甲型乙型流感病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)sop

甲型乙型流感病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）操作规程

1 目的：规范操作流程，确保检测结果的准确性可靠性。

2 范围：甲型/乙型流感病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）

3 操作人：甲型/乙型流感病毒核酸检测人员对此规程负责

4 内容：

4.1 核对本次实验所有标本与申请单对应的编号，统计本次实验标本总数，确定所需实际量。实际检测数量为所需检测样本数量和阴阳对照品总和。

4.2 试剂准备：

4.2.1 进入试剂准备区，更换本区实验服和实验鞋，戴上手套、口罩。

4.2.2 打开照明灯，从冰箱中取出本次实验所需试剂。

4.2.3 打开超净工作台，在废液缸中加入新鲜配置的10%的次氯酸钠溶液。

4.2.4 取出本次实验所需耗材，如离心管、离心管架、吸头。将试剂盒中的核酸扩增反应液、酶混合液、检测液、阳性对照、空白对照、DNA提取液取出，置于离心管架上。待室温溶解后，瞬时离心，备用。

4.2.5 根据样本量计算需准备检测试剂人份数N（N=样本数+阳性对照+空白对照）。

4.2.6 按比例（核酸扩增反应液7.5μl/人份+酶混合液5μl/人份+甲型/乙型流感病毒反应液4μl/人份+去RNA酶水 3.5μl/人份）将各组分在离心管中混匀后瞬时离心，配置成PCR-mix，并按20μl/管依次分装到对应编号PCR八连管中。

4.2.7 将分装好的PCR-mix盖上PCR板盖，放到传递窗，收拾好试验台，将垃圾桶内的废弃物丢弃到医疗垃圾桶中并用10%的次氯酸钠溶液清洗干净，将移液器调回最大量程，换下本区工作服。

4.3 样本处理：

4.3.1 进入样本处理区，更换本区实验服和实验鞋，戴上手套、口罩。

4.3.2 开启生物安全柜照明灯，将样本、试剂、分装好的PCR-mix放入生物安全柜内，在废液缸中加入新鲜配置的10%的次氯酸钠溶液。

4.3.3 取200μl的待测样本、阳性对照、弱阳性对照和空白对照用病毒核酸提取试剂盒提取核酸。

本试剂盒的阳性对照、弱阳性对照、空白对照参与提取，用于对环境的监控和试剂的质控。

4.3.4 小心打开PCR八联管盖，每份待测样本核酸溶液、阳性对照、弱阳性对照和空白对照按照5μl/管依次加入对应编号的PCR八联管中，总体积为25μl/管。

4.3.7 盖紧PCR八联管盖，做好标记，低速短暂离心，置于反应管架上，放到去检测室的传递窗。

4.3.8 收拾好生物安全柜，将垃圾桶内的废弃物丢弃到医疗垃圾桶中并用10%的次氯酸钠溶液清洗干净，将移液器调回最大量程，换下本区工作服。

4.4 PCR扩增检测

4.4.1 进入样本处理区，更换本区实验服和实验鞋，戴上手套、口罩。

4.4.2 将反应管和管架带入核酸扩增区，按《ABI7500荧光定量PCR仪的使用维护标准操作程序》的相关程序操作。

4.4.3 循环参数设定

注：ABI7500实时荧光PCR仪不选 ROX 校正，淬灭基团选 None。

4.4.4 结果分析设置

反应结束自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（可以根据实际情况自行调整，Start值可以在3~15、End值可设在5~20，调整空白对照的扩增曲线平直或低于阀值线），点击Analysis自动获得分析结果，在Report 界面察看结果。

4.5 结果分析和判读

在仪器正常，空白对照、阳性对照均正常的情况下进行结果分析：FAM通道代表甲型，VIC通道代表乙型，ROX通道代表内标。

4.5.1 质量控制

4.5.1.1 空白对照：扩增阶段无典型 S型扩增曲线，结果分析为阴性。

4.5.1.2 阳性对照：阳性对照的FAM、VIC、ROX通道扩增阶段有典型S型扩增曲线且Ct≤30.0 。

4.5.1.3 弱阳性对照：弱阳性对照的FAM、VIC、ROX通道扩增阶段有典型S型扩增曲线且Ct≤33.0 。

4.5.1.4 以上要求需在同一实验中同时满足，否则本次实验无效。

4.5.2 结果判读

4.6.1 本试剂盒为体外检测试剂。操作人员应经过专业培训并具有一定经验。

4.6.2 为保证实验结果的准确性和可靠性请使用已校准的移液器，选用合格的一次性使用的PCR反应管、离心管、枪头等进行样本处理及配液等操作，所有用具应不含DNA酶和RNA酶。

4.6.3 实验严格分区操作；各区物品、工作服均为专用，不得交叉使用，避免污染，实验后立即清洁工作台。

4.6.4 本试剂盒使用前应在室温充分融化，混匀并瞬时低速离心。

4.6.5 样本处理应在生物安全柜中进行，以保护操作人员安全和防止对环境的污染。

4.6.6 待测样本尽可能新鲜，-70℃保存的核酸DNA，加样前应在室温充分融化、混匀并瞬时低速离心后使用。

4.6.7 每次实验应设置空白对照和阳性对照。不同批号的试剂请勿混用，在有效期内使用试剂盒。

4.6.8 分装有反应液的反应管应扣盖或装入密实袋内再转移至样本处理区。

4.6.9 加样时应使样品完全加入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。

4.6.10 反应液分装时尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，避免泄露污染。

4.6.11 扩增完毕取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。

4.6.12 实验中用过的枪头请直接打入盛有10%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同丢弃。

4.6.13 工作台及各种实验用物品经常用10%次氯酸钠、75%酒精和紫外灯进行消毒。

4.6.14 实时荧光 PCR 仪需定期校正和清洁载样板板孔。

4.6.15 本试剂盒涉及的待测样本应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》相关要求。