抗菌药物敏感试验细菌耐药性检测讲义
合集下载
第章细菌药敏试验及其耐药表型检测
第章细菌药敏试验及其耐药表型检测细菌药敏试验是临床细菌感染治疗中非常重要的检测手段，通过该技术可以检测不同抗生素对细菌的敏感性，进而为合理使用抗生素提供科学的依据。
然而，在临床应用过程中，随着抗生素不合理使用的增加，细菌耐药性也随之快速发展。
因此，针对不同耐药表型的检测越来越受到关注。
一、细菌药敏试验细菌药敏试验是一种用于判断细菌对不同抗生素敏感性的方法。
常见的细菌药敏试验方法包括纸片扩散法、E测试、革兰氏染色法、微量稀释法等。
其中纸片扩散法是最常用的一种方法，其原理是将待检细菌涂在琼脂平板上，然后在板上放置一些含有不同抗菌药物的试纸，细菌耐药性差的部分会被试纸上的抗生素杀灭，出现纯净孔（抑菌圈），通过抑菌圈的直径可以初步判断细菌对抗生素的敏感性或耐药性。
细菌药敏试验有很多应用价值，如能够帮助医生选择合适的抗生素治疗细菌感染，避免了不必要的抗生素使用，同时也可作为科研人员研究细菌抗药机制的工具，为抗菌药物的开发提供依据。
二、耐药表型检测随着细菌抗药性问题的不断加重，对不同耐药表型检测的需求也越来越迫切。
耐药表型是指细菌对特定抗生素的耐药情况。
由于不同的细菌及其不同的菌株对抗生素的敏感程度有所不同，因此抗菌药物在应用过程中会出现不同菌株对不同药物的耐药表型。
目前，针对不同耐药表型检测的方法主要有两种：基于分子生物学技术的方法和基于药敏试验的方法。
1. 基于分子生物学技术的方法基于分子生物学技术的方法是检测细菌耐药性最常用的方法之一。
该方法通过检测细菌中特定的基因或者基因片段，以此确定细菌耐药性的表型。
常见的基于分子生物学技术的方法包括PCR检测、基因芯片技术、实时荧光定量PCR等。
2. 基于药敏试验的方法基于药敏试验的方法是已经成熟的检测方法之一，其通过将药敏试验的结果与临床药物疗效相结合，进而确定细菌耐药性表型。
通过检测不同抗生素对不同菌株的敏感性，可以初步反映出细菌的耐药性状态。
当然，这种方法不仅涉及到耗时、耗材、人力等成本的问题，而且还受到试验条件、条件操作等方面的影响。
细菌对抗菌药物的敏感试验
（3）抗菌药物使用情况的变化会引起细菌耐药 情况的变化，如投入或停用某种抗菌药物常与其 耐药性的消长有关；
（4）抗菌药物使用愈多的区域耐药菌分布愈多；
（5）抗菌药物应用时间越长耐药菌定植的可能 性越大；
（6）抗菌药物剂量越大耐药菌定植或感染的机 会更多；
（7）抗菌药物对自身菌群有影响并有利于耐药 菌生长。
（3）氯霉素乙酰转移酶。此酶为一种胞内 酶，早在1987年，Lyon等就确定此酶由质 粒或染色体或转座子基因编码，主要作用 是使氯霉素类抗生素转化为无抗菌活性的 代谢物。
（4）红霉素酯化酶。此酶是一种体质酶， 由质粒介导，主要作用是水解红霉素及大 环内酯类抗生素结构中的内酯而使之失去 抗菌活性。
地翻译而引起蛋白质合成受阻，从而引
起细菌死亡。
3、破坏胞浆膜的完整性
这类抗菌药主要是一些抗真菌的药物， 如两性霉素B（Amphotericin B），它们 主要能够与细菌细胞胞浆膜上的一些磷 脂成分结合，破坏胞浆膜的完整性，从 而导致细胞的裂解。
4、影响细菌的代谢途径 这类抗菌药的代表就是磺胺类（Sulfonamides）。
三、细菌耐药性产生的机理
细菌的耐药性机理主要有生化机理和基因 机理两个方面：
(一）、生化机理：
1、细菌产生破坏药物结构的酶
这一类的耐药细菌常常可以产生一种或多 种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌 细胞内的药物，使之失去生物活性。这是 引起细菌耐药性的最重要的机制，目前发 现和分离的钝化酶主要有以下4种：
上述概念虽然考虑到了细菌对抗菌药物 的敏感性，但却忽略了药物的剂量、浓 度和机体的耐受性。
从本质上讲：细菌对某种抗菌药物是敏 感还是耐药，常以该抗菌药物的治疗浓 度（抗菌药物通过常用途径和常用剂量 所能达到的血药浓度）与该抗菌药物对 细菌的最小抑菌浓度（MIC）的关系而 定：
抗菌药物敏感性试验与耐药检测ppt生物技术实验教学中心课件
8.联合药物敏感试验
1）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均 匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分钟，待 平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板 上，两纸片中心距离2--4mm左右。然后35℃ 孵育 过夜，取出观察结果。
2）结果判断 联合药物敏感试验可出现四种结果： A.无关作用： 甲+乙=甲单或乙单 B.拮抗作用： 甲+乙＜甲单或乙单 C.相加作用： 甲+乙=甲单+乙单 D.协同作用： 甲+乙＞甲单+乙单
三、实验操作步骤
（一）纸片扩散法：
1. M-H平板：直径为90mm，厚度 4mm。 2. 菌悬液制备：无菌挑取菌落于无菌生理盐水中，校
正浊度至0.5 麦氏。 3. 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻
轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方 式均匀涂抹琼脂平板表面三次（每次转60℃）使 菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。盖上 平板的盖子，放置3~10min。
一、实验目的：
1. 掌握纸片扩散法（K-B法）的原理、操作方法、结 果的判读及临床意义。
2. 了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作 方法、结果判读和临床意义。
3. 掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量 控制。
二、实验原理
1. 抗菌药物敏感性试验是测定抗生素或其他抗 微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力。这 种能力可以通过稀释或扩散方法来测定。
六、影响因素：
1. 培养基：厚度，PH，离子浓度，成份，添加剂； 2. 抗菌药物的配制方法，纸片的含量，大小，
渗透性，保存方式等； 3. 细菌的接种量； 4. 培养的环境，温度与时间； 5. 结果的判断及解释标准等。
4.每个孔加入100ul浓度为105菌悬液（大肠或金 葡），混匀，胶布封口，37°C培养。
药敏试验方法及细菌耐药性课件
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
Hale Waihona Puke 药敏试验方法及细菌耐药性药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
药敏试验方法及细菌耐药性
实验七++细菌的药敏试验与耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
抗菌药物敏感性试验
三、浓度梯度纸条扩散法药敏试验
又称E试验（E test），融合了纸片法操 作简单和稀释法可定量的有点，也适用于慢生 长菌。但成本贵。
药敏纸片换成特制的药敏纸条，培养后读 取细菌停止生长处在纸条上相应的药物浓度指 示值，即为该药物对该试验菌的MIC值。
三、浓度梯度纸条扩散法药敏试验
细菌生长区
E test 塑料
一、β-内酰胺酶的检测
2、超光谱β-内酰胺酶的检测
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）由革兰氏 阴性杆菌产生，质粒编码，活性可被β-内酰 胺酶抑制剂（如克拉维酸）抑制。包括筛查 试验和确认试验。
ESBLs阳性提示该菌可能对青霉素类、头 孢类和单环抗生素耐药。
临床上需常规检测的细菌包括大肠埃希 菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变 形杆菌。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
（一）常用抗菌药物 β-内酰胺类、糖肽类、氨基苷类、大环
内酯类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类、甲 氧苄氨嘧啶等。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
• β-内酰胺类抗生素（β-lactams）系指 化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗 生素，包括青霉素与头孢菌素，碳青霉烯 类和单环类，以及β-内酰胺酶抑制剂 （克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦）的复方 制剂等。抗菌机制是抑制细菌的细胞壁合 成。
• 此类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适 应证广及临床疗效好的优点。
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
青霉素和头孢菌素类的基本结构
二、药敏试验常用抗菌药物 的选择与分组
（二） 抗菌药物的选择原则 1.致病菌的固有耐药特点 革兰氏阴性杆菌对万古霉素均耐药。 革兰氏阳性球菌对氨曲南固有耐药。 2.本地流行株的耐药谱和耐药趋势
实验七++细菌的药敏试验及耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
细菌对抗菌药物的敏感试验
•22
•23
•24
•25
第二节 抗菌药物压力
一、抗菌药物压力 是细菌产生耐药的主要源动力。 1985年，著名学者McGowan指出了与医院 内细菌耐药性的出现相关的7个方面： （1）引起医院感染的微生物的耐药性比引 起社会感染的微生物的耐药性更多见； （2）医院中耐药菌株感染者使用的抗菌药 物比敏感株感染或定植者使用的抗菌药 物多；
抑菌商数越小，抑菌效果越差。
•18
三、细菌耐药性检测的常用方式
•19
标准结果判读表
•20
分界点的计算方法
选取一大群同种不同株的细菌做药敏试 验（至少选取100株，包括敏感菌株和耐 药菌株），求出该群细菌中每一菌株对 某抗菌药物的MIC及其相应的抑菌环直 径。因抗菌药物对细菌的MIC与其相应 的抑菌环直径呈负相关关系，据此可绘 制回归直线图。方法如下：
•17
目前，临床上选择抗菌药物，常根据抑菌 商数来选择。
所谓“抑菌商数”（Inhibitory Quotient，简称 IQ），是指某抗菌药物在局部组织或体液 中的浓度除以该药物对感染菌的最小抑菌 浓度所得的商数。即： 局部组织或体液中的药物浓度
IQ =
MIC 抑菌商数越大，抑菌效果越明显；反之，
因此，在使用抗菌药物的过程中，必须加强细菌 对抗菌药物敏感性的实验室监测，为临床上合理 使用抗菌药物提供试验依据。而细菌对抗菌药物 的敏感试验，就是对抗菌药物进行实验室监测的 主要手段之一。
•3
目的： 1、为临床上治疗某个病人选择最佳抗菌
药物，指导临床用药，避免由于用药不 当，导致耐药菌株产生或造成人体伤害 ； 2、进行流行病学调查，了解致病菌的耐 药变迁情况，为医疗行政主管部门的决 策提供依据；
•23
•24
•25
第二节 抗菌药物压力
一、抗菌药物压力 是细菌产生耐药的主要源动力。 1985年，著名学者McGowan指出了与医院 内细菌耐药性的出现相关的7个方面： （1）引起医院感染的微生物的耐药性比引 起社会感染的微生物的耐药性更多见； （2）医院中耐药菌株感染者使用的抗菌药 物比敏感株感染或定植者使用的抗菌药 物多；
抑菌商数越小，抑菌效果越差。
•18
三、细菌耐药性检测的常用方式
•19
标准结果判读表
•20
分界点的计算方法
选取一大群同种不同株的细菌做药敏试 验（至少选取100株，包括敏感菌株和耐 药菌株），求出该群细菌中每一菌株对 某抗菌药物的MIC及其相应的抑菌环直 径。因抗菌药物对细菌的MIC与其相应 的抑菌环直径呈负相关关系，据此可绘 制回归直线图。方法如下：
•17
目前，临床上选择抗菌药物，常根据抑菌 商数来选择。
所谓“抑菌商数”（Inhibitory Quotient，简称 IQ），是指某抗菌药物在局部组织或体液 中的浓度除以该药物对感染菌的最小抑菌 浓度所得的商数。即： 局部组织或体液中的药物浓度
IQ =
MIC 抑菌商数越大，抑菌效果越明显；反之，
因此，在使用抗菌药物的过程中，必须加强细菌 对抗菌药物敏感性的实验室监测，为临床上合理 使用抗菌药物提供试验依据。而细菌对抗菌药物 的敏感试验，就是对抗菌药物进行实验室监测的 主要手段之一。
•3
目的： 1、为临床上治疗某个病人选择最佳抗菌
药物，指导临床用药，避免由于用药不 当，导致耐药菌株产生或造成人体伤害 ； 2、进行流行病学调查，了解致病菌的耐 药变迁情况，为医疗行政主管部门的决 策提供依据；
抗菌药物敏感性试验与细菌耐药性检测
2.试验方法及结果判读
三、实验内容
1、实验材料
（1）药敏纸片： ① 用于G+c：红霉素、克林霉素、万古霉素、替考
拉宁、复方新诺明、新生霉素、头孢 西丁 ② 用于G-b：环丙沙星、亚胺培南、头孢曲松、 头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南、 阿莫西林/棒酸
（2）菌株： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌标准菌株；
3、掌握葡萄球菌克林霉素诱导耐药（D试验） 的检测方法及结果判读。
二、实验原理
（一）抗菌药物敏感性试验检测
（二）细菌耐药表型检测
（一）抗菌药物敏感性试验
四种方法
1、纸片琼脂扩散法（K-B法） 2、稀释法 （1）肉汤稀释法 （2）琼脂稀释法 3、E-test法 4、联合药敏试验
纸片琼脂扩散法
1.基本原理
2、试验方法
MRS菌株的表型检测方法主要有头孢西丁 纸片扩散法、苯唑西林稀释法和苯唑西林盐 平板筛选试验，以头孢西丁纸片扩散法最常 用。
头孢西丁纸片扩散法解释标准
葡萄球菌克林霉素诱导耐药的检测 （D-test）
1.基本原理：
对大环内酯类耐药的葡萄球菌可能有天 然或诱导性对克林霉素的耐药，或只对大环 内酯类耐药。本试验可以测定诱导性的克林 霉素耐药。
2、什么叫D-test？该项检测有何意义？
2.试验方法
7
3.结果判读
用游标卡尺量取抑菌环直径，根据CLSI标准， 报告细菌对该抗菌药物是敏感（S）、中介 （I）还是耐药（R）。
4.注意事项
（1）菌液浊度应配制成0.5麦氏单位； （2）菌液调配好后应在15min内接种完； （3）菌液涂布药敏琼脂后应放置3-5min再贴
药敏纸片； （4）贴完纸片后不能再移动纸片；
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验
抗菌药物敏感性试验(药敏试验)PPT课件
治疗对基本药物过敏的患者
治疗少见菌的感染
流行病学调查为目的向感染控制部门报告
试验方法—纸片扩散法
改良Kirby-Bauer法(K-B法)
试验材料
培养基 非苛氧菌用Mueller- Hinton（M-H）琼脂 药物纸片 直径6mm纸片，每片吸水量约20μl 菌液比浊管 0.5号麦氏（McFarland）标准比浊管，
抗菌药物敏感性试验(药敏 试验)
目的
指导临床医生针对各类临床感染患者选择 最佳抗菌药物
一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐 药的微生物流行病学资料
根据细菌对药物敏感谱进行菌种鉴定
药敏试验原理
纸片扩散法
把含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试细菌的琼脂平板上
纸片中药物吸收琼脂水分溶解后通过弥散 作用形成递减的浓度梯度
纸片周围一定距离范围内试验菌生长受抑 制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。
抑菌环大小反映测试菌对测定药物的敏感 程度
抑菌环大小除与细菌的敏感性有关外还与 其它诸因素相关。
稀释法
定量测定抗菌药物活性 抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌
变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物 的抑菌环内，故在明显抑菌环内有薄膜状 爬行生长可以忽略。
加贴纸片
将接种好的平板敞开盖子倒置在室温下干 燥3-5min 使平板上的水分被琼脂完全吸 收。
用镊子取纸片一张贴在琼脂平板表面，轻 压使其与琼脂完全接触。纸片中心间距 ≥24mm,纸片中心距平皿边缘≥15mm。 直径90mm的平板最好贴6张。
15min内将平板倒置放温箱孵育。
注意
纸片一旦贴下就不可再挪动位置，因纸 片中的药物已扩散到琼脂中。 需要时应在适当的地方贴新纸片
治疗少见菌的感染
流行病学调查为目的向感染控制部门报告
试验方法—纸片扩散法
改良Kirby-Bauer法(K-B法)
试验材料
培养基 非苛氧菌用Mueller- Hinton（M-H）琼脂 药物纸片 直径6mm纸片，每片吸水量约20μl 菌液比浊管 0.5号麦氏（McFarland）标准比浊管，
抗菌药物敏感性试验(药敏 试验)
目的
指导临床医生针对各类临床感染患者选择 最佳抗菌药物
一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐 药的微生物流行病学资料
根据细菌对药物敏感谱进行菌种鉴定
药敏试验原理
纸片扩散法
把含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试细菌的琼脂平板上
纸片中药物吸收琼脂水分溶解后通过弥散 作用形成递减的浓度梯度
纸片周围一定距离范围内试验菌生长受抑 制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。
抑菌环大小反映测试菌对测定药物的敏感 程度
抑菌环大小除与细菌的敏感性有关外还与 其它诸因素相关。
稀释法
定量测定抗菌药物活性 抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌
变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物 的抑菌环内，故在明显抑菌环内有薄膜状 爬行生长可以忽略。
加贴纸片
将接种好的平板敞开盖子倒置在室温下干 燥3-5min 使平板上的水分被琼脂完全吸 收。
用镊子取纸片一张贴在琼脂平板表面，轻 压使其与琼脂完全接触。纸片中心间距 ≥24mm,纸片中心距平皿边缘≥15mm。 直径90mm的平板最好贴6张。
15min内将平板倒置放温箱孵育。
注意
纸片一旦贴下就不可再挪动位置，因纸 片中的药物已扩散到琼脂中。 需要时应在适当的地方贴新纸片
关于抗菌药物敏感性试验(药敏试验)课件
纸片周围一定距离范围内试验菌生长受抑 制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。
抑菌环大小反映测试菌对测定药物的敏感 程度
抑菌环大小除与细菌的敏感性有关外还与 其它诸因素相关。
稀释法
定量测定抗菌药物活性 抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌
关于抗菌药物敏感性 试验(药敏试验)
目的
指导临床医生针对各类临床感染患者选择 最佳抗菌药物
一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐 药的微生物流行病学资料
根据细菌对药物敏感谱进行菌种鉴定
药敏试验原理
纸片扩散法
把含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试细菌的琼脂平板上
纸片中药物吸收琼脂水分溶解后通过弥散 作用形成递减的浓度梯度
按 抑 菌 环 直 径 判 断 细 菌 的 敏 感 性 ， 应 依 据 CLSI的解释标准，报告细菌对测试药物敏 感、中介、耐药。
结果判断
在清楚抑菌环内有独立的菌落生长提示
接种的菌落不纯，需要重新分离、鉴定和 药敏试验
抗菌药物选择出的高频突变耐药株
变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物 的抑菌环内，故在明显抑菌环内有薄膜状 爬行生长可以忽略。
治疗对基本药物过敏的患者
治疗少见菌的感染
流行病学调查为目的向感染控制部门报告
试验方法—纸片扩散法
改良Kirby-Bauer法(K-B法)
试验材料
培养基
非苛氧菌用Mueller- Hinton（M-H）琼
脂
药物纸片 直径6mm纸片，每片吸水量约20μl
菌液比浊管 0.5号麦氏（McFarland）标准比浊管，
置35℃孵育2-6 h 用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至
抗菌药物敏感性试验和细菌耐药性检查课件
细菌的外膜上特殊的药物泵出系统 使菌 体内的药物浓度不足导致耐药 。铜绿假单胞菌外 膜上有一种蛋白OprK，泵出多种抗生素 ，是产生 耐药的重要机制 。
19
细菌耐药性的生物化学机制
. 药物作用靶位的改变 通过靶位的改变使抗 生素不易结合，是耐药发生的重要机制。
1.核糖体靶位酶亲和力的改变导致对四环素、红 霉素、喹诺酮、氨基糖苷类、甲氧嘧啶、磺胺 类抗生素耐药 。
2.核糖体位点的改变引起对大环内酯类和林可霉 素类抗生素耐药 。
3. DNA螺旋酶的改变是对喹喏酮类抗生素耐药 的重要机制 。
20
细菌耐药性的生物化学机制
. 药物作用靶位的改变 4.核酸合成途径中序列靶位酶的改变 对磺胺- 甲氧嘧啶
耐药，二氢叶酸还原酶改变致甲氧嘧啶耐药。 5. PBP发生改变 , β - 内酰胺类抗生素不能结合或亲和
. K-B法试验程序
挑取菌落 转种肉汤
比浊
涂布平板上 放置药敏纸片 量取抑菌圈大1小
2
1、常见菌 2、苛氧菌 3、厌氧菌 4、酵母菌 5、真菌
. E试验法
13
. 联合药物敏感试验意义 . 联合抑菌试验 . 最低杀菌浓度测定
14
15
常用敏感性试验的方法
• 监控治疗效果试验：
• 1、血清抗菌药物浓度测定(serum antimicrobial level)
27
四、铜绿假单胞菌
• 铜绿假单胞菌对多数抗生素不敏感，呈现明显的 固有耐药性。长期以来假单胞菌的固有耐药性认 为是由于该菌具有外膜的低通透性(主要是外膜
微孔蛋白突变，阻止抗生素由外膜进入胞质)， 最近的研究表明，假单胞菌耐药的产生机制与细 菌具有能量依赖性的主动外排系统有关，也可能 同时存在其他耐药机制。由于在长期抗生素治疗 过程中铜绿假单胞菌可能发生耐药，因此，初代 敏感的菌株在治疗3~4周后，测试重复分离株的抗 生素敏感性是必要的。目前，对假单胞菌感染多 采用联合治疗，如选用一种 β 内酰胺类抗生素与 一种氨基糖苷类或一种喹诺酮类抗菌药物联合。
19
细菌耐药性的生物化学机制
. 药物作用靶位的改变 通过靶位的改变使抗 生素不易结合，是耐药发生的重要机制。
1.核糖体靶位酶亲和力的改变导致对四环素、红 霉素、喹诺酮、氨基糖苷类、甲氧嘧啶、磺胺 类抗生素耐药 。
2.核糖体位点的改变引起对大环内酯类和林可霉 素类抗生素耐药 。
3. DNA螺旋酶的改变是对喹喏酮类抗生素耐药 的重要机制 。
20
细菌耐药性的生物化学机制
. 药物作用靶位的改变 4.核酸合成途径中序列靶位酶的改变 对磺胺- 甲氧嘧啶
耐药，二氢叶酸还原酶改变致甲氧嘧啶耐药。 5. PBP发生改变 , β - 内酰胺类抗生素不能结合或亲和
. K-B法试验程序
挑取菌落 转种肉汤
比浊
涂布平板上 放置药敏纸片 量取抑菌圈大1小
2
1、常见菌 2、苛氧菌 3、厌氧菌 4、酵母菌 5、真菌
. E试验法
13
. 联合药物敏感试验意义 . 联合抑菌试验 . 最低杀菌浓度测定
14
15
常用敏感性试验的方法
• 监控治疗效果试验：
• 1、血清抗菌药物浓度测定(serum antimicrobial level)
27
四、铜绿假单胞菌
• 铜绿假单胞菌对多数抗生素不敏感，呈现明显的 固有耐药性。长期以来假单胞菌的固有耐药性认 为是由于该菌具有外膜的低通透性(主要是外膜
微孔蛋白突变，阻止抗生素由外膜进入胞质)， 最近的研究表明，假单胞菌耐药的产生机制与细 菌具有能量依赖性的主动外排系统有关，也可能 同时存在其他耐药机制。由于在长期抗生素治疗 过程中铜绿假单胞菌可能发生耐药，因此，初代 敏感的菌株在治疗3~4周后，测试重复分离株的抗 生素敏感性是必要的。目前，对假单胞菌感染多 采用联合治疗，如选用一种 β 内酰胺类抗生素与 一种氨基糖苷类或一种喹诺酮类抗菌药物联合。
细菌药敏试验及其耐药表型检测课件
– MIC接近血、体液中药物的浓度，治疗 反应率低于敏感株
• 药物生理浓集部位有效 (尿-FQ) • 加大用药剂量可能有效
– 缓冲区：防止操作的系统误差造成重 大结果的判定错误
药敏试验的方法学
• 半定量…纸片扩散法 (抑菌圈直径) • MIC法：
– 稀释法(肉汤、琼脂) – 自动化仪法 – 抗生素连续梯度法 (Etest ) – 流式细胞仪
• 检测方法有微生物培养法、碘－淀粉法、头 孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因 为简单、方便、快速，应用于临床检测。
葡萄球菌属 – 青霉素
方法 MIC
纸片扩散法
敏感 0.12 mg/ml
29 mm
中介 -
-
耐药 0.25 mg/ml
28 mm
CLSI M100-S20. Table 2C.
诱导β-内酰胺酶的检测
2020/10/1
22
预报用药(一)
测试药 菌名 性
推测其他药物的敏感
• 苯唑西林 葡萄球菌
所有β-内酰胺类
• 四环素 所有（除葡 多西环素，米诺环素
萄球菌和不
动杆菌〕
• 红霉素 G＋球菌
罗红霉素，克拉霉素，
阿奇霉素
• 克林霉素 所有
林可霉素
2020/10/1
23
测试药 性
• 氨苄西林 • 青霉素G
2020/10/1
E test 法
细菌生长 区
E test 塑料
条
256
128
椭圆形
细菌生长
抑制区
8
判读抑菌浓度
（MIC ug/ml)
016
wanghui-ART
33
E test 法
• 药物生理浓集部位有效 (尿-FQ) • 加大用药剂量可能有效
– 缓冲区：防止操作的系统误差造成重 大结果的判定错误
药敏试验的方法学
• 半定量…纸片扩散法 (抑菌圈直径) • MIC法：
– 稀释法(肉汤、琼脂) – 自动化仪法 – 抗生素连续梯度法 (Etest ) – 流式细胞仪
• 检测方法有微生物培养法、碘－淀粉法、头 孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因 为简单、方便、快速，应用于临床检测。
葡萄球菌属 – 青霉素
方法 MIC
纸片扩散法
敏感 0.12 mg/ml
29 mm
中介 -
-
耐药 0.25 mg/ml
28 mm
CLSI M100-S20. Table 2C.
诱导β-内酰胺酶的检测
2020/10/1
22
预报用药(一)
测试药 菌名 性
推测其他药物的敏感
• 苯唑西林 葡萄球菌
所有β-内酰胺类
• 四环素 所有（除葡 多西环素，米诺环素
萄球菌和不
动杆菌〕
• 红霉素 G＋球菌
罗红霉素，克拉霉素，
阿奇霉素
• 克林霉素 所有
林可霉素
2020/10/1
23
测试药 性
• 氨苄西林 • 青霉素G
2020/10/1
E test 法
细菌生长 区
E test 塑料
条
256
128
椭圆形
细菌生长
抑制区
8
判读抑菌浓度
（MIC ug/ml)
016
wanghui-ART
33
E test 法
细菌对抗菌药物的敏感试验
而引起细胞壁的通透性改变，大量水分 进入细胞浆中而引起细胞的裂解。
PPT文档演模板
细菌对抗菌药物的敏感试验
PPT文档演模板
细菌对抗菌药物的敏感试验
l 2、抑制蛋白质的转录或合成
l 由于真核生物和原核生物核糖体的差异， 真核生物的核糖体主要是80 S，由60 S和 40 S两个亚基组成，而原核生物的核糖体 是70 S，主要由30 S和50 S两个亚基组成。
PPT文档演模板
细菌对抗菌药物的敏感试验
l 2 、靶位的改变
l 由于抗菌药作用的靶位(如核糖体和核蛋 白)发生突变或被细菌产生的某种酶修饰 而使抗菌药物无法发挥作用，以及抗菌药 的作用靶位(如青霉素结合蛋白和DNA回 旋酶)结构发生改变而使之与抗生素的亲 和力下降，这种耐药机制在细菌耐药中普 遍存在。
PPT文档演模板
细菌对抗菌药物的敏感试验
l 结果观察：含最小药物量仍呈明显不混 浊的一管所含的药物浓度即为该抗菌药 物 对 试 验 菌 株 的 最 小 抑 菌 浓 度 （ MIC ） 。
PPT文档演模板
细菌对抗菌药物的敏感试验
2、血药浓度（血清中抗菌药 物的浓度）
l 在使用各类抗菌药物时，常常会遇到 的一个重要问题，就是血药浓度。例如： 口服抗菌药物总是经肠道逐渐吸收入血 的。因此，血液中的药物浓度是从无到 有随时间的延长逐渐增高的。即使静脉 注射抗菌药物，因存在着首过效应（第 一关卡效应）和肾脏的排泄作用，血药 浓度也是随着注射的次数而逐渐增高的。
PPT文档演模板
细菌对抗菌药物的敏感试验
l 三、细菌耐药性产生的机理
l 细菌的耐药性机理主要有生化机理和基因 机理两个方面：
l (一）、生化机理：
l 1、细菌产生破坏药物结构的酶
PPT文档演模板
细菌对抗菌药物的敏感试验
PPT文档演模板
细菌对抗菌药物的敏感试验
l 2、抑制蛋白质的转录或合成
l 由于真核生物和原核生物核糖体的差异， 真核生物的核糖体主要是80 S，由60 S和 40 S两个亚基组成，而原核生物的核糖体 是70 S，主要由30 S和50 S两个亚基组成。
PPT文档演模板
细菌对抗菌药物的敏感试验
l 2 、靶位的改变
l 由于抗菌药作用的靶位(如核糖体和核蛋 白)发生突变或被细菌产生的某种酶修饰 而使抗菌药物无法发挥作用，以及抗菌药 的作用靶位(如青霉素结合蛋白和DNA回 旋酶)结构发生改变而使之与抗生素的亲 和力下降，这种耐药机制在细菌耐药中普 遍存在。
PPT文档演模板
细菌对抗菌药物的敏感试验
l 结果观察：含最小药物量仍呈明显不混 浊的一管所含的药物浓度即为该抗菌药 物 对 试 验 菌 株 的 最 小 抑 菌 浓 度 （ MIC ） 。
PPT文档演模板
细菌对抗菌药物的敏感试验
2、血药浓度（血清中抗菌药 物的浓度）
l 在使用各类抗菌药物时，常常会遇到 的一个重要问题，就是血药浓度。例如： 口服抗菌药物总是经肠道逐渐吸收入血 的。因此，血液中的药物浓度是从无到 有随时间的延长逐渐增高的。即使静脉 注射抗菌药物，因存在着首过效应（第 一关卡效应）和肾脏的排泄作用，血药 浓度也是随着注射的次数而逐渐增高的。
PPT文档演模板
细菌对抗菌药物的敏感试验
l 三、细菌耐药性产生的机理
l 细菌的耐药性机理主要有生化机理和基因 机理两个方面：
l (一）、生化机理：
l 1、细菌产生破坏药物结构的酶
细菌对抗菌药物敏感性与耐药性
细菌生长区
E test 塑料条
椭圆形 细菌生长 抑制区
256 128 8 016
判读抑菌浓度 （MIC ug/ml)
第二节 抗菌药物敏感试验
四、E-test法 E-test法（epsilometer test）结合了扩散法和稀释法的原理和特点，对抗菌药物直接测量MIC。E试条为宽5mm、长50mm的无孔试剂载体，一面固定有浓度呈连续指数增长的抗菌药物，另一面有所含药物浓度的刻度
第三节 分枝杆菌的药物敏感试验
返回章内容
二、体外药敏试验—绝对浓度法
结果报告 按下列方式报告对照培养基及含药培养基菌落情况：
细菌耐药性与耐药机制
第四节 细菌的耐药性检查
产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶 抗菌药物作用靶位改变，包括青霉素结合蛋白位点、DNA解旋酶、DNA拓扑异构酶Ⅳ的改变等 抗菌药物渗透障碍，包括细菌生物被膜形成和通道蛋白丢失 药物的主动转运系统亢进 上述四种耐药机制中，第一、二种耐药机制具有专一性，第三、四种耐药机制不具有专一性。
浓度 4 8 16 32 64 12
抗菌药物素倍比稀释，接种菌105CFU/ml ， 孵育温度35℃，16～20h，判读结果。
第二节 抗菌药物敏感试验
三、稀释法 1. 肉汤稀释法
第二节 抗菌药物敏感试验
微生物学检验
单击添加副标题
汇报人姓名
01
第六章 细菌对抗菌药物敏感性与耐药性
本 章 内 容
第二节 抗菌药物敏感试验
第一节 临床常用抗菌药物
第四节 细菌的耐药性检查
第三节 分枝杆菌的药物敏感试验
学习目标：
掌握 抗菌药物敏感试验常用方法，纸片扩散法（K-B法）的操作方法、结果判断及实验质量影响因素 熟悉 耐药表型检测；β-内酰胺酶检测方法；超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）检测方法 了解 临床常用抗菌药物种类；药敏试验中药物选择原则 本章重点：★纸片扩散法（K-B法）的操作方法及结果判断 药敏试验的临床意义
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的MIC。
依照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。
26
有菌生长区 无菌生长区Βιβλιοθήκη 27椭圆形细菌 生长抑制区
256 128
8
判读抑菌浓度
（MIC ug/ml)
016
28
E test 法特点
优点 连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好 （相关系数为0.9）.可测MIC。 操作简单，影响因素少，稳定性高。
32
两种药物的联合使用的效果
增强作用：两种抗生素联用的效果大于它们单
独使用时的效果之和； 20％～25％
相加作用：它们联用时的效果等于单用两种抗
生素效果之和； 60％～70％
无关作用：两种抗生素联用的效果，仅相当于 其中一种具有较强作用的抗生素的效果；
拮抗作用：两种抗生素联用时的效果反而小于
系列1
5
10
15
20
Diameter（mm）
13
纸片法药敏试验抑菌圈直径与结果解释的标准
抗菌药物与细菌 纸片含量 抑菌圈直径：mm 相应MIC μg/ml 耐药 中介度 敏感 耐药 敏感
丁胺卡那霉素 氨苄青霉素
测肠杆菌 测葡萄球菌 测嗜血杆菌 测肠球菌
30μg ≤14 15-16 ≥ 17 ≥32 ≤16
药物敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到 抑制，形成抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌 对药物的敏感程度。 二者呈正相关。
11
抑菌圈边缘的药物浓度 与 MIC
12
抑菌圈的大小与MIC： 二者呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
lgMIC
50 40 30 20 10
0 0
氨苄青霉素对肠杆菌科的抑菌试验
10μg 10μg 10μg 10μg
≤11 12-13 ≤ 28 — ≤19 — ≤16 —
≥ 14 ≥ 29 ≥ 20
≥32
≥4 ≥16
≤8
≤0.25 ≤2
14
操作方法 ： 1. 制备M-H琼脂平板，厚度4mm。 2 .制备0.5麦氏比浊管浊度的菌液 （培养16～24h，4~5个菌落）。 3. 菌液均匀涂布于平板。（15分钟接种完毕） 4. 无菌贴标准抗生素纸片于M-H琼脂表面， 5. 经过35℃16～24h孵育。 6. 量取抑菌环直径， 根据CLSI标准，
心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
21
7.经过35℃16～24h孵育。 8.取抑菌环直径， 根据CLSI标准，报告细菌对 该抗生素敏感、耐药、中介。
22
纸片扩散法质量控制
抑菌圈直径？
培养基：M-H平板厚度，4 mm
↗↘
细菌悬液：0.5麦氏标准的细菌浓度 ↗ ↘
药敏纸片的质量
各抗菌纸片中心距离应大于24mm， 纸片距平板内缘应大于15mm。 ↘ ↗ 9cm的平板贴6个
培养时间 ↗ 质控菌株
23
24
纸片扩散法的特点
根据抑菌圈的直径，依照CLSI标准，作出敏感、 耐药、和中介的判断。为‘‘ 定性”结果。
CLSI推荐的最简单的药敏试验。
25
三、E试验法（浓度梯度法）
缺点：E试条较昂贵; 不适用于生长缓慢的苛养菌。
31
四、联合药物敏感试验
联合药物意义
用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治 疗,以扩大病原治疗的覆盖面
治疗多种细菌所引起的混合感染 对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用 减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生 避免药物达到毒性剂量。
报告细菌对该抗生素敏感、 耐药、中介。
15
操作方法 ：
1. 将在约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm 的平板，其厚度 4mm。
16
2.无菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5个菌落。
17
3. 将菌置于无菌生理盐水中，校正其浊度于 0.5麦氏比浊管浊度的菌液。
1.5×108CFU /ml
5
6
CLSI标准 治疗浓度的上限 即表中的 R
治疗浓度
治疗浓度的下限 即表中的 S
耐药
中介耐药 敏感
MIC
7
第一节、抗菌药物敏感性试验方法
需氧和兼性厌氧菌
8
需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法
稀释法 • 肉汤稀释法（试管稀释法） • 琼脂稀释法（平板稀释法）
纸片扩散法（纸片法） E-试验 联合药物敏感试验
9
稀释法的特点
定量的药敏试验，测定MIC、MBC。 方法比较繁琐，手工操作一般不作为常规试验，
常用于调查罕见耐药。 自动微生物鉴定药敏分析系统采用微量稀释法
检测MIC。
10
二、纸片扩散法（disc diffusion test) 原理（：Kirby-Bauer法）
将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平 板上。抗菌药物向琼脂四周扩散形成递减的梯度 浓度。
抗菌药物敏感试验细菌耐 药性检测
主要内容
抗菌药物敏感性概述 抗菌药物敏感性试验方法 全国“细菌耐药监测网”简介
2
敏感和耐药的概念
从本质上讲：细菌对某种抗菌药物是敏感还是耐 药，常以该抗菌药物的治疗浓度与MIC的关系而 定。 常用剂量的抗菌药物通过常 用途径所能达到的血药浓度
3
血药浓度与MIC之间的关系
上限 下限
耐药 中介耐药
敏感
4
敏感和耐药的概念
抗菌药物的治疗浓度与MIC的关系：
若MIC小于治疗浓度， 则为“敏感”（Sensitive , S ），推荐使用。
若MIC大于治疗浓度， 则为“耐药”（ Resistant , R ）；
若MIC介于治疗浓度的上下限之间， 则为“中度耐药”（ Intermediate , I ）或中度敏 感
256
原理：
128
E试条是一条5mm×50mm无孔试剂载体，一面固
定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长的抗菌 8 药物，另一面有判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆
盖有15--20个对倍稀释浓度的宽度范围。
016
将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育，围
绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交
18
4.用无菌棉签浸入细菌悬 液中，将拭子在试管上壁 轻轻挤压以挤去过多的菌 液。棉签在三个方向均匀 抹琼脂表面（每次转60℃） 使菌液均匀分布，最后沿 平板内缘涂抹一周。
19
5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置 3~10分钟后贴上标准抗生素纸片。
20
6.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼 脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中