三个甜瓜ERF基因的克隆及初步功能分析

三个甜瓜ERF基因的克隆及初步功能分析

ERF(ethylene responsive factor)与乙烯信号转导相关,是一类位于信号途径下游的转录因子,可参与逆境应答、植物生长发育和果实的成熟。ERF转录因子属于AP2/EREBP家族中的EREBP亚族,包含一个AP2/ERF结合域。

在甜瓜(Cucumis melo L.)中已经克隆得到若干ERF转录因子基因,但与甜瓜果实成熟相关研究报道较少。甜瓜属于葫芦科甜瓜属,果实具有丰富的营养,因此,深入研究与甜瓜果实成熟相关的ERF转录因子功能已经成为必要。

本研究根据甜瓜数据库序列分别克隆得到三个ERF转录因子CmERF Ⅲ-12、CmERF Ⅲ-14、CmERF Ⅴ-2基因,分别编码275、148、391个氨基酸,利用生物信息学软件进行蛋白理化性质、磷酸化位点、信号肽结构、跨膜结构等相关性质预测。结果表明三个转录因子都具有亲水性,有不同的磷酸化位点,不属于分泌型蛋白,不具有跨膜结构,也不属于膜蛋白;亚细胞定位预测显示CmERFV-2和CmERFⅢ-14很可能定位于细胞核,CmERF Ⅲ-12在细胞质内分布较多,因此三个转录因子可能分别在细胞核和细胞质内发挥着调控作用。

为研究其初步功能,构建CmERF Ⅲ-12、CmERF Ⅲ-14、CmERF Ⅴ-2基因超表达载体和RNAi干扰载体,利用农杆菌注射法在甜瓜果实中进行瞬时表达,通过实时定量PCR分别检测转化部位三个基因的表达特性和果实成熟相关基因的相对

表达量。结果显示,注射CmERF Ⅲ-14基因超表达载体部位果皮颜色出现提前变

黄表型,注射干扰载体部位仍保持绿色;注射CmERF Ⅴ-2基因超表达部位果皮颜

色保持绿色,注射干扰载体部位出现变黄表型;分别注射CmERF Ⅲ-12基因超表

达与干扰载体部位的果皮颜色表型不明显。

注射组织实时定量PCR检测结果显示:CmERF Ⅲ-14基因的过表达和干扰处

理分别会激活和抑制果实成熟相关ACS4、EXP1、PSY1基因的表达。CmERF Ⅴ-2基因的过表达能抑制EXP1基因的表达。

结合表型结果,CmERF Ⅴ-2基因可能推迟果实的成熟而CmERF Ⅲ-14基因会促进果实的成熟,CmERF Ⅲ-12基因则对果实成熟的影响不大。构建携带有果实

特异表达E8基因启动子的报告载体pPZP-E8-GUS,以分别携带目的基因超表达载体为效应载体,通过叶片注射法共转化本氏烟草(Nicotiana benthamiana)根据GUS活性变化,CmERF Ⅲ-12、CmERF Ⅲ-14转录因子基因能够激活果实特异性E8启动子促进基因的表达而增加GUS酶的相对活性,而CmERF Ⅴ-2则倾向于抑制

E8启动子降低GUS基因的表达而影响酶的相对活性。