质粒的基本知识

质粒

质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。

目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA 分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对)。

复制原点

DNA复制起点，即DNA聚合酶结合位点

标记基因

一般是运载体上的一段特殊DNA序列，能表达特定形状便于检测运载体是否导入受体（如抗氨苄青霉素基因，绿色荧光基因）

启动子

转录起始位点，即RNA聚合酶结合位点

终止子

转录终止位点，也是特殊的DNA序列

起始密码子（无启动密码子之说）

mRNA上翻译起始的位置，通常为AUG，对应甲硫氨酸，少数细菌（属于原核生物）以GUG(缬氨酸)或UUG为起始密码，线粒体和叶绿体以AUG、AUU、AUA为起始密码子

终止密码子

翻译终止位置，不对应氨基酸，为UAA,UAG,UGA

目的基因

插入运载体，就是想要使其表达的那一段DNA序列，比如说想将人生长激素基因导入到小鼠体细胞中使其表达，那么人生长激素基因就是目的基因，经限制性内切酶切后与运载体相连

（运载体新教材上为载体）

1. 质粒转化

具体操作步骤：

将1ul 质粒DNA加入1.5ml的离心管；

将感受态细菌（competent cells）从－70℃冰柜中取出，快速吸取50ul感受态细菌，加入含质粒DNA的1.5ml的离心管；

轻轻地旋转以混匀内容物，在冰中放置30～60 min；

42度热休克90s（该时间应该非常准确，用Timer记时），冰上放置5min；

每管加500ul LB培养液，放37℃水浴1h；

吸取200ul培养物至含相应抗生素的90mm LB平板上，涂布棒将培养液涂布均匀；

倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。

2. 质粒的抽提

具体操作步骤：

用前将RNase A管的液体全部加到SolutionⅠ（加好RNaseA的溶液I一般储存在4℃）；

将60ml的乙醇加到洗涤缓冲液瓶

37℃培养16h的平板中挑取一个单菌落（直径2～3mm），接种到10ml LB培养液37℃剧烈振摇培养16 h；

取4ml菌液到5ml 离心管，8000rpm室温离心3min；

去上清，放于面巾纸上吸干痕液，

加250 ul Solution Ⅰ（注意用前应该加RNase A管），于涡旋振荡器重悬细胞；

加250 ul 37℃预热2-3min的Solution Ⅱ；

加350 ul Solution Ⅲ，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次；

将5ml离心管中的溶液倒入1.5ml 离心管中，

室温孵育2-3min，12000rpm 4℃离心15 min；

装配2ml 收集管（白色）和柱状收集管（蓝色）

将上清倒入柱状收集管（蓝色）中；

8000rpm室温离心3min；

去掉收集管中的液体，加500ul Buffer HB 到柱状收集管中，10000rpm室温离心1min； 去掉柱状收集管中的液体，加750ul Wash Buffer（注意用前加乙醇），10000rpm室温离心1min；

重复上述步骤一次；

不加Wash Buffer将管子10000rpm室温离心1min；

将柱状管放到一个消过毒的1.5ml 离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm 室温离心3min 洗提（洗脱）DNA。

3. 质粒电泳

具体操作步骤（以倒20ml的胶为例）：

用50ml量筒量取20ml 1XTAE；

用电子天平称量0.16g琼脂糖，并倒入20ml电泳缓冲液中；

将称量纸覆盖在装有琼脂糖的电泳缓冲液的三角瓶中，放入微波炉中转1min30s，至肉眼看不到颗粒状琼脂为止；

至室温待溶液冷却至60度左右，将三角瓶中溶液倒入制胶盒中，并加入上样梳子；

至室温约30min胶凝固后，拔掉梳子并将凝胶安放到电泳槽内；