Western-blot实验方法步骤(精编课件).ppt
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疑难杂证
• 分别用多大电流转膜? 一、一般跟你的分离胶的浓度有关。 二、与你的转印系统型号有关. 三、与目的蛋白的分子量有关. 一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h；
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疑难杂证
• WESTERN为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多 条带，而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗,请 指教 .做WESTERN必须要内参吗？
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疑难杂证
• western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还 是NC膜，能介绍一下膜的选择吗？
PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白 印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。
NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差 一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白 吸附容量高，亲水性较好。
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疑难杂证
• 做western每次只加一种一抗，请教有人同时加两种或者 多种一抗的吗？ 最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非 特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上 检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗， ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、 二抗，ECL显色、压片、洗片。 曾经做过Western在同一张膜上检测两种蛋白。因为这 两种目的蛋白的分子量相差较远，转完膜后，一边给 Marker染色，一边封闭。在上一抗之前，根据Marker的 条带把膜水平剪开，分子量小的目的蛋白在下面半张，大 的在上面半张。然后分别上一抗、二抗，检测。
Western-blot 试验
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概论
• 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏 感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无 需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件 下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来 蛋白的共沉淀等诸多问题。
• 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆 抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转 移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白 质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。
沫。 • 检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的
SDS－PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋 白。 • 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可 被检测。 • 未知蛋白应同时作阳性对照。
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主要试剂
• RIPA（华舜公司） • 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） • 丙烯酰胺（Amresco公司） • 双丙烯酰胺（Amresco公司） • 丽春红染料（华舜公司） • Tween 20（Amresco公司） • 过硫酸铵（Sigma公司） • 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） • 硝酸纤维素膜（Amersham公司） • 考马斯亮兰（Fluka公司） • 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） • Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling
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实验步骤
• 一抗杂交孵育 将一抗用含5%脱脂奶粉的 1×TBST溶液稀释，使抗体浓度为1:1000；将封 闭过的膜放在一抗稀释液中，4度过夜；而后吸 弃一抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。 二抗孵育
• 二抗杂交孵育：将辣根过氧化物酶连接的二抗 用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释，使浓度 为1:2000，并加入辣根过氧化物酶连接的抗生 物素抗体（浓度为1:1000），将膜置于二抗稀 释液中，室温振荡孵育1h；而后吸弃二抗稀释 液，用1×TBST洗3次，每次5min。
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实验步骤
• 显影：将膜置入10ml LumiGLO溶液中 （10ml LumiGLO溶液配方为：0.5ml 20×LumiGLO、0.5ml 20×Peroxide、 9.0ml Milli-Q water），室温轻摇1分钟， 注意避光操作；在暗室中剪下与膜同样大 小的胶片，压在暗盒中，约1min；将胶片 放在显影液中洗1-5min；水冲洗；定影液 中洗2-5min；水冲洗，可在相应位置见到 目的条带。
称取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml
• 转膜缓冲液
称取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml，临用前加200ml甲醇
10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml。
• 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学 的研究。
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溶解蛋白策略
• 1 使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这 可能导致免疫反应性的丢失。
• 2 采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造 成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。
• 机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞 表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力， 变性蛋白比天然蛋白更容易降解。
• 考马斯亮兰染液：
45ml 甲醇
45ml 水
用Whatman滤纸过滤，去除颗粒状物质
10ml 冰乙酸
0.25克 考马斯亮兰R250
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抗体选择
• 一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象（例 如变性构象或天然构象）。并非所有的单克隆抗体都适合 作为探针用于WETERN-BLOT，因为这一实验中靶蛋白是 彻底变性的。
Technology公司）
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仪器与设备
• 低温超速离心机（Eppendorf公司） • 分光光度计（Eppendorf公司） • Thermomixer（Eppendorf公司） • 电泳仪（Bio-Rad 公司） • 垂直式电泳槽（Bio-Rad 公司） • 硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad 公司）
都可以用丽春红染色。 具体使用还要参考相关文献
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疑难杂证
• 做western，在分子量很低的位置总是出现一条 很强的带（通常比我要的带强），不知道为什么？ 是蛋白降解了吗？
有降解的可能，但如果用的是多抗出现非特异也 是可能的，关键是你要的位置出现了吗？
减少非特异可以延长封闭时间，对付降解要视 具体情况了。
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配制试剂
• 4×SDS Sample Buffer
2.4克 Tris HCL，溶解在30ml水中，调pH6.8
8克SDS
0.4克溴酚兰
定容至100ml
40ml甘油
10ml DTT贮存液
• 1mol/L DTT贮存液：0.01mol/L 乙酸钠 20ml 3.09克DTT过滤除菌后20℃保存，分装成1ml。
• 超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。 • 4度，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上
层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 • 有必要时重复上一步骤。 • 上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可将上
清转入另一Eppendorf -80°C保存
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注意事项
• 细胞裂解液的量 • 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡
• 往往可以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调 整提取的条件。
• 为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血清 或多种单克隆抗体的混合物，因为他们可与某一蛋白的多 种形式起反应。
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溶解方法
• 溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质： • 1 表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓
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实验步骤
• 转膜 小心取下凝胶，把预先在转膜缓冲液中平 衡过的Whatman滤纸及硝酸纤维素膜切成与凝 胶同样大小，按次序叠放在一起，在4度100V 电压转膜1H,取出硝酸纤维素膜，右上角切去以 作标记，丽春红染色，可见多条粉红色条带， 再用TBST漂洗至膜发白。
• 封闭 称取脱脂奶粉1克，用1×TBS溶解到20ml， 使脱脂奶粉浓度为5％。将硝酸膜浸在20ml封 闭液中，室温摇2h后。
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疑难杂证
• 请问分子量为41KD和57KD作WESTERN时,可以分 开切胶吗?分别用多大电流转膜?转多长时间?
理论上分的开！蛋白Marker分子量分别为97kd 66kd、45kd、30kd、21kd、14kd ！跑蛋白时， 分离的效果都比较好！分子量为41KD和57KD的蛋 白分子量相差16KD！蛋白Marker的45kd、30kd， 蛋白分子量相差15KD，分离效果很明显。应该可 以分开切胶！
• 选用抗变性蛋白的高滴度多克隆抗血清或单克隆抗体混合 物为佳。
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实验步骤
• 配胶 • 制胶 先用1ml枪头小心铺10%分离胶，上加少
许异丙醇，待分离胶干凝后，倒去异丙醇，用 水洗去多余未聚合的胶，滤纸吸干。再铺4%积 层胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶 干后备用，拔去梳子。 • 上样，所有上样孔均加样，没有样本，用上样 缓冲液代替。 • 100V，溴酚兰走到分离胶底部后，1.5h后电泳 结束。
• 多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物， 通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知。因而不可 能预言用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白 上的不同抗原表位的效果。
• 设置对照： 1不与靶蛋白反应的抗体（即免疫前血清或非相关单克隆抗 体） 2 样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的 制品
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疑难杂证
• 没有注明可以用来做western blot的一抗， 可以用来做western blot吗？
不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有 的是识别构象型表位的，识别构象型表位 的抗体不能用于western blotting，因为在 western blotting中抗体识别的是完全变性 的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表 位变性时被破坏。
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配制试剂
• 30％Acry-Bis 29克丙烯酰胺＋1克双丙烯酰胺，加ddH2O 100ml配成，避光4℃保存
• 10％过硫酸胺，新鲜配制，<1week 0.1克过硫酸胺加ddH2O 1ml配成，4℃保存
• 封闭试剂 10×TBS （应用液：1×TBS） 10×TBS：取24.2克Tris－Base 80克氯化钠 用 800mlddH2O溶解后，用HCl调PH至7.6，定 容至1000ml 1×TBS：取10×TBS 50ml，稀释至500ml，临用 前加0.1％Tween 20，500ul。
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配制试剂
• 10×电泳Buffer
称取Tris-base 30.3克
glycine
144克 加去离子水，定容至1000ml
SDS
10克
• 1.5M Tris.HCl PH 8.8
称取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至8.8，定容100ml
• 0.5M Tris.HCl PH6.8
疑难杂证
• western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？购买一抗时 发现单抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA) 要便宜不少,用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什 么不同的要求？ 作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但 单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。 用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于 western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于 ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特 异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书 来确定。 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选 抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一 个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。
1、一抗、或二抗抗体浓度太高 2、多克隆抗体本身的非特异性反应 3、抗体的特异性不强 4、目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀 一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白 的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化. 所以严格意义上说,内参是必须做的。
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冲液裂解。 • 2 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后
制备提取液。 • 3 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于
SDS凝胶加样缓冲液。 • 4 哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗
原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲 液裂解。
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细胞准备
• 用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮 子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变 得很粘稠。吸入1.5ml离心管。
疑难杂证
• 分别用多大电流转膜? 一、一般跟你的分离胶的浓度有关。 二、与你的转印系统型号有关. 三、与目的蛋白的分子量有关. 一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h；
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• WESTERN为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多 条带，而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗,请 指教 .做WESTERN必须要内参吗？
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疑难杂证
• western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还 是NC膜，能介绍一下膜的选择吗？
PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白 印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。
NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差 一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白 吸附容量高，亲水性较好。
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疑难杂证
• 做western每次只加一种一抗，请教有人同时加两种或者 多种一抗的吗？ 最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非 特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上 检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗， ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、 二抗，ECL显色、压片、洗片。 曾经做过Western在同一张膜上检测两种蛋白。因为这 两种目的蛋白的分子量相差较远，转完膜后，一边给 Marker染色，一边封闭。在上一抗之前，根据Marker的 条带把膜水平剪开，分子量小的目的蛋白在下面半张，大 的在上面半张。然后分别上一抗、二抗，检测。
Western-blot 试验
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概论
• 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏 感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无 需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件 下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来 蛋白的共沉淀等诸多问题。
• 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆 抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转 移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白 质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。
沫。 • 检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的
SDS－PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋 白。 • 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可 被检测。 • 未知蛋白应同时作阳性对照。
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主要试剂
• RIPA（华舜公司） • 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） • 丙烯酰胺（Amresco公司） • 双丙烯酰胺（Amresco公司） • 丽春红染料（华舜公司） • Tween 20（Amresco公司） • 过硫酸铵（Sigma公司） • 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） • 硝酸纤维素膜（Amersham公司） • 考马斯亮兰（Fluka公司） • 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） • Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling
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实验步骤
• 一抗杂交孵育 将一抗用含5%脱脂奶粉的 1×TBST溶液稀释，使抗体浓度为1:1000；将封 闭过的膜放在一抗稀释液中，4度过夜；而后吸 弃一抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。 二抗孵育
• 二抗杂交孵育：将辣根过氧化物酶连接的二抗 用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释，使浓度 为1:2000，并加入辣根过氧化物酶连接的抗生 物素抗体（浓度为1:1000），将膜置于二抗稀 释液中，室温振荡孵育1h；而后吸弃二抗稀释 液，用1×TBST洗3次，每次5min。
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实验步骤
• 显影：将膜置入10ml LumiGLO溶液中 （10ml LumiGLO溶液配方为：0.5ml 20×LumiGLO、0.5ml 20×Peroxide、 9.0ml Milli-Q water），室温轻摇1分钟， 注意避光操作；在暗室中剪下与膜同样大 小的胶片，压在暗盒中，约1min；将胶片 放在显影液中洗1-5min；水冲洗；定影液 中洗2-5min；水冲洗，可在相应位置见到 目的条带。
称取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml
• 转膜缓冲液
称取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml，临用前加200ml甲醇
10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml。
• 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学 的研究。
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溶解蛋白策略
• 1 使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这 可能导致免疫反应性的丢失。
• 2 采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造 成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。
• 机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞 表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力， 变性蛋白比天然蛋白更容易降解。
• 考马斯亮兰染液：
45ml 甲醇
45ml 水
用Whatman滤纸过滤，去除颗粒状物质
10ml 冰乙酸
0.25克 考马斯亮兰R250
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抗体选择
• 一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象（例 如变性构象或天然构象）。并非所有的单克隆抗体都适合 作为探针用于WETERN-BLOT，因为这一实验中靶蛋白是 彻底变性的。
Technology公司）
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• 低温超速离心机（Eppendorf公司） • 分光光度计（Eppendorf公司） • Thermomixer（Eppendorf公司） • 电泳仪（Bio-Rad 公司） • 垂直式电泳槽（Bio-Rad 公司） • 硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad 公司）
都可以用丽春红染色。 具体使用还要参考相关文献
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• 做western，在分子量很低的位置总是出现一条 很强的带（通常比我要的带强），不知道为什么？ 是蛋白降解了吗？
有降解的可能，但如果用的是多抗出现非特异也 是可能的，关键是你要的位置出现了吗？
减少非特异可以延长封闭时间，对付降解要视 具体情况了。
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配制试剂
• 4×SDS Sample Buffer
2.4克 Tris HCL，溶解在30ml水中，调pH6.8
8克SDS
0.4克溴酚兰
定容至100ml
40ml甘油
10ml DTT贮存液
• 1mol/L DTT贮存液：0.01mol/L 乙酸钠 20ml 3.09克DTT过滤除菌后20℃保存，分装成1ml。
• 超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。 • 4度，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上
层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 • 有必要时重复上一步骤。 • 上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可将上
清转入另一Eppendorf -80°C保存
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注意事项
• 细胞裂解液的量 • 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡
• 往往可以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调 整提取的条件。
• 为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血清 或多种单克隆抗体的混合物，因为他们可与某一蛋白的多 种形式起反应。
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溶解方法
• 溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质： • 1 表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓
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实验步骤
• 转膜 小心取下凝胶，把预先在转膜缓冲液中平 衡过的Whatman滤纸及硝酸纤维素膜切成与凝 胶同样大小，按次序叠放在一起，在4度100V 电压转膜1H,取出硝酸纤维素膜，右上角切去以 作标记，丽春红染色，可见多条粉红色条带， 再用TBST漂洗至膜发白。
• 封闭 称取脱脂奶粉1克，用1×TBS溶解到20ml， 使脱脂奶粉浓度为5％。将硝酸膜浸在20ml封 闭液中，室温摇2h后。
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• 请问分子量为41KD和57KD作WESTERN时,可以分 开切胶吗?分别用多大电流转膜?转多长时间?
理论上分的开！蛋白Marker分子量分别为97kd 66kd、45kd、30kd、21kd、14kd ！跑蛋白时， 分离的效果都比较好！分子量为41KD和57KD的蛋 白分子量相差16KD！蛋白Marker的45kd、30kd， 蛋白分子量相差15KD，分离效果很明显。应该可 以分开切胶！
• 选用抗变性蛋白的高滴度多克隆抗血清或单克隆抗体混合 物为佳。
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实验步骤
• 配胶 • 制胶 先用1ml枪头小心铺10%分离胶，上加少
许异丙醇，待分离胶干凝后，倒去异丙醇，用 水洗去多余未聚合的胶，滤纸吸干。再铺4%积 层胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶 干后备用，拔去梳子。 • 上样，所有上样孔均加样，没有样本，用上样 缓冲液代替。 • 100V，溴酚兰走到分离胶底部后，1.5h后电泳 结束。
• 多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物， 通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知。因而不可 能预言用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白 上的不同抗原表位的效果。
• 设置对照： 1不与靶蛋白反应的抗体（即免疫前血清或非相关单克隆抗 体） 2 样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的 制品
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• 没有注明可以用来做western blot的一抗， 可以用来做western blot吗？
不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有 的是识别构象型表位的，识别构象型表位 的抗体不能用于western blotting，因为在 western blotting中抗体识别的是完全变性 的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表 位变性时被破坏。
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配制试剂
• 30％Acry-Bis 29克丙烯酰胺＋1克双丙烯酰胺，加ddH2O 100ml配成，避光4℃保存
• 10％过硫酸胺，新鲜配制，<1week 0.1克过硫酸胺加ddH2O 1ml配成，4℃保存
• 封闭试剂 10×TBS （应用液：1×TBS） 10×TBS：取24.2克Tris－Base 80克氯化钠 用 800mlddH2O溶解后，用HCl调PH至7.6，定 容至1000ml 1×TBS：取10×TBS 50ml，稀释至500ml，临用 前加0.1％Tween 20，500ul。
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• 10×电泳Buffer
称取Tris-base 30.3克
glycine
144克 加去离子水，定容至1000ml
SDS
10克
• 1.5M Tris.HCl PH 8.8
称取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至8.8，定容100ml
• 0.5M Tris.HCl PH6.8
疑难杂证
• western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？购买一抗时 发现单抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA) 要便宜不少,用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什 么不同的要求？ 作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但 单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。 用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于 western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于 ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特 异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书 来确定。 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选 抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一 个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。
1、一抗、或二抗抗体浓度太高 2、多克隆抗体本身的非特异性反应 3、抗体的特异性不强 4、目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀 一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白 的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化. 所以严格意义上说,内参是必须做的。
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冲液裂解。 • 2 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后
制备提取液。 • 3 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于
SDS凝胶加样缓冲液。 • 4 哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗
原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲 液裂解。
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细胞准备
• 用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮 子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变 得很粘稠。吸入1.5ml离心管。