血清学反应
微生物常用实验
一、形态结构和培养特性观察１、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。
不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。
，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。
因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。
１）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。
在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。
半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。
（图３－８）图３－８细菌的培养特征1.点状2.圆形3.丝状4.不规则形5.假根状6.纺锤状7.扁平8.隆起9.凸起 10.垫状11.脐状 12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根状 23.假根状 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状36.蹼状 37.膜状２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。
液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。
霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。
霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。
血清学试验简介
血清学试验简介血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外肯定条件下作用，可消失肉眼可见的沉淀、凝集现象。
在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分别到的细菌，以最终确认检测结果。
血清学反应的一般特点：1)抗原体的结合具有特异性，当有共同抗原体存在时，会消失交叉反应。
2)抗原体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。
3)抗原体的结合是按肯定比例进行的，只有比例适当时，才能消失可见反应。
4)血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。
第一阶段为抗原体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不消失肉眼可见现象。
其次阶段为抗原体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。
反应速度慢，需几分、几非常以至更长时间。
而且，在其次阶段反应中，电解质、PH、温度等环境因素的变化，都直接影响血清学反应的结果。
习惯上将经典的血清学反应分三种类别：凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。
１、凝集反应颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参加下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应（Agglutination reaction）。
其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。
在该反应中，由于单位体积抗体量大，做定量试验时，应稀释抗体。
１）直接凝集反应颗粒性抗原与相应抗体直接结合所消失的反应，称为直接凝集反应(Direct agglution reaction)。
a.玻片凝集法。
是一种常规的定性试验方法。
原理是用已知抗体来检测未知抗原。
常用于鉴定菌种、血型。
如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后若消失肉眼可见的凝集块，即阳性反应，证明该菌是痢疾杆菌。
此法快速、简便，但不能进行定量测定。
b.试管凝集法。
是一种定量试验方法。
多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。
常用于帮助诊断某些传染病及进行流行病学调查。
如肥达氏反应就是诊断伤寒、付伤寒的试管凝集试验。
血清学反应
同种异型抗体
抗人免疫球蛋白
间接Coombs试验
双功能抗体
自身红细胞凝集试验（一）
双功能抗体抗 原交联物
自身红细胞凝集试验（二）
第三节 沉淀反应
一、液相沉淀反应 二、凝胶内沉淀反应
液相沉淀反应
1、絮状试验 2、环状试验 3、免疫浊度测定
液相内沉淀反应
絮状沉淀反应
环状沉淀反应
单向扩散试验
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T1 T2 T3
Mancini曲线
T1 T2 T3
Fahey曲线
Mancini曲线：K=C/d2 适用于大分子抗原，长时间扩散
Fahey曲线：K=logC/d 适用于小分子抗原，短时间扩散
单向扩散试验的适用对象
有特异性单价抗血清 有已知含量的标准品 待检标本抗原蛋白质含量大于1.25g
抗血清 抗原
+—
抗原 抗体
+
—
微量免疫沉淀测定
1、方法：免疫透射浊度测定法 免疫速率散射浊度测定法
2、原理：
散射光
入射光
透射光
检测器 检测器
凝胶内沉淀反应
1、扩散试验 2、免疫电泳技术
免疫扩散技术 单向扩散试验 双向扩散试验
免疫电泳技术 火箭电泳 对流电泳 免疫电泳
扩散试验
单向扩散试验 双向扩散试验
（ml）1
2
3
4
CH50示意
补体结合试验
1、补体结合试验原理 2、补体结合试验应用
补体结合试验原理
待检系统
补体
指示系统
补体结合试验原理（结果阳性）
补体消耗
待检系统
指示系统（不溶血）
补体结合试验原理（结果阴性）
实验二 淋转花环 血清学反应
结果判定
溶 血——阴性 不溶血——阳性
Ag
Ag Ag
Patient’s serum
No Ag
中和反应
1、病毒中和试验:在活细胞或活体内测定病毒被特异性抗体中
和而失去致病力的试验。中和抗体与病毒结合后，使病毒失去对敏 感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁殖
2、毒素中和试验
抗链球菌溶血素O试验(antistreptolysin O test)—抗O试验
大多数抗原pI=3~5，在碱性溶液中带负电荷，因 此抗原在电场中从负极向正极移动；抗体pI=5~7，解 离暴露的极性基团较少，负电荷没有抗原多，且抗体 属免疫球蛋白，分子量较大，泳动的速度较慢，电渗 力大，因此抗体由正极向负极移动。
对流免疫电泳
材料
琼脂板 1块/2人，打孔器 2个/组 抗AFP血清 —— 已知Ab AFP阳性血清 —— 阳性Ag 对照阴性血清 —— 阴性Ag 待检血清：标本1 —— 未知Ag
标本2 —— 未知Ag
对流免疫电泳
方法
阴性
标1
阳性
－
>1.5cm Ag Ab
பைடு நூலகம்
阴性 标2 阳性
Ag
＋ >1.5cm Ab
打孔 加样 电泳20min
对流免疫电泳
结果判定： 在相应抗原抗体孔之间出现白色沉淀线。
（二）凝集反应（agglutination reaction）
颗粒性抗原与相应抗体结合
（一）沉淀反应（precipitation reaction）
可溶性抗原与相应抗体结合
单向琼脂扩散 火箭电泳 双向琼脂扩散 对流免疫电泳
1 单向免疫扩散（single agar diffusion）
凝集法原理
凝集反应一种血清学反应。
颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电介质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。
参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。
可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。
（1）直接凝集反应颗粒状抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。
分为玻片法和试管法。
玻片法是一种定性试验方法。
可用已知抗体来检测未知抗原。
（若鉴定新分离的菌种时，可取已知抗体滴加在玻片上，将待检菌液一滴与其混匀。
数分种后，如出现肉眼可见的凝集现象，为阳性反应。
该法简便快速，除鉴定菌种外，尚可用于菌种分型、测定人类红细胞的ABO血型等。
）试管法是一种定量试验的经典方法。
可用已知抗原来检测受检血清中有无某抗体及抗体的含量。
用来协助临床诊断或供流行病学调查研究。
（操作时，将待检血清用生理盐水连续成倍稀释，然后加入等量抗原，最高稀释度仍有凝集现象者，为血清的效价，也称滴度，以表示血清中抗体的相对含量。
）诊断伤寒、副伤寒病的肥达氏反应、布氏病的瑞特氏反应均属定量凝集反应。
（2）间接凝集反应将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用。
在有电介质存在的适宜条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应。
用做载体的微球可用天然的微粒性物质，如人（O型）和动物（绵羊、家兔等）的红细胞、活性炭颗粒或硅酸铝颗粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯胶乳微球等。
由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上的抗原与微量抗体结合后，就足以出现肉眼可见的反应，敏感性比直接凝集反应高得多。
分为（1）乳胶凝集法：（2）固相凝集法：（3）明胶凝集法；（4）免疫凝集法；（5）胶乳凝集反应法血小板抗体检测试剂盒（固相凝集法）生产厂家：河北益生医药有限公司长春博德生物技术有限责任公司。
09第九章 诊断制剂(兽医生物制品学)
特异性检测：以新制菌素与标准菌素，对10匹健康马作点眼试验， 用量为2~3滴，5匹马左眼点标准菌素，右眼点新制菌素，另5匹马相反， 点眼后3、6、9、24h检查，全部试验马对两种菌素须均无反应。
阳性血清的 各种稀释度
1:10 1:25 1:50 1:75 1:100
1:10
0 0 10 20 40
抗原稀释度
1:50 1:100 1:150 1:200 1:300 1:400 1:500
补 体 结 合 反 应 结 果（溶 血，%）
0
0
0
0
10
20
40
0
0
0
0
10
30
60
0
0
0
10 20
40
60
第九章 诊断制剂
利用微生物、微生物提取物或动物血清等材料制成的，用于传染病、 寄生虫病血清学和变态反诊断应用的制品，称为诊断用生物制剂 (diagnosticum)，也称为诊断液。主要包括诊断抗原、诊断抗体(血清)和标 记抗体等三大类。
诊断生物制剂用于诊断的原理，是基于抗原和抗体能特异性结合这一 基本特性，故诊断中可以用已知抗原检测未知抗体，或用已知抗体检测未 知抗原。
(2)制造要点
将种子菌液接种肝汤琼脂培养基上37C培养2～7天,或液体通气培养36h，用 0.5%石炭酸生理盐水洗下培养物，70～80C水浴中加热灭菌lh，离心去上清， 菌体悬浮于0.5%石炭酸生理盐水，再离心沉淀洗一次。菌体悬浮于0.5%硫酸水 溶液中，121C加热30～40min，促使菌体水解。室温或冰箱放置12～24h，吸 取上清液，用NaOH液调整为pH6.8～7.0，再静置沉淀未水解部分。上清液用蔡 氏滤器过滤后75～80C加温热，凯氏法测定总氮量(用标准水解素作对照)，用灭 菌蒸馏水稀释滤液，使其最终总氮量为0.4～0.5mg/ml(或与标准的水解素相同)。
1.凝集实验报告
姓名：邹雨星学号：2015222816 班级：15检验3班第四组
实验题目：凝集实验
一、实验内容：直接凝集实验(玻片法)——血型鉴定
1.实验原理：
(一)血清学反应：体外进行的Ag-Ab反应，由于机体绝大部分抗体存在于血清中，故又叫血清学反应。
特点：(1)高度特异性；
(2)分子表面的可逆性结合；
(3)Ag、Ab比例合适才会出现肉眼可见的反应。
(二)凝集反应：颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应抗体在适当的电解质条件下凝集成肉眼可见的小块，称为凝集反应(agglutination)。
颗粒性Ag——凝集原；相应Ab——凝集素。
2.主要材料及实验步骤：
（1）材料：已知Ab:标准血清：抗A和抗B血清
待测Ag:RBC血型抗原
（2）步骤：(1)取血(无名指尖或耳垂)——NS试管——2-5%RBC悬液；
(2)准备一张载波片；
(3)加血清各1滴；
(4)加RBC悬液各1滴；
(5)牙签搅和并摇晃混匀；
(6)结果判断(10-15min后)
3.实验结果：
4.实验结论：本人为A型血
5.实验讨论：
二：实验内容：间接凝集实验——类风湿因子检测
1.实验原理：
2.主要材料及实验步骤：
（1）材料：已知Ag:致敏乳胶(乳胶颗粒上有变性IgG)、待测Ab:待检血清中的类风湿因子（2）步骤：A、取一乳胶凝集实验反应板
B、加阳性和阴性对照血清、待测血清各一滴；
C、各加一滴致敏乳胶；
D、牙签搅拌；
E、5分钟后观察结果；乳胶凝集如细沙状。
以黑背景观察为佳
3.实验结果：
4.实验结论：
5.实验讨论。
血清学反应-沉淀反应
二 凝胶内沉淀实验
（一）免疫琼脂实验(Immunodiffusion test）
原理：抗原抗体在电解质存在的条件下，再合适的比例 处形成白色沉淀线，并且一种抗原抗体系统形成一种沉淀 线，另一种形成另一种沉淀线，互相不影响。 优点：能将复合的抗原成分加以区分，根据沉淀线的数 目，位置，以及相邻两条沉淀线之间的融交分支等情况即 可了解该复合抗原的组成。并且可以将沉淀线用特殊染色 法（蛋白质、多糖、之类的鉴定染色），生物活性(酶活 性)和同位素标记法鉴定抗原的成分。 实验类型：
（3） 对流免疫电泳 对流免疫电泳是双向扩散与 电泳技术相结合的一种方法。在PH8~8.6的缓冲溶 8-21火箭免疫电泳 液中，蛋白质抗原带负电，向阳极移动。抗体虽然 也是蛋白质，但等电点比抗原高，所带阴离子少且 分子质量大，移动缓慢，同电渗反而向阴极移动。 实验时，将免疫血清置琼脂板正极孔内。通电后， 在电场作用下，抗原向正极移动，抗体向负极移动， 在最适比例处相遇时即形成白色沉淀。由于电场作 用，既限制了抗原抗体向多方向扩散，有加速了泳 动速度，缩短了时间。 优点：时间短，灵敏度高。 缺点：特异性不如双扩散高。如图8-20 8-20对流免疫电泳
抗原
抗体
单向单扩散
2.单向双扩散 用内径8mm的试管，现将含有阳 性血清的琼脂加于管底，高约6mm， 中间加一层同样浓度的琼脂，先凝固 后加待测0.25ml抗原，37°或室温扩 散数日。抗原抗体在中间琼脂层相向 扩散，在平衡点上形成沉淀线。
单向双扩散
3. 双向双扩散
试验在玻璃板或平皿上进行,用1.6％~2.0％琼脂加一定 浓度的等量抗体浇成凝胶板厚度为2~3mm在其上打孔直 径为2mm，孔内滴加抗原液。抗原在孔内向四周辐射扩 散，在与凝胶中的抗体接触形成白环。此环随扩散时间 而增大。因此可用已知浓度的抗原制成标准曲线，即可 用以测定抗原的量。 此法在兽医临床已用于传染病的诊断：如马立克氏病的 诊断。将马立克氏病高免血清制成血琼脂平板，拔取病 鸡新换的有髓质的羽毛数根，将毛根剪下，插于血琼脂 平板，阳性者毛囊中病毒向四周扩散，形成白色沉淀环。
血清学反应
四、中和实验
病毒或毒素与相应Ig以一定比例混合后， 经过一定时间，病毒丧失对易感动物的致 病性，或消除毒素在试管内的溶血现象， 谓之中和反应。
该试验既可在体外进行，也可在体内进行， 可利用小动物、鸡胚、活细胞等作试验。 操作如下：
五、免疫荧光法
荧光素：如异硫氰酸荧光素（FITC）、丽 丝胺罗丹明B（RB200）等受紫外线照射 后可发荧光（FITC 为绿色，RB200为玫 瑰红色）。
补体结合反应的概念
➢ 补体结合反应（简称补反CFT）： 是指在补体参加下，以绵羊红细
胞（Ag）和抗绵羊溶血素（Ig）作为 指示系统的抗原抗体反应。
补体结合反应的原理
补反包括两个系统五种成分：
• 一是被检系统（溶菌系）中的 已知Ag、待检Ig及仅供一组 Ag-Ig系统反应的定量补体。
• 二是指示系统（溶血系）中的 红细胞和溶血素。
• 参与凝集反应的Ag称凝集原，Ig称凝集素。
• 平板法和试管法
2、间接凝集反应
• 先将可溶性Ag或Ig吸附于一种与免疫无关 的有一定大小的颗粒载体表面制成固相Ag 或Ig，再与相应的待检Ig或Ag结合产生的 反应。 分为两类： 间接血球凝集反应（HA） 间接血球凝集抑制反（HI）
• 间接血球凝集反应（HA）• 间接血球凝集抑制反（HI）
补体的特点
1、补体是酶类物质，但均以无活性的前体形 式存在于血清中
2、动物血清中尤其以豚鼠血清含量最高，故 多用豚鼠的新鲜血清作为补体的来源
3、补体性质不稳定，易失活，经56度30分 处理即灭活
4、补体本身没有特异性能与任 何一组抗原抗体复合物相结 合，一但结合后不再游离。
5、补体不与单独的抗原或单独 的抗体相结合。
血清学反应
2
（一）特异性和交叉性
血清学反应具有高度特异性。抗原只能与 相应抗体结合，而不能与其他抗体相结合。
生物体的组成是复杂的，包含有多种抗原 成分，在进化过程中形成不同的种类，有各 不相同的特异性抗原，在亲缘种系中往往含 有部分相同的抗原成分，能引起交叉反应。
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3
（二）结合的可逆性
抗原抗体结合是分子表面结合，这一结合 受理化因素的影响，当温度超过60˚C或pH 降至3以下时，则抗原抗体复合物又重新离 群。离群后的抗原、抗体，其理化性质、免 疫活性保留。
20
二 琼脂扩散试验
琼脂是一种含有硫酸基的多糖，加热溶解于水， 冷却后凝固成凝胶，琼脂凝胶是一种多孔结构，其 孔径大小与琼脂含量有关，1%琼脂凝胶孔径为 85nm，能使许多可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。 当抗原与抗体在凝胶中的一定位置上相遇时，则两 者结合形成沉淀线。沉淀线的位置与抗原、抗体颗 粒的大小、浓度，沉淀线的数目和所含抗原组分有 关。琼脂扩散可分为单扩散（抗原或抗体中一种成 分扩散）和双扩散。
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第二节 沉淀试验
可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在 下，形成肉眼可见的絮状白色沉淀，称之为沉淀试 验（Precipitationreaction test）。
0.85%Na
可溶性抗原 +免疫血清Cl 出现沉淀现象 (血清蛋白、病毒) （抗体） 比例适合 沉淀原 沉淀素 比例不适合 不出现沉淀现象
吸附抗原的红细胞与抗体结合后，在补体存 在下可以引起溶血反应，这种反应称为间接溶 血反应。间接溶血反应只能用新鲜红细胞，而 新鲜红细胞不易保存，限制了本法的应用。
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2.溶菌试验
11.免疫学技术概论
第十一章免疫学技术概论免疫学技术是指利用免疫反应的特异性原理，建立各种检测与分析技术，以及建立这些技术的各种制备主意。
免疫学技术包括：①免疫血清学技术：用于检测抗原或抗体的体外免疫反应技术，或称免疫检测技术②细胞免疫技术：用于分析研究机体细胞免疫功能与状态的免疫学技术③免疫制备技术：用于建立免疫检测主意的技术第 1 节免疫血清学技术抗原与相应抗体在体内和体外均能发生特异性结合反应，因抗体主要来自血清，因此在体外举行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术。
一、免疫血清学反应的基本原理抗原与抗体的特异性结合，主要是基于抗原与抗体分子结构及立体构型的互补，以及由多种因素造成的两者在分子间引力参加下发生的可逆性免疫化学反应。
1.抗原抗体的结合力①库仑引力/静电引力：是抗原与抗体带有相反电荷的氨基与羧基之间互相吸引的力。
其大小与两个电荷间距离的平方呈反比。
②范德华引力：是原子与原子、分子与分子互相临近时分子极化作用产生的一种吸引力，引力大小与分子空间构象的互补性有关。
③氢键作用：是供氢体上的氢原子和受氢体原子间的引力。
④疏水作用：在水溶液中两个疏水基团互相接触，因为对水分子的排斥而趋向聚拢的力。
疏水作使劲在抗原抗体结合力中作用最强。
2.抗原抗体的亲和力与亲合力①亲和力(affinity)：指抗体的抗原结合位点与相应的抗原决定簇之间的结合强度，它是抗原抗体间固有的结合力。
亲和力可用平衡常数K表示：K＝K1/K2 （K1为结合常数，K2为解离常数）②亲合力(avidity)：指一个抗体分子与囫囵抗原表位之间结合的强度，与抗体结第 1 页/共7 页合价直接相关。
亲合力表现为多价优势。
3.抗原抗体的胶体特性及亲水性转化为疏水性①胶体特性：抗体和大多数抗原同属蛋白质，在通常的反应条件下均带有负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体。
②亲水性改变：抗原抗体结合使表面电荷减少，水化层变薄，失去亲水性能，抗原抗体复合物由亲水胶体转化为疏水胶体。
血清学试验
体外的抗原抗体反应常称为血清学反应或血清学试验。
一、血清学鉴定血清学鉴定即采用含有已知特异性抗体的免疫血清（诊断血清）与分离培养出的未知纯种细菌或标本中的抗原进行血清学反应，以确定病原菌的种或型。
血清学鉴定常用的血清学试验是凝集试验、沉淀试验（毛细管法）、荚膜肿胀试验和毒素-抗毒素中和试验等。
二、血清学诊断血清学诊断是指用已知抗原或已知抗体检测患者血清中相应抗体的方法，以诊断感染性疾病。
抗体效价必须明显高于正常人群的水平或随病程递增才有诊断价值。
多数血清学诊断需取患者急性期和恢复期双份血清标本，若后者的抗体效价比前者升高4倍或4倍以上才有诊断意义。
在患者血清中检出病原微生物的抗原有诊断意义。
血清学诊断常用的血清学试验是凝集试验（直接凝集试验和间接凝集试验）、酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术和放射免疫测定法。
血清学试验
凝集滴度，即一个凝集单位。如表18-1-1的病毒血凝滴度为27， 即将病毒原液作27倍稀释，其中含一个血凝单位的病毒。 ❖ 由于病毒血凝抑制试验中需要的病毒液应含4个血凝单位，因此， 需要对原病毒液进行25倍稀释。
补体结合试验
试验系统、原理和结果判定
反应系统
指示系统
反应结果的判定
已知抗原 （抗体）
补体
绵羊红 细胞
如溶血则 为阴性
待检血清 （抗原）
溶血素
如不溶血 则为阳性
中和试验
概念：根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫
学试验。
原理：病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易感
动物、鸡胚或细胞活性。
举例
一种抗原成分出现一条沉淀
带。如两个相邻孔之间抗原
相同，则沉淀带融合，如1、
2；抗原不同，则互相交叉，
如3；部分相同则部分融合，
另外不同部分则交叉，如4。
免疫电泳
免疫电泳技术是把凝胶扩散 试验与电泳技术相结合的免 疫检测技术。即将琼脂扩散 置于直流电场中进行，让电 流来加速抗原与抗体的扩散 并规定其扩散方向，在比例 合适处形成可见的沉淀带。
抗 补 体 抗 体
抗补体法
酶标抗体技术
原理：将酶分子标记在抗体或抗原分子上， 利用抗原抗体反应的特异性及酶的高催化活 性进行检测。
用于标记的酶：辣根过氧化物酶 （HRP）、碱 性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。
酶标抗体技术分类
免疫酶组织化学染色技术 酶联免疫吸附试验 斑点-酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验
用已知测未知
中和试验
第五节中和试验抗原与相应抗体在体内和体外均能发生特异性结合，因抗体主要来自血清，因此在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术。
第一节概述免疫血清学技术按抗原抗体反应性质不同可分为：1. 凝聚性反应包括凝集试验和沉淀试验。
2. 标记抗体技术包括荧光抗体、酶标抗体、放射性标记抗体、发光标记抗体技术等。
3. 补体参与的反应补体结合试验、免疫黏附试验等。
4. 中和反应病毒中和试验、毒素中和试验。
一、血清学反应的一般特点1. 特异性与交叉性血清学反应具有高度特异性，如抗猪瘟病毒的抗体只能与猪瘟病毒结合，而不能与口蹄疫病毒结合。
这是血清学试验用于分析各种抗原和进行疾病诊断的基础。
但若两种天然抗原之间含有部分共同抗原时，则发生交叉反应。
交叉反应是区分血清型和亚型的重要依据。
2. 抗原抗体结合机理抗原和抗体的结合为弱能非共价键结合，其结合力决定于抗原决定簇和抗体的抗原结合点之间形成的非共价键的数量、性质和距离。
常规的血清学反应，如凝集反应、沉淀反应、补体结合反应等，只有在抗原与抗体呈适当比例时，结合反应才出现凝集，沉淀等可见反应，在最适比例时，反应最明显。
这种因抗原过多或抗体过多而出现抑制可见反应的现象，称为带现象。
二、血清学反应的影响因素1.电解质特异性的抗原和抗体具有对应的极性基(羧基、氨基等)，它们互相吸附后，其电荷和极性被中和因而失去亲水性，变为憎水系统。
易受电解质作用失去电荷而互相凝聚、发生凝集或沉淀反应。
2.温度较高的温度可以增加抗原和抗体接触的机会，从而加速反应的出现。
常用37℃水浴保温。
3.酸碱度血清学反应常用pH为6-8，过高或过低的pH可使抗原抗体复合物重新离解。
第二节凝聚性试验抗原与相应抗体结合形成复合物，在有电解质存在下，复合物相互凝聚形成肉眼可见的凝聚小块或沉淀物，根据此现象来测定相应抗体或抗原，称为凝聚性试验。
分为凝集试验和沉淀试验。
一、凝集试验细菌、红细胞等颗粒性抗原，与相应抗体结合，在有适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验。
血清学反应的条件
血清学反应的条件
哎呀，我是一名小学生，对于“血清学反应的条件”这个题目，我感觉好难呀！这听起来就像是大人们在实验室里研究的超级复杂的东西。
血清学反应，这到底是啥呢？我去问了我的科学老师，老师说血清学反应就像是身体里的小侦探在工作。
那它工作得好不好，就得看一些条件啦。
比如说温度，就好像我们在冬天和夏天穿不同的衣服一样。
血清学反应也有它适合的温度。
温度太高，那些小侦探会不会热得跑不动啦？温度太低，它们是不是又会被冻得缩手缩脚？
还有酸碱度，这就像我们吃的食物，有的太酸，有的太碱，都会让我们的嘴巴感觉不舒服。
血清学反应也是这样，如果环境的酸碱度不合适，反应是不是就没办法顺利进行啦？
时间也很重要哟！你想想，如果考试的时间太短，我们都来不及做完题目。
血清学反应也有它需要的时间，如果时间不够，是不是就不能得出准确的结果呢？
还有试剂的纯度，这就好比我们做手工用的材料，如果材料质量不好，做出来的东西能好看吗？血清学反应的试剂纯度不够，反应能准确吗？
血清学反应的条件这么多，这么复杂，研究人员得多辛苦才能搞清楚呀！他们就像勇敢的探险家，在这个神秘的领域里不断摸索前进。
我觉得血清学反应的条件就像是一个复杂的密码锁，只有把每个条件都调到正确的位置，才能打开这扇通往科学真相的大门。
这可真是不容易，但也正因为不容易，才让科学家们的努力变得更加伟大和有意义！。
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（四）反应的阶段性
抗原与抗体进行结合，可分为两个阶段：
第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段，
反应快，几秒钟至几分钟即完成，但无可见
反应；
第二阶段为抗原与抗体的反应可见阶段，表
现为凝集、沉淀、补体结合等，反应进行较
慢，需几分钟或更久。第二阶段受电解质、
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第二节 沉淀试验
可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在 下，形成肉眼可见的絮状白色沉淀，称之为沉淀试 验（Precipitationreaction test）。
0.85%Na
可溶性抗原 +免疫血清Cl 出现沉淀现象 (血清蛋白、病毒) （抗体） 比例适合 沉淀原 沉淀素 比例不适合 不出现沉淀现象
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一 液相沉淀试验
1．环状沉淀试验 原理：试管内，下层沉淀素与上层 沉淀原在液界面应形成白色沉淀环。 用途：检测皮毛中的炭疽
杆菌抗原（Ascoli试验） 2．絮状沉淀试验
抗原与抗体在试管内混合，在电解质的存在下抗 原抗体复合物可形成絮状凝聚物。此法多用于毒 素和抗毒素测定。
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二 琼脂扩散试验
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关。琼脂扩散可分为单扩散（抗原或抗体中一种成
分扩散）和双扩散。
根据其扩散的方向可分为单向单扩、单向双扩、
双向单扩、双向双扩，其中双向双扩应用最广。
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1 ．单向单扩散
将 0.6%-1% 琼 脂 加 热 熔 化 后 ， 加 入 定 量 经 预热的稀释抗血清，混合均匀后，加入小试 管中，待凝固后加入0.5ml抗原于其上，直立 ，置于37˚C中，2-3h后出现沉淀线。由于抗 原的扩散，使沉淀线不断向下推移，而最初 形成的沉淀带随抗原的扩散而向下推移，最 后稳定。沉淀带距抗原愈近，其浓度愈大， 可作抗原浓度测定。
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（一）抗原与抗体的快速检测
在诊断传染病、寄生虫病、变态反应、肿 瘤、自身免疫疾病时，均已广泛应用血清学 方法检查抗体或抗原（细菌、病毒）的存在， 作为诊断疾病的手段。现已应用的间接血凝 技术、对流电泳、标记抗体技术，均能快速、 简便的确诊抗原或抗体。
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（二）生物活性物质的超微定量
应用酶联免疫吸附实验、放射免疫等技术 ，抗原抗体检测的敏感度均大为提高，已达 到能精确测出Pg的水平，其敏感度已大大超 过了常规的化学分析。此类技术已应用于测 定动物体内的激素、维生素、药物及其他病 理过程中的微量产物。
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3.酸碱度
血清学反应通常用pH6～8，过酸或过碱都 可使复合物离群，pH值在等电点时，可引 起非特异凝集。
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二 血清学反应的类型
沉淀、凝集、琼脂扩散、中和、补体 结合和免疫吸附试验等。
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三 血清学反应的应用方式和目的
抗原抗体反应是特异性的，在应用时必须 有一个是已知的，通过反应来鉴定另一个未 知的。例如鉴定某一病原微生物时，多用已 知抗体。诊断传染病时，对慢性病可用已知 的抗原检测未知的特异性抗体；诊断急性病 则用已知的抗体检测未知的抗原（病原）， 如炭疽病等。
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（四）微生物的鉴定与分析
应用交叉凝集实验、凝集吸收实验、 沉淀实验等血清学实验，进行微生物的 鉴定及区别微生物的血清型，从而确定 微生物的类型及其亲缘关系。还可应用 琼脂扩散实验、免疫电泳等技术，对微 生物的抗原组分进行分析。
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（五）血型鉴定
用细胞直接凝集实验、血凝抑制实验、 溶血实验等技术，可作血型鉴定、亲子 关系的确定、新生儿和出生幼畜溶血病 的诊断。
温度、pH值等影响。两个阶段在反应进行中
无严格界限。
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（五）影响反应的因素
1.电解质 血清学反应须在适当浓度的电解质参与下
，才出现可见反应。在凝集、沉淀反应操作 时，一般用生理盐水或8%—10%高渗盐水 作稀释，才出现较强反应。
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2.温度
温度升高，可增加抗原与抗体分子运动而碰 撞接触，加速反应的出现，故通常将抗原抗体 混合后，放置37˚C温箱或水浴箱中，保持一定 时间，促进反应。温度高，加速反应；温度低， 反应时间延长，但反应结合充分，故在补体结 合反应、免疫吸附实验中，采用低温放置过夜。
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（三）最适比与带现象
抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现可见 反应。比例最适合，出现反应最快，反应产物 愈多。
如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的 聚合一开始时即达到饱和，形成小的复合物则 不能继续与相邻抗原、抗体结合，不出现可见 反应，谓之区带现象或带现象。为了避免血清 学反应的带现象，需要将抗原或抗体作适当的 稀释。
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（三）抗原或抗体在细胞与亚细胞水平的定 位
用荧光抗体、酶标抗体技术，可以检测病毒或细 菌在动物各种组织细胞中的分布。应用免疫酶组 化法及铁蛋白标记技术进行免疫电镜观察，可以 测定病毒在亚细胞水平的定位，也可测定淋巴细 胞表面免疫球蛋白及抗体的产生情况。据此可分 析传染病发生的机制及对免疫机理的探讨。
琼脂是一种含有硫酸基的多糖，加热溶解于水，
冷却后凝固成凝胶，琼脂凝胶是一种多孔结构，其
孔径大小与琼脂含量有关，1%琼脂凝胶孔径为
85nm，能使许多可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。
当抗原与抗体在凝胶中的一定位置上相遇时，则两
者结合形成沉淀线。沉淀线的位置与抗原、抗体颗
粒的大小、浓度，沉淀线的数目和所含抗原组分有
血清学反应具有高度特异性。抗原只能与 相应抗体结合，而不能与其他抗体相结合。
生物体的组成是复杂的，包含有多种抗原 成分，在进化过程中形成不同的种类，有各 不相同的特异性抗原，在亲缘种系中往往含 有部分相同的抗原成分，能引起交叉反应。
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（二）结合的可逆性
抗原抗体结合是分子表面结合，这一结合 受理化因素的影响，当温度超过60˚C或pH 降至3以下时，则抗原抗体复合物又重新离 群。离群后的抗原、抗体，其理化性质、免 疫活性保留。
第九章 血清学反应
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第一节 概 述
一 血清学反应的概念及一般特点
抗原及相应抗体在体内或体外均能发生特
异性结合，在体外结合能发生可见免疫反应。
由于抗体主要存在于血清中，故称为血清学反
应。
血清学反应根据抗原性质、反应条件、参与
反应物质，则表现出反应有多种多样。其反应
的一般特点是：
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（一）特异性和交叉性