,再滴加一滴0.01%吖啶橙染料,加盖玻片即可在荧光显微镜下观察.第二部分线粒体的分级分离以及超活染色观察6 第4步获得的上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.收集沉淀涂片,用1%詹纳斯绿B染色5-10分钟,线粒体为蓝绿色圆形颗粒.实验过程最好在0-4o C的条件下进行；如果在室温下,要迅速分离和观察.〔教师演示示X〕第三部分人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察一、实验目的：观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布.二、实验原理：线粒体是细胞进行呼吸作用的场所,其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同生理状态而发生改变.詹纳斯绿B是一种毒性较小的碱性染料,可专一性的对线粒体进行超活染色,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态〔即有色状态〕,呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基〔即无色状态〕.三、实验步骤：1、取清洁载玻片,滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液；2、用牙签宽头在口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞,将刮下的黏液状物放入载玻片的染液中,染色10-15 min；〔作用,染液不可干燥,必要时加滴染液〕；3、盖上盖玻片,置显微镜下观察.四、实验结果：在低倍镜下,选择平展的口腔上皮细胞,换高倍镜观察,可见扁平状上皮细胞内,核周围的胞质中,分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构,即为线粒体.实验作业：3 绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布.。
细胞器的分级分离
[注意事项]
• 1．组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破
碎，又要尽量快速。 • 2．在细胞器分离过程中，所有操作应尽可
能在1～4℃下进行。 • 3．实验过程应注意保持细胞器的完整性，避免操
作过于剧烈。另线粒体进行的是活体染色，要 求样品制备好后尽快染色。
再 见
(2)线粒体的鉴定
于洁净载玻片上滴1滴0.02％～1％的詹纳斯 绿B染液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中， 染色5～10 min，盖上盖玻片，镜检。
[结果与分析
光学显微镜下观察，细胞核经甲基绿-派洛宁染 色，DNA呈蓝绿色，核仁和胞质RNA呈红色。观 察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经詹 纳斯绿B染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸酶显 示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征，但 可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果分 离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征，而且 没有其他组分的污染，则证明分离操作成功，反 之则为失败。
2.细胞器的分级分离
(1)细胞核的分离： 第一次:1000rpm,8min。
上清保留于Ep管1.0处
加0.25M蔗糖至4ml，混 匀
第二次:1300rpm,8min。弃上清 (2)细胞核的纯化
在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2至2ml，混悬。用长针头注射器在混悬液下轻 轻加入2ml 的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2 溶液。尽量使两种溶液明显分层。 2000rpm离心 8min。
(3)细胞核鉴定：
。
涂片：在离心后的沉淀中加入几滴PBS， 混匀后涂片，空气干燥
固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾 干 染色：滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min
细胞组分的分级分离
离心机机型 低速离心机 高速离心机 超速离心机
转速 8 000转/分 8 000~25 000转/分 25 000 ~ 80 000转/分
分离方法
❖ 差速离心分离法：利用不同离心速度产生的不同离 心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。
❖ 密度梯度离心分离法：将要分离的细胞组分铺放在密 度逐渐增加的介质表面，在超速离心力的作用下， 不同的组分以不同的沉降速率沉降，形成不同的 沉降带。
❖ 离心技术：
1. 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基 本手段。
2. 转速为10-25kr/min的离心机称为高速离心机。
3. 转速>25kr/min，离心力>89Kｇ者称为超速离心机。
4. 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。
颗粒直径 103nm 102~104nm 102nm
线粒体含量较多；长度适合观察，约5μm；肝脏较软，易 于破碎，并且适于快速提取，因而利于保持线粒体活性。
细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其 他微体、核糖体和大分子。
詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线 粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使詹纳斯绿B染料始终保持 氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中詹 纳斯绿B被还原成无色的化合物。
差速离心法differential centrifugation
匀浆
离心
1 000G20分钟
细
胞
细胞骨架
细胞骨架
核
离 心 10 000G
20
分 钟
核 糖 体 等
离心0.26%脱氧胆酸钠 微
离心
15 000G20分钟
分级实验报告
一、实验背景与目的随着细胞生物学研究的不断深入，对细胞内不同结构和功能区域的了解日益重要。
细胞器分级分离技术作为一种重要的细胞生物学研究方法，能够有效地将细胞内各种细胞器分离纯化，从而便于研究其形态结构、化学组成和生理活性。
本实验旨在通过分级离心法，分离纯化细胞内线粒体、内质网、高尔基体等细胞器，并对其形态和生化特性进行观察和分析。
二、实验原理细胞器分级分离法是利用细胞器大小、形状、密度等物理性质的差异，通过离心力将细胞器分离纯化的方法。
根据细胞器的大小和密度，选择合适的离心速度和时间，可以将细胞器分离成不同的层次。
通常，线粒体、内质网、高尔基体等细胞器在离心过程中分别位于不同的层。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 人胚胎肝细胞- 生理盐水- 0.25%胰蛋白酶- 10%Triton X-100- 线粒体提取缓冲液- 内质网提取缓冲液- 高尔基体提取缓冲液- 1%戊二醛固定液- 磷酸盐缓冲液（PBS）2. 实验仪器：- 离心机- 显微镜- 电子天平- 移液器- 离心管四、实验步骤1. 细胞悬液的制备：- 将人胚胎肝细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，待细胞生长至80%汇合度时，用生理盐水洗涤细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液。
2. 细胞器的分离：- 将细胞悬液按1:1比例加入预冷的生理盐水，用移液器吹打细胞，使细胞分散均匀。
- 将细胞悬液转移至离心管中，在4℃、1500g下离心10分钟，弃去上清液，得到细胞沉淀。
- 向细胞沉淀中加入预冷的线粒体提取缓冲液，重悬细胞，在4℃、1500g下离心10分钟，弃去上清液，得到线粒体沉淀。
- 重复上述步骤，分别得到内质网和高尔基体沉淀。
3. 细胞器的观察和分析：- 将线粒体、内质网和高尔基体沉淀分别用1%戊二醛固定，进行电子显微镜观察。
- 对分离得到的细胞器进行生化分析，如酶活性测定、蛋白质含量测定等。
五、实验结果1. 细胞器的形态观察：- 线粒体：呈棒状、椭圆形或圆形，外被双层膜，内部有嵴和基质。
实验3.ppt细胞器分离
(6)细胞核鉴定： (6)细胞核鉴定： 细胞核鉴定
。
悬浮：在离心后的沉淀中加入几滴PBS，混匀 涂片,空气干燥． 固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾干 染色： 滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min 分色:快速放入丙酮中20s，蒸馏水漂洗，擦干水 分
镜检：观察先用低倍镜。 （7）镜检：观察先用低倍镜。再用高倍镜
差速离心： 差速离心
采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。 被分离的分子越小，需要的离心速度越高。
大颗粒首先沉到管底
较小颗粒沉降
速度区带分离法： 速度区带分离法：
预先装入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油）， 利用各种颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同 沉降速度的颗粒处于同一梯度层内。
(2)匀浆: (2)匀浆: 匀浆
每组取适量剪碎组织，放入匀浆器中,加入3ml的 0.25mol/L蔗糖溶液进行匀浆。
过滤： (3) 过滤：
将组织匀浆完毕，用尼龙网过滤，每组取 2ml的过滤液移入离心管中。
(4)离心： (4)离心： 离心
第一次: 1000rpm 1000rpm,8min。
上清保留于试管1.0处
[作业 作业] 作业 绘制细胞核及线粒体的基本形态 [思考题 思考题] 思考题 本次实验中用了哪些离心方法，原理是 本次实验中用了哪些离心方法， 什么？ 什么？ 注意事项 1、染色时间要充分。 、染色时间要充分。 2、丙酮分色时要迅速，以防细胞核脱色。 、丙酮分色时要迅速，以防细胞核脱色。
注：待分离颗粒密度比介质密度都要大： 不能离心太久，否则两种颗粒都会沉到底部
[内容与方法 内容与方法] 内容与方法
内容： 内容：
大鼠肝细胞细胞核及线粒体的分离
方法： 方法：
分离细胞器的方法
分离细胞器的方法细胞器是细胞内的重要结构，它们在细胞的生存和功能执行中起着至关重要的作用。
分离细胞器是细胞生物学和生物化学研究中的重要操作，可以帮助科研人员更好地了解细胞器的结构和功能。
下面将介绍几种常用的分离细胞器的方法。
一、差速离心法。
差速离心法是一种常用的分离细胞器的方法，通过利用细胞器的不同密度来进行分离。
首先，需要将细胞悬液置于离心管中，然后进行低速离心，使细胞器沉淀到离心管底部。
接下来，将上清液转移到另一个离心管中，进行高速离心，这样可以将不同密度的细胞器分离出来。
通过这种方法，可以获得相对纯净的细胞器样品。
二、梯度离心法。
梯度离心法是利用密度梯度离心离心细胞器的方法。
首先，需要制备密度梯度离心液，然后将细胞悬液均匀地加在离心管上，进行超速离心。
在离心过程中，不同密度的细胞器会在密度梯度中分层沉淀，从而实现分离。
这种方法可以得到高纯度的细胞器。
三、超声破碎法。
超声破碎法是一种利用超声波对细胞进行破碎，分离细胞器的方法。
首先，将细胞悬液置于超声破碎仪中，经过超声波的作用，细胞膜会破裂，释放出细胞器。
然后，通过差速离心或梯度离心的方法，可以将细胞器分离出来。
这种方法操作简单，适用于一些对纯度要求不高的实验。
四、亲和层析法。
亲和层析法是利用生物分子之间的特异性相互作用来分离细胞器的方法。
通过将含有特定亲和基质的层析柱与混合细胞器悬液一起进行层析，利用细胞器与亲和基质之间的特异性结合来实现细胞器的分离。
这种方法可以得到高纯度的细胞器样品，适用于对细胞器纯度要求较高的实验。
五、离心上清法。
离心上清法是一种简单快捷的分离细胞器的方法。
首先，将细胞悬液进行差速离心，将上清液收集起来。
然后，通过连续的离心步骤，可以逐渐将不同密度的细胞器分离出来。
这种方法操作简单，适用于一些对纯度要求不高的实验。
总结。
以上介绍了几种常用的分离细胞器的方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际操作中，可以根据实验的需要选择合适的方法进行细胞器的分离，以获得满意的实验结果。
细胞组分的分级分离方法
细胞组分的分级分离方法
细胞组分的分级分离方法包括密度梯度离心法、贴壁培养法、超速离心法、层析法和电泳法。
密度梯度离心法是根据细胞密度的不同，在高速离心机中经过长时间离心，使细胞分层沉淀，形成密度梯度。
根据密度梯度的不同，可以将不同密度的细胞分开。
这种方法分离效果好，可以获得较为纯的细胞，适用于大多数细胞类型的分离。
但这种方法需要使用大型设备，操作也比较复杂，需要专业人员操作。
贴壁培养法是根据细胞贴壁生长速度的不同，将不同种类的细胞分离。
这种方法需要在培养皿中加入适量的培养液，然后将待分离的细胞悬液加入培养皿中，让其在培养液中贴壁生长。
由于不同种类的细胞贴壁生长速度不同，因此经过一定时间的培养，可以观察到不同种类的细胞在培养皿中形成的“岛屿”状分布。
根据不同种类的细胞形成的“岛屿”状分布的不同，可以将它们分离出来。
此外还有超速离心法、层析法和电泳法等方法。
这些方法各有特点，可以根据实验需求选择合适的方法进行细胞组分的分级分离。
细胞生物实验教学大纲
《细胞生物学》实验教学大纲（执笔人：张利平审核人：教学院长：）一、课程简介（一）课程代码：（二）课程名称：《细胞生物学》实验( Experiment of Cell Biology )（三）修读对象：生物科学及生物技术专业本科生（四）总学时与学分：27学时/3学分（五）考核方式：随堂测试（六）相关课程：医学细胞生物学、普通生物学、医学遗传学（七）内容提要：这本实验教材是为高等医学院校细胞生物学实验教学编写的，适用于四年制生物科学及生物技术专业学生。
细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过基本技能训练以及观察分析实验结果，使学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。
为达到此目的，实验内容自成体系，着眼于加强学生的基本技能训练，以及观察分析问题和科学思维能力的培养。
大多数实验采用生活细胞材料，由学生自己动手取材和实验，使学生能对细胞获得生动的认识。
选编了一些生物医学常用的细胞生物学基本实验，如细胞的显微观察、细胞计数、细胞组分的分级分离、细胞组分的化学反应、细胞生理活动、细胞培养、细胞融合等，为后续的课程及医学研究打下一定基础。
二、教学目的和教学方法：培养学生基本的细胞生物学实验方法并培养学生的实际动手操作能力，帮助学生形成基础实验研究思路，为后续的学习和实验研究打下基础。
全书内容共5个实验，针对各专业学生教学根据具体情况采用学生动手操作为主，部分操作教师演示示教为辅的方式结合进行。
三、教学学时分配总学时27，各实验学时分配如下：实验一：鸡血细胞的融合实验 6学时实验二：细胞器的分级分离 6学时实验三：微丝染色及形态学观察 5学时实验四：细胞中碱性蛋白的显示 5学时实验五：红细胞膜的通透性 5学时四、选用教材和主要教学参考书教材：《细胞生物学》翟中和主编高等教育出版社出版教学参考书：1.分子细胞生物学韩贻仁科学出版社2.细胞生物学王德耀上海科学技术出版社3.细胞生物学研究方法与技术(第二版) 刘鼎新北医、协和医大联合出版社4.细胞生物学实验(第二版) 杨汉民高等教育出版社1997年07月出版5.Molecular Biology of the Cell 4th Edition, Bruce Alberts et al.6.Molecular Cell Biology 4th Edition, Harvey Lodish et al.目录实验一鸡血细胞的融合实验 (5)实验二细胞器的分级分离 (6)实验三微丝染色及形态学观察 (7)实验四细胞中碱性蛋白的显示 (9)实验五红细胞膜的通透性 (10)实验一鸡血细胞融合实验【教学目的】1.掌握细胞融合的概念及基本原理。
细胞器的分级分离
细胞器的分级分离
第10页
实 验用具
1、普通台式离心机：4台 2、研钵：30个 3、40ml小烧杯:30个 4、纱布：5包 5、离心管60支 6、载玻片及盖玻片见指导。
细胞器的分级分离
第11页
一、叶绿体分离
细胞器的分级分离
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细胞中及匀浆中叶绿体
细胞器的分级分离
第13页
叶绿体分离步骤
1、采样、洗涤、去叶脉：最好在晴天早晨10时左 右选取生长正常菠菜叶子（菜心、白菜、豌豆 也可）洗洁净，用吸水纸擦干，去柄及粗脉
由低速到高速离心逐步沉降细胞器。 先用低速使较大颗粒沉淀，再用较高转速将
上清液中小颗粒沉淀下来。
Differential centrifugation
High speed
细胞器的分级分离
Low speed
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密度梯度离心（density gradient centrifugation method ）
第6页
Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation
细胞器的分级分离
第7页
分析
分级分离得到组分，可用细胞化学和生化方 法进行形态和功效判定。
细胞器的分级分离
第8页
（一）实 验材料
多叶绿菜
细胞器的分级分离
第9页
实 验试剂
0.4M蔗糖 0.35M氯化钠（每升19.856g氯化钠）
亦称平衡密度梯度离心法。
用超速离心机对小分子物质溶液，长时间加 一个离心力场到达沉降平衡，在沉降池内从 液面到底部出现一定密度梯度。
若在该溶液里加入少许大分子溶液，则溶液 内比溶剂密度大部分就产生大分子沉降，比 溶剂密度小部分就会上浮，最终在重力和浮 力平衡位置，集聚形成大分搜集叶绿体：上清液在2600rpm离心5分 钟，弃上清液，沉淀即是叶绿体。
高中生物 实验二：细胞核与线粒体的分级分离
实验五：细胞核与学会匀浆器的使 用。
2.掌握分级分离的实验方法。 3.熟悉离心机的使用要点。
实验步骤
一.细胞核的分离提取
1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部
取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9 ％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸 吸去表面的液体。 2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取 8mL预冷的0。25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙 溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后， 再全部加入。
实验原理
细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内 的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离 心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬 浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀 浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成 分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
实验原理
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中， 加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化 钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用 低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液 中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线 粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒 在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得 到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮 和离心加以纯化。
简要说明细胞组分的分级分离原理及其意义
简要说明细胞组分的分级分离原理及其意义
细胞是构成生命的基本单位，其中包含了许多不同种类的有机分子和结构，这些分子和结构相互协同合作，共同维持着细胞的正常功能。
为了更好地研究和了解细胞的结构和功能，科学家们发展了一系列的技术和方法，其中最重要的之一就是细胞组分的分级分离。
细胞组分的分级分离原理主要是基于细胞内不同组分的密度、大小、电荷等物理化学性质的差异，通过一系列的分离步骤，将细胞内的各种组分逐步分离出来。
这一过程通常包括细胞破碎、离心、超速离心、凝胶过滤等步骤，通过不同的分离技术和方法，可以将细胞内的核糖体、线粒体、内质网、高尔基体等组分分离出来，从而更深入地研究这些组分的结构和功能。
细胞组分的分级分离在细胞生物学和生物化学研究中具有非常重要的意义。
首先，通过分级分离可以帮助科学家们更好地了解细胞内各种组分的结构和功能，揭示它们之间的相互关系和作用机制，为研究细胞生物学和生物化学提供重要的实验依据。
其次，分级分离还可以帮助科学家们筛选和纯化特定的蛋白质、核酸或其他生物大分子，为进一步研究这些生物分子的性质和功能奠定基础。
此外，分级分离还可以应用于临床诊断和药物研发领域，帮助人们更好地理解疾病发生的机制，寻找新的治疗方法和药物靶点。
总的来说，细胞组分的分级分离原理及其意义是非常重要的，它为
研究细胞结构和功能提供了重要的工具和方法，推动了细胞生物学和生物化学领域的发展。
通过不断改进和完善分级分离技术，相信我们能够更深入地了解细胞内部的奥秘，为人类健康和生命科学的发展做出更大的贡献。
细胞器的分级分离
(2)线粒体的鉴定
于洁净载玻片上滴1滴0.02％～1％的詹纳Байду номын сангаас绿B染 液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中，染色5～ 10 min，盖上盖玻片，镜检。
[结果与分析]
光学显微镜下观察，细胞核经甲基绿-派洛宁 染色，DNA呈蓝绿色，核仁和胞质RNA呈红色。观 察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经詹 纳斯绿B染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸酶显 示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征，但 可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果分 离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征，而且 没有其他组分的污染，则证明分离操作成功，反 之则为失败。
(3)细胞核鉴定：
。
涂片：在离心后的沉淀中加入几滴PBS，混 匀后涂片，空气干燥 固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾干 染色：滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min 分色:快速放入丙酮中，蒸馏水漂洗，擦干水分
显微镜下观察结果
(4)线粒体的分离
将分离细胞核时收集的上清以10000 g 离心10 min，将上清移入1.5 ml Ep管内并置冰上或4℃冰箱 待用。沉淀用0.25 mol/L的蔗糖溶液重悬后， 10000 g离心10 min，重复1次，取沉淀。
2.细胞器的分级分离
(1)细胞核的分离： 第一次:1000rpm,8min。
上清保留于试管1.0处
加0.25M蔗糖至4ml，混匀
重复1次
第二次:1300rpm,8min。弃上清
(2)细胞核的纯化 在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2 至2ml，混悬。用长针头注射器在混悬液下轻轻加入2ml 的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2溶液。尽量使两 种溶液明显分层。 2000rpm离心8min。
细胞器的分离纯化细胞分级分离法讲解ppt课件
考 评 项 目 赋 标准分 ，对照 考评内 容和考 评办法 对考评 项目进 行考评 ，评出 各考评 项目的 考评实 际得分 ，考评 类目下 各考评 项目考 评实际 得分之 和为该 考评类 目的考 评实际 得分
实验方案
观 察 到 的 线 粒 体 预 期 图
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考 评 项 目 赋 标准分 ，对照 考评内 容和考 评办法 对考评 项目进 行考评 ，评出 各考评 项目的 考评实 际得分 ，考评 类目下 各考评 项目考 评实际 得分之 和为该 考评类 目的考 评实际 得分
实验方案
玉米黄化幼苗线粒体的分离(整个过程保持在O-4℃) 1、将玉米黄化幼苗剪下，称重每小组约取5g，在冰箱中放置l小 时。 2、将幼苗剪碎直接倒入研钵中，以l∶3(重量体积比g：m1)比例 加入离心匀浆PBS介质，快速磨碎，注意先加入少许介质液，研 碎后再将余液加入。 3、用双层尼龙网过滤，除去残渣。 4、取滤液在低温高速离心机上2300rpm离心lO分钟，弃沉淀。 5、取上清液在低温高速离心机上9950rpm离心lO分钟，弃上清。 6、所留沉淀用匀浆介质液洗涤，仍以9950rpm离心10分钟．弃上 清。 7、将所得沉淀悬浮于0.5M、PH7.2甘露醇中，置冰箱备用。 8、将制备的线粒体悬液滴于干净的载玻片上，用1％詹纳斯绿B 的0.25M蔗糖液(PH7.4)染色20分钟。 9、加盖玻片(需特别干净)。镜检最好用相差显微镜,凡线粒体均 被詹纳斯绿B染成蓝绿色颗粒，检验制备线粒体的纯度。
0.1N HCl
55ml
蒸馏水 200ml
(4) 0.35mol/l NaCl
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考 评 项 目 赋 标准分 ，对照 考评内 容和考 评办法 对考评 项目进 行考评 ，评出 各考评 项目的 考评实 际得分 ，考评 类目下 各考评 项目考 评实际 得分之 和为该 考评类 目的考 评实际 得分
细胞组分分级分离实验报告
细胞组分分级分离实验目的分级分离细胞核和线粒体实验原理1.相关概念细胞组分分级分离：依据细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内的沉降速度也不同的原理，采用差速离心法或密度梯度离心法，将细胞各种组分分离出来。
常用分离方法：差速离⼼法——不同转速；密度梯度离⼼法——不同浓度的介质2.分离方法（1）差速离⼼法特点：介质密度均⼀；离⼼⼒由低向⾼；逐级离⼼（差速）。
⽤途：初步分离；分离⼤⼩相差悬殊的细胞组分。
细胞器沉降顺序：细胞核→线粒体→溶酶体、过氧化物酶体→内质网、⾼尔基体→核糖体（2）密度梯度离⼼法特点：介质密度不均⼀；呈现密度梯度；离心力相同（等速，超速）⽤途：纯化分离细胞器等颗粒组分待分离颗粒沉降顺序：各待分离颗粒的沉降与其密度相等或相近的梯度柱范围常⽤介质及要求：蔗糖、⽢油、氯化銫；能产⽣密度梯度，且密度⾼时，粘度不⾼；PH中性或易调为中性；浓度⼤时渗透压不⼤；对细胞⽆毒3.染色方法甲基绿-哌罗宁染色：核酸呈酸性，与碱性染料甲基绿-哌罗宁染液具有亲和力，这两种碱性染料有选择的特异性染色，甲基绿把DNA染成绿色，哌罗宁把RNA染成红色。
詹纳斯绿B染色：詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染（体外活染），这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使詹纳斯绿B染料始终保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中詹纳斯绿B则被还原成无色的化合物。
实验设计思路实验结果分散相的线粒体被染成浅蓝色，呈圆形或椭圆形颗粒。
如果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色，难以辨认。
注意事项1.过滤前要先将纱布湿润2.匀浆缓冲液预冷(0℃—4℃)3.冰浴上研磨，匀浆搗杆垂直插入匀浆管中，上下转动研磨3-5次，尽可能充分破碎细胞(适度研磨)，缩短匀浆时间。
4.离心机温度应设为4℃5.整个分离过程不宜过长,要尽快。
6.得到的沉淀物须加预冷蔗糖缓冲液将其悬浮后再涂片，制线粒体滴片时，悬浮液只需一小滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。
细胞生物学细胞分离实验
教师签名：
年月日
所以，可酌情将步骤（4）中洗涤核沉淀后离心得到的上清与步骤（3）的上清合并加以利用。
4．由于线粒体进行活性染色法的检测，所以样品制备好后应尽快染色，不要放置过久。
5.詹纳绿B活体染色线粒体后，水洗必须充分，以除去特异性染料附着。另一方面，不能让水流直接对着样品冲洗，防止样品丢失。
[1]《细胞生物学实验教程》王金发，何炎明主编
1．实验前大鼠空腹12小时，用颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速剖腹取肝，在冰浴的小烧杯中剪成小块（去除结缔组织），尽快置于冰冷的生理盐水中，反复洗涤，尽量除去血液，用滤纸吸去表面的液体。
2．剪碎的肝组织移入玻璃匀浆管中，加入适量匀浆液，进行匀浆（注意保持冰浴状态），快速匀浆20～30次后，用蔗糖／氯化钙预湿的尼龙布过滤于离心管中。
3．将装有滤液的离心管以2500g，4℃离心15min，取上清液，移入高速离心管中，并保存于冰浴中，待分离线粒体用。
4．收集的沉淀以少量蔗糖／氯化钙溶液重新悬浮，以2500g离心15min，弃上清。
5．洗涤过的沉淀以少量溶液重新悬浮，制备成细胞核悬液，滴一滴于干净的载玻片上，作涂片，自然干燥。
6．涂片用1%甲苯胺蓝染色，在光镜下观察。
课程名称：细胞生物学
专业名称：生物工程
姓名：
学号：
指导老师：
实验设计方案
实验项目
细胞核与线粒体的分级分离
课程名称
细胞生物学实验技术
指导教师
年级班级
专业
生物工程
小组成员
开课学期
2011-2012第一学期
一、实验目的
1.了解细胞核与线粒体分离的基本原理及掌握操作方法。
2.掌握匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理及过程，学习分级分离细胞组分的方法。
实验二 细胞器的分离与提纯
实验二细胞器的分离与观察一、教学目的与要求1. 学习利用差速离心法分离动物细胞的细胞器。
2. 掌握细胞核与线粒体的染色方法和现象。
二、实验原理线粒体（Mitochondria，MT）是真核细胞特有的，进行能量转换的重要细胞器，有“细胞动力工厂”之称。
细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在线粒体中进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成A TP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体采用组织匀浆悬液介质中进行差速离心的方法。
在给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。
三、实验用品器材：冰箱、纱布、瓷研钵、高速冷冻离心机。
材料：新鲜的猪肝脏。
试剂：见PAGE 64四、实验步骤1. 制备猪肝细胞匀浆。
实验前购买新鲜猪肝脏备用。
割取一小块肝组织，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。
称取肝组织1g，剪碎，用预冷到0-4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。
然后在0-4℃条件下，按每克肝加4ml 冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层纱布过滤备用。
实验二 细胞器的分离
实验二细胞器的分离、提取与测量【目的】掌握叶绿体分离的一般原理和方法，学习用测微尺测量细胞与细胞器大小的测定方法，并了解应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。
【原理】叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。
利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4mol／L蔗糖溶液)中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。
将匀浆液在1000r／min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000 r／min离心，可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。
在室温下进行分离要迅速。
用显微测微尺可以直接测量细胞大小，精确度较高。
显微测微尺分为物镜测微尺和目镜测微尺2种。
目镜测微尺是1块小玻璃圆片(可放人目镜内，其大小正好卡人目镜筒内)，在圆片正中央刻有1cm长的直线，直线上均匀分为100小格或50小格，每小格的长度，随目镜和物镜的放大倍数而变动。
物镜测微尺是一块特制的玻璃载片，载片中央刻有一条1mm 长的直线，均匀地刻分为100个小格，每小格为1／100mm (为10μm)，用一小圆形玻璃盖片封盖着，物镜测微尺较目镜测微尺小格的间距精确，通过目镜测微尺测量细胞与细胞器的大小(小格数)，然后换以物镜测微尺校测小格数的精确数值，即为测量的细胞与细胞器大小结果。
某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光(称为自发荧光)，如叶绿素的火红色荧光。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光(称为间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。
【材料】菠菜叶片。
【实验用品】1．试剂：蒸馏水，0.35 mol／L氯化钠溶液，0.01% 吖啶橙。
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• 高等植物叶绿体制备 • 动物细胞线粒体的分离
实验目的
• 通过细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞 的组分，以了解其原理及过程。
实验原理
•
细胞内不同细胞器的比重和大小都不相同，
在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一
原理，用不同转速的离心法，将细胞内各种组分
分级分离出来。
•
（一）差速离心 Differential centrifugation
• 特点：
– 介质密度均一； – 速度由低向高，逐级离心。
• 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 • 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——
内质网与高基体——核蛋白体。 • 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分
离纯化。
Differential centrifugation
High speed
Low speed
（二）密度梯度离心
• 用介质在离心管内形成一连续或不连续的 密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质 的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、 分离。
• 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。
Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation
各种匀浆、研磨器
分级分离(Fractionation)
• 由低速到高速离心逐渐沉降细胞器。 • 先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的
转速将上清液中的小颗粒沉淀下来。 • 由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在
离心开始时均匀分布在整个离心管中，所 以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯 的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以 纯化。
即是叶绿体。 • 7、悬浮叶绿体：沉淀中加入制备液适量，用吸管吹打悬浮、混匀： • 8、镜检分离效果： • （不做）9、叶绿体被膜完整度的测定 ：铁氰化钾光还原的Hill反应
叶绿体的分离应该注意哪些问题？
• 1、选材 • 2、低温 • 3、缓冲系统：渗透压、PH、防氧化 • 4、研磨程度 分，可用细胞化学和生 化方法进行形态和功能鉴定。
实验用品
• 见指导。
一、叶绿体的分离
细胞中及匀浆中的叶绿体
叶绿体的分离步骤
• 1、采样、洗涤、去叶脉：最好在晴天上午10时左右选取生长正常的 菠菜叶子（菜心、白菜、豌豆也可）洗干净，用吸水纸擦干，去柄及 粗脉
• 2、预冷：放入4C冰箱预冷1h； • 3、研磨匀浆：称2克叶子在玻璃研钵中剪碎，先加1－2m1制备液，
• 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆， 在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其 过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步， 这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理 化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)
• 低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入 等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一 0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成 为各种细胞器及其包含物的匀浆。
快速磨成匀浆，然后再加8m1制备液，磨匀； • 4、过滤：把匀浆倒在6层沙布上过滤入小烧杯； • 5、离心去完整细胞、细胞核等：上述滤液转入10ml离心管，平衡后
在约500rpm（每分钟的转速）离心2分钟，上清转入另一离心管； • 6、离心收集叶绿体：上清液在2600rpm离心5分钟，弃上清液，沉淀