层析分离方法-116页word资料

层析分离方法概述■层析法――是一种使不同分子相互分离的过程，当一混合样品被导入一固定相的支持体中，而另一流体(移动相)通过时，由于样品各组分与固定相和移动相相互作用的大小不同，使各组分通过固定相支持体的速率不同而得分离。

层析法的特点：能分离一系列结构较为相似的成分，以达到一般分离方法难以达到的目的。

■层析常见种类及用途:a.柱层析――分离量较大，主要用于分离制备；b.薄层层析――主要用于分析鉴定,也可用于半微量制备。

c.纸层析――主要用于分析鉴定，也可用于半微量制备。

■层析法按分离原理大体上又可以分为(1) 吸附层析(利用吸附能力的差别进行分离)，常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等；(2) 分配层析(利用在二种不互溶的溶剂中分配比不同进行分离)，常用的支持剂为硅胶、硅藻土、纤维粉等，反相硅胶(键合硅胶)、液滴逆流层析则是分配层析与逆流分溶的发展；(3) 离子交换层析(利用离子解离强度不同进行分离)，常用的离子交换树脂有强酸性(磺酸型)、强碱性(季胺型)、弱酸性(羧酸型)、弱碱性(三级胺型)；(4) 电泳(利用电流通过时，离子趋电性不同进行分离)，常用的有纸电泳、琼脂电泳、凝胶电泳。

(5) 其他有气体层析、凝胶层析、亲和层析等，■层析方法的选择：(1)非极性的成分常选择氧化铝或硅胶吸附层析；(2)极性较大则采用分配层析或弱吸附剂吸附层析；(3)酸性、两性成分可用离子交换层析，有时也可用吸附层析及分配层析。

■各类化合物适宜的层析方法：a. 一般生物碱的分离可用硅胶或氧化铝层析，对极性较高的生物碱也可用分配层析，而对季胺型水溶性生物碱也可用分配层析或离子交换层析。

b. 甙类的层析分离往往决定于甙元的性质，如皂甙、强心甙，一般可用分配层析或硅胶吸附层析。

c. 芳香油、甾体、萜类(结合成甙除外)包括萜类内酯，往往首选氧化铝及硅胶层析，若在氧化铝柱上有次级反应，则宜用硅胶吸附层析。

d. 黄酮体、单宁等多元酚衍生物可用聚酰胺吸附层析。

e. 有机酸、氨基酸一般可选用离子交换层析，有时也用分配层析，有些氨基酸也可用活性炭吸附层析。

f. 多肽、多糖等大分子化合物，常用凝胶层析、亲和层析、反相硅胶（键合硅胶）。

第一部分柱层析第一章硅胶层析一、层析用硅胶层析用硅胶一般以SiO2·xH2O表示，系多孔性的硅氧环Siloxane(a)交链结构，由于其骨架表面具有很多硅醇Silanol(b)基团，能吸着多量水分，此种水分几乎成游离状态存在，因此当加热至100℃左右能可逆地被除去。

硅胶的活性水分含量有关(见表7-1)，表7-1 氧化铝和硅胶含水量与活性的比较含水量高则吸附力减弱，当游离水含量高达17%以上，吸附能力降低，而可作为分配层析载体。

硅胶于500℃加热能不可逆地失去结合水(一般170℃以上即有少量结合水失去)，从硅醇结构变成硅氧环结构，若加热至1,100℃则结合水尽失。

由于硅胶的吸附能力主要与硅羟基数量有关，因此加热温度过高吸附能力反而降低。

有时硅胶层析具有吸附层析与分配层析的双重性质，甚至还有极弱的离子交换作用。

层析硅胶应是中性无色颗粒，但是由于制作过程常可带有酸性，如果酸性不强于pH5，一般已可使用。

■商品层析硅胶合格的判定a.PH值－一般先检查其是否中性。

取硅胶一份混悬于100份水中放置，应得澄清的中性溶液。

如滤液为酸性，应水洗至中性，再行活化处理。

b.铁离子的检查－一般将硅胶混悬于盐酸中，搅拌，如含铁离子则与盐酸结合成复合物而显黄色。

有铁离子存在即预示有其他金属盐存在的可能性，因此最好以盐酸洗涤处理。

在特殊情况下，硅胶须经乙醚、氯仿等有机溶剂预洗，至洗出液蒸干无残渣为止。

由于硅胶容易吸水，因此用前最好经120℃烘24小时活化，可不作活性测定。

■硅胶的改良：向层析硅胶中加入一种复合试剂，以改良吸附性能，提高分离效果，称改良吸附剂。

例如以硝酸银处理的硅胶对不饱和烃类有极好的分离作用。

以1~10%复合试剂的水或丙酮溶液，与硅胶混匀，待稍干后于110℃干燥即可。

表7-2 常用改良吸附剂二、硅胶吸附层析的应用■硅胶层析的优、缺点：优点：(1) 有些化合物用氧化铝层析，吸附剂副反应较多，而且某些副反应即使用中性氧化铝仍难以避免。

而硅胶作吸附剂虽也有个别发生异构化，但一般副反应较少；(2) 某些酸性、酚性物质、色素等易与氧化铝结合而不宜使用氧化铝层析，硅胶则无此特性；(3) 氧化铝层析样品损失较多，而硅胶层析样品回收率较高。

缺点：(1)即分离效果有时较氧化铝为差，对杂质的吸附能力差；(2)样品处理量相应的比氧化铝为低。

■硅胶吸附层析的操作快速层析（Flash Chromatography）――既快速简便，又有相当分离效果。

注；玻璃磨口连接处用弹簧或橡皮圈扣紧。

橡皮管连接处一般在压力为1kg/cm2以下不会脱开。

■操作步骤1．装柱A.干法向层析柱中加入0.5~1cmn高的硅胶H(100～200 mesh/目)，再将硅胶H（300～400mesh左右，即38m(10~40m)）装入柱，敲紧或在出口处抽真空吸紧，使硅胶层高约18～20cm，硅胶层面应水平，上部再加0.5～1cm高的纯净砂层或滤纸。

然后加入洗脱用的溶剂，加压赶去硅胶内气泡，溶剂压至硅胶层顶面，此时硅胶层高约15～17cm。

B. 湿法.即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌待空气泡除去后，连同溶剂一起倾入层b1析柱中。

最好一次倾入，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段，容易影响分离效果。

b.向硅胶中加入一定体积的溶剂，充分搅匀，加入到预先装有一定体积溶剂的层2析柱内（已加粗硅胶H），同时打开活塞放出溶剂，硅胶下降。

加压赶去硅胶内气泡，至层高约18～20cm，溶剂压至硅胶层顶面，此时硅胶层高约15～17cm。

2. 硅胶柱内包含溶剂体积的确定（干法）――取一定体积V的溶剂，加压至砂板处，将层析柱的活塞稍打开，使溶剂滴入接受器中，当氧化铝柱上面的溶剂液面刚好降至填料表面，关闭活塞，量取接受器内溶剂量V1。

则VV1即氧化铝柱内包含溶剂的体积V。

依据V，在层析过程中，可知在什么时候开始收集流份。

当变换溶剂的时候，就可知道新换溶剂大致在何流份开始。

3. 加样用尽量少的溶剂溶解样品，然后加至柱中，加压压入硅胶层。

难溶样品拌入少量硅胶再装入，上面再复以砂层。

4. 洗脱根据薄层层析资料的判断，用在硅胶薄层板上欲分点为Rf=0.2～0.3的展开溶剂洗脱，如有多点需分离时，可以改变洗脱溶剂的比例。

用减压阀控制压力以调节洗脱速度，收集馏分。

而且为了尽量减少被分离化合物在层析柱中扩散，层析过程中不能有间歇。

5. 样品收集每一馏分用薄层板点样分析，每块薄层板上可点数个馏分点，用原料做对照，前一块板的最后一点应用于下一块板的第一点做对照点。

将相同位置点的馏分合并，蒸除溶剂。

柱的粗细和进样量等的关系（表1）这时施加的压力约0.4～0.7kg/cm2(可用压力表指示)。

为了达到最好分离效果，使用者可根据具体样品摸索条件。

表1柱内径（mm）硅胶用量（g）加样量（g）流速（ml/min）每一馏分体积（ml）14 17 25 355210 16 35 701500.2 0.5 1～2 4 85 10 15 20302.5 4 8 15 25例：1.2g原料反应5d后，用硅胶薄层层析显示（展开剂：石油醚/乙酸乙酯82），主要为二个斑点：Rf分别为0.23和0.14，相应于未反应原料和产物。

用快速层析法分离（柱内径25mm，青岛海洋化工厂硅胶H 35g，硅胶层加压后高17cm）。

先用120ml石油醚/乙酸乙酯（82）洗脱，再用400ml石油醚/乙酸乙酯（82）洗脱。

加压力0.7 kg/cm2，流速0.5ml/min。

开始80ml未收集，以后收集15ml左右为一馏分。

馏分1～7：0.01g，低极性物；馏分8～15：0.49g，相应于Rf0.23的原料；馏分16～18：交叉馏分；馏分19～34:0.37g相应于Rf0.14的产物。

收集时间约1.5h。

总之，此层析法可用于Rf差0.05到0.1的组分分离，一般在2h左右可分离一个样品，既达到一般柱层析的分离效果，又节省了时间，而且溶剂和硅胶用量也可减少。

对不太稳定的化合物，用此法分离尤为适用。

吸附柱层析硅胶的用量――样品与吸附剂的比例可为130～60，但必须根据分离工作的难度，较难分离者有时甚至可选用1500～1000。

硅胶吸附层析适用范围――使用比较广泛，能用于非极性化合物，也能用于极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成产品如有机金属化合物等。

三、硅胶的再生1. 由于硅胶对杂质及色素吸附力差，因此回收操作比氧化铝简单，一般可用乙醇或甲醇洗涤，或于索氏提取器连续抽提除去杂质，洗净的硅胶待溶剂挥发除去后，烘干活化处理即可使用。

2. 硅胶的再生也可用5～10倍体积的1﹪氢氧化钠煮沸半小时，如仍不成强碱性(以酚酞作指示剂)，可追加适量1﹪氢氧化钠，趁热过滤，以蒸馏水洗三次，冉以3～6倍5﹪盐酸煮沸半小时，以蒸馏水洗至中性，120℃活化，过筛即得。

四、分配层析的原理及操作一种溶质在两种不相互溶的溶剂中振摇，当达到平衡时，溶质在两层中浓度都有恒定的比例，这一比值称作该物质在这两种溶剂中的分配系数。

如果需要分离的两种物质，在两相中的分配系数比较接近，则须利用不断地进行反复分配，如使用逆流分溶及分配层析才能达到目的。

1．分配层析的原理――分配层析是以一种多孔物质吸着一种极性溶剂，此极性溶剂在层析过程中始终固定在支持剂上，因此称为固定相。

另用一非极性溶剂(与固定相不相互溶)洗脱，此洗脱剂在层析过程中始终是移动的，称为移动相。

溶质在固定相和移动相之间，在柱上作连续的、动态的不断分配，由于不同成分在两相间分配系数的差异而得以分开。

2. 影响分离效果片的因素――两者的分配系数差值。

如果相差较大，只要用较小的柱和较少的硅胶用量即能满意地分离，如果分配系数差值极小，则同样重量的样品往往要用较大的柱和用较多的硅胶才能分开。

3. 分配层析所用多孔支持剂――主要有硅胶、硅藻土(商品名Celite)、纤维粉等，近年来并有用有机支持剂的，如微孔聚乙烯粉等。

■操作――分配层析所用的仪器操作一般与吸附层析相同，将预先选定的固定相溶剂(一般为水溶液或极性溶剂)加入支持剂硅胶中，搅拌混合均匀，倾入事先选定的移动相溶剂中，激烈搅拌，使两相互相饱和达到平衡。

层析管中放移动相(事先务必用固定相溶剂剧烈振摇，互相饱和，以造成层析时稳定的平衡条件)，将上述吸着固定相的硅胶湿法装柱，不断轻敲管壁或加压，使固定相支持剂压紧。

样品一般可溶于移动相中上柱，继以移动相洗脱，按固定体积收集，分别浓缩处理。