质谱数据定量分析方法
串联质谱如何定量
串联质谱如何定量串联质谱（tandem mass spectrometry, MS/MS）是质谱技术的一种高级形式，能提供比传统单段质谱更准确和详细的结构信息和定量分析。
串联质谱通过将两个或多个质谱过程连接在一起，可以同时获取目标化合物的质荷比和结构信息，从而实现定量分析。
本文将详细讨论串联质谱的定量方法和技术。
串联质谱的定性分析方法包括以下几种：预先设定法、无损失扫描法、选离子扫描法、多级质谱扫描法以及峰面积比法。
其中，预先设定法是基于连接两个或多个质谱过程，目标化合物将在每个过程中选择性地分离并产生特定的质谱峰。
实验者需要预先了解化合物的反应特性，然后设置适当的质谱条件来获取需要的信息。
例如，一种常用的方法是利用电子轰击（electron impact, EI）产生的质谱碎片特征来进行预先设定。
无损失扫描法是一种通过串联质谱实现碰撞诱导解离（collision-induced dissociation, CID）和多级质谱（multiple stage mass spectrometry, MSn）来分析和确认目标物的结构和组成的方法。
在这种方法中，化合物经过主谱的质谱过程后，在碰撞池中与分子间或分子内发生碰撞，产生与化学反应相关的碎片，然后在子谱中通过CID进一步产生新的碎片，并获得更多的结构信息。
选离子扫描法是通过选择目标离子的特定质荷比进行扫描，在质谱中只记录特定离子质荷比（m/z）范围内的质谱峰。
这种方法可以在样品中进行高选择性和高灵敏度的分析。
多级质谱扫描法是将多个串联质谱过程连接在一起，以获取更详细的结构信息。
例如，通过对前体离子进行CID产生新的碎片离子，然后对新的碎片离子再进行CID。
这种方法可以提供更丰富的结构信息，用于更准确地确定目标化合物。
除了以上定性分析方法外，串联质谱还可以用于定量分析。
串联质谱的定量分析方法包括靶向定量和无靶定量。
靶向定量是通过调整仪器的质谱参数以选择性地监测目标化合物的特定离子峰，从而实现无损失或有损失的定量分析。
化学分析和质谱谱图的定量分析
化学分析和质谱谱图的定量分析
目录
质谱谱图的基本原理
化学分析方法
质谱谱图的定量分析方法
质谱谱图定量分析的误差来源及控制方法
质谱谱图定量分析的应用实例
质谱谱图的基本原理
离子源：将待测物质转化为带电粒子
质量分析器：将带电粒子按照质量分离
检测器：检测分离后的带电粒子，输出信号
加速电场：将带电粒子加速，使其获得能量
应用范围：适用于多种物质的分析，如金属离子、有机物等
优点：操作简便、准确度高、灵敏度高
原理：不同物质对光的吸收不同，通过测量物质对光的吸收程度，可以确定物质的含量
质谱谱图的定量分析方法
定义：在样品中加入已知浓度的内标物，通过比较样品和内标物的峰强进行定量分析的方法。
缺点：需要准确测定内标物的峰强和浓度，且操作复杂，需要专业人员操作。
应用范围：广泛应用于化学分析、药物分析、环境监测等领域。
优点：不受样品基质的影响，准确度高，可对多种化合物进行定量分析。
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定义：通过绘制校正曲线，将质谱谱图的信号强度与待测组分的浓度建立对应关系的方法。
原理：利用已知浓度的标准样品，在相同的实验条件下绘制校正曲线，通过比较标准样品与待测样品的信号强度，计算待测样品的浓度。
在基因组学研究中，质谱谱图定量分析可用于基因表达分析和单核苷酸多态性研究，了解基因表达与疾病的关系。
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亚稳离子峰：表示亚稳态离子的质量数
化学分析方法
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应用范围：金属元素和部分非金属元素的定量分析
质谱定量的简介和LCMS监测的模式
质谱定量的简介和LC/MS监测的模式利用质谱作小分子药代动力学分析，即PK/MS。
除此之外，这些一样的原那么也可用于生物基质中肽和蛋白的定量。
传统上，在使用现代质谱定量之前，定量是用HPLC高效液相色谱和UV紫外检测器实现的。
HPLC 药代动力学分析建立在保留时间、峰面积和紫外光谱性质的基础上的。
HPLC方法的缺点是灵敏度不够、缺乏特异性。
我们已经看到一些实例，一个化合物的确已经代谢了，然而保留时间和紫外光谱上，母离子和代谢物无法区分。
这种缺少特异性的分析时不时会误导研究者。
所以在药代动力学分析中，基于质谱的表征现在是一种新型的重要的工具。
质谱定量中已经被广泛接受的方式是MS/MS定量。
这种定量常通过三级四极杆或离子阱质谱实现。
要求使用MS/MS的原因是：许多化合物有同样的质量。
当使用第一个维度即单级质谱MS去定量时，也会缺乏特异性，尤其是对于像血液那样的复杂的基质。
第二个维度的MS（即MS/MS）在大多数情况下，能够提供唯一的断裂。
合并特异的母离子质量和唯一的碎片离子信息，可以选择性地监测被定量的化合物。
下面我们将讨论获得和可视化LC/MS数据的方法。
获得和可视化LC/MS的数据，或称为：质谱数据如何在一个LC/MS实验中表达？典型的方法，质谱被设置为扫描特定的质量范围。
在全扫描分析中，质量扫描范围较宽；在选择离子监测SIM时，质量扫描范围较窄。
依赖于扫描的类型，一个独立的质量扫描时间可以从10 ms到5秒。
在一次LC/MS分析中可获得许多个扫描。
LC/MS数据的表示方法为：把每个质量扫描的离子流信息叠加，画出随时间变化的总离子流，横轴是时间，纵轴是强度。
总离子流图非常像HPLC的紫外图，见图1。
下面咱们将讨论各类扫描的模式，和这些模式同质谱定量的关系。
最常见的LC/MS数据模式为：（1）总离子流图（2）选择离子监测（SIM）（3）选择反应监测（SRM）或多反应监测（MRM）：MRM和SRM本质上是同样的实验模式。
化学实验中的常见质谱分析方法
化学实验中的常见质谱分析方法在化学实验中，质谱分析方法被广泛应用于物质的鉴定、结构分析以及反应机理的研究等方面。
通过质谱仪器的测量，我们可以获得物质分子的质量信息和碎片离子的相对丰度，从而推断出物质的分子结构、化学组成和性质等重要信息。
本文将介绍几种常见的质谱分析方法及其原理，并讨论其在化学实验中的应用。
一、质谱分析方法1. 电子轰击离子化质谱法（EI-MS）电子轰击离子化质谱法是最常用的质谱分析方法之一。
其原理是在真空条件下，将待分析样品通过电子轰击使其产生离子化，然后通过质谱仪器进行质量分析。
通过测量生成的离子的质量-荷比（m/z）比值，可以确定分子离子的质量，并推断出物质的结构。
该方法具有高灵敏度和分辨率高的优点，适用于大多数有机化合物的分析。
2. 化学电离质谱法（CI-MS）化学电离质谱法是一种常用的质谱分析方法，其主要特点是在质谱仪器中加入高速气流，通过化学反应的方式将待分析样品转化为离子。
相比于电子轰击离子化质谱法，化学电离质谱法可以将样品中的非挥发性化合物转化为易挥发的离子，从而提高分析的灵敏度。
该方法广泛应用于药物代谢、天然产物分析和农药残留等领域。
3. 电喷雾质谱法（ESI-MS）电喷雾质谱法是一种常见的离子化技术，其原理是通过电场作用将液相样品转化为气相离子。
在电喷雾过程中，待分析样品溶解于溶剂中，并通过高电压加速离子化。
该方法适用于极性和中性化合物的分析，特别是在生物医药领域中，常用于蛋白质和核酸的质谱分析。
二、质谱分析在化学实验中的应用1. 化合物的鉴定与结构分析质谱分析在化合物的鉴定与结构分析中具有不可替代的作用。
通过测量待分析样品的质谱图谱，包括分子离子峰和碎片峰等信息，我们可以推断出有机化合物的分子式、结构以及它们之间的关系。
这对于新合成化合物的鉴定、天然产物的结构分析以及有机反应的机理研究等方面具有重要意义。
2. 反应过程的在线监测质谱分析方法还可以应用于反应过程的在线监测。
质谱分析法定性与定量
ü色谱峰的数据点数目和峰宽、扫描时间有关
Ø 分辨率
质谱仪主要性能指标
质谱仪主要性能指标
分辨率
磁质谱的分辨率定义最为严格：对两个相等 强度的相邻峰，当两峰间的峰谷不大于其峰高10%时 ，则认为两峰已经分开，其分辨率：
磁质谱中，R不随m/z变化，在测定小分子时有优势 eg. R=5000，500与500.1 5000与5001
用碎片离子色谱图进行质谱测定时，分子离子 最好是一个选择的检测离子。选择的检测离子并不一定 要源于分子的同一部分。每个检测离子的信噪比应≥3︰ 1
二、定性（确证）方法
相对离子丰度最大容许偏差
相对丰度（%基峰）
EI-GC-MS（相对）
CI-GC-MS、GC-MSn、LCMS、LC-MSn（相对）
> 50%
FT-ICR
各种离子化方法的使用范围
Ionic
ESI or MALDI
APCI/APPI
选择的依据
挥发性 热稳定性 极性
Analyte Polarity
GC/MS
Neutral
101
102
103
104
105
Molecular Weight
质谱仪主要性能指标
Ø 质量范围
ü 质谱仪所能测定的离子质荷比的范围 ü 不同仪器 ü 不同应用
±10%
±20%
> 20% to 50%
±15%
分辨率
Ø有机质谱仅要求50％峰 谷刚刚分开就算分开（这 时称为有机质谱的单位质 量分辨） Ø简化为用单峰法表示， 即测定一个峰半峰高处的 全峰宽Full width half Maximum（简写为 FWHM）
eg. FWHM=0.25
高分辨质谱仪的操作技巧与数据解析方法
高分辨质谱仪的操作技巧与数据解析方法高分辨质谱仪是一种重要的科学仪器，常用于化学分析和生物科学研究。
它可以以高精度和高分辨率测量不同样品中的化学成分，并提供详细的质谱图谱。
本文将介绍高分辨质谱仪的操作技巧和数据解析方法。
操作技巧1. 样品准备：在进行质谱分析前，样品的准备非常重要。
首先，需要确保样品的纯度和浓度适合分析。
其次，需要选择合适的样品溶剂，并进行适当的溶解和稀释。
最后，样品应该进行过滤以去除杂质。
2. 仪器校准：在进行实际质谱测量之前，需要对仪器进行校准。
校准是通过使用已知化合物进行质谱分析，并根据其特征质谱图谱来调整仪器参数。
这样可以确保精确的质谱测量结果。
3. 扫描模式选择：高分辨质谱仪通常具有多种扫描模式，包括全扫描、选择离子扫描和碎片离子扫描等。
根据实验需求，选择适当的扫描模式。
全扫描可以提供样品中所有的离子信息，而选择离子扫描可以选择特定的离子进行分析。
4. 离子源设置：离子源是质谱仪中一个关键的组件，它负责将样品中的分子转化为离子。
离子源的设置至关重要，要根据不同的样品类型和实验目的进行调整。
常见的离子源技术包括电喷雾离子源（ESI）和化学电离（CI）。
5. 数据记录和保存：在进行质谱测量时，应及时记录和保存所得到的数据。
这是为了方便后续的数据分析和进一步的实验。
同时，也可以为实验结果的重复性和可靠性提供支持。
数据解析方法1. 鉴定化合物：质谱图谱提供了大量的信息，可以用于鉴定和确认化合物。
首先，需要通过检索质谱图谱数据库来找到可能的化合物匹配。
然后，对比质谱图的碎片峰和模式，进一步确定化合物的结构。
2. 定量分析：高分辨质谱仪可以用于定量分析，主要通过质谱峰的积分面积来计算样品中特定组分的浓度。
此过程中需要建立校准曲线，并结合适当的质量控制方法来保证数据的准确性和可靠性。
3. 代谢组学研究：高分辨质谱仪在代谢组学研究中发挥着重要作用。
代谢组学是研究生物体内代谢物组合的状况和变化的一种方法。
蛋白质质谱数据 绝对定量
基于MRM 的蛋白质组学实验流程
复旦大学
MRM 实验的设计、优化
1.目标蛋白质组的选择: 依据先前的实验或者是文献,以及 网络资源寻找赶兴趣的蛋白
2.目的肽段的选择：
（a）选择目标蛋白特有的多肽来监测 （b）离子化和碎裂好的肽段更易被检测，灵敏度高，优先选择 （c）确保所选的肽段的 m/z值与所用仪器质量范围相匹配 (6-20个氨基酸） （d）如果可能，尽量不要选用含有易被化学修饰或发生重排的氨基酸 (例如：M,C等）
Analytical Chemistry, 2004
复旦大学
2.基于电感耦合等离子体质谱测定元素的蛋白质绝对定量
磷酸化肽 段混合物 BNPP (内标） BNPP: bis(4-nitrophenyl) phosphate 与磷酸化肽段性质类似
混合物
HPLC–ICPMS
HPLC–ESIMS
I31P
tret/min MS/MS
不足： 用含磷的化合物BNPP作为内标， 在质谱上的响应与肽段的响应 还是会出现细微的差别，从而 给该方法的定量带来误差。
Angew. Chem. Int. Ed. 2007
复旦大学
3.非同位素标记的肽段用于蛋白质组的绝对定量
通过向样本中加入不同 浓度的标准人肌红蛋白 绘制标准曲线，曲线的 反向延长线与横坐标交 点的相应横坐标值即为 此方法测定的实际样本 中人肌红蛋白的绝对浓度
1053.6
1072.5764
1074.8
1089.5776
1096.0
100
1223.9
90
脱氨峰
80
70
% Intensity
60
50
40
30
(完整版)质谱的定量分析
(完整版)质谱的定量分析1. 引言质谱是一种广泛应用于化学、生物学和医学领域的分析技术。
它利用对化学物质中离子的质量和相对丰度进行测量，从而得出化合物的分子结构、相对分子量以及定量分析结果。
本文将介绍质谱的定量分析原理、方法和应用。
2. 原理质谱的定量分析主要依赖于质谱仪器。
质谱仪器通常由采样系统、离子化系统、质量分析仪和检测系统组成。
在样品进入质谱仪器后，被离子化产生离子，然后通过加速器加速。
离子在磁场中运动，其轨迹受到磁场的影响，不同质量的离子会呈现不同的轨迹，从而实现质量分析。
最后，离子会通过检测系统进行检测和计数，计算得出定量分析结果。
3. 方法质谱的定量分析方法多种多样，主要包括质谱定标法、内标法和外标法等。
3.1 质谱定标法质谱定标法基于已知浓度的标准样品与待测样品的质谱峰面积之间的线性关系进行定量分析。
首先，通过一系列稀释标准样品得到不同浓度的标准曲线，然后测定待测样品对应质谱峰的面积，并利用标准曲线进行定量计算。
3.2 内标法内标法是在待测样品和标准样品中添加一个已知浓度的内标化合物，利用内标化合物的信号进行校正。
内标化合物应与待测化合物在质谱上具有相似的性质，且不会干扰待测化合物的质谱信号。
通过测量待测样品和内标样品中内标化合物的信号强度比值，可以得出待测化合物的浓度。
3.3 外标法外标法是将测定物质与已知浓度的外标化合物进行混合，通过外标化合物的峰面积与其浓度之间的关系进行定量分析。
外标化合物应与待测化合物在质谱上具有明显的差异，以便进行准确的定量。
4. 应用质谱的定量分析在许多领域中具有广泛的应用。
例如，在药物研发中，质谱可用于测定药物的含量、纯度和杂质等。
在环境监测中，质谱可用于测定水、空气等中微量有机污染物的浓度。
在食品安全领域，质谱可用于检测食品中的残留农药和添加剂。
此外，质谱的定量分析还在病理学研究、生物医学和法医领域有重要应用。
5. 结论质谱的定量分析是一种准确、灵敏和可靠的分析方法。
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数据：FT_yeast, BPRC,高可信鉴定肽段
非线性拟合算法
C *Ti i
, i 1,2
Ii
CC
*Ti *Ti
K1Ti2 K1Ti2
i K T2 i4
i
, ,
i i
3,4 5,6
K1Ti2 K2Ti4 i
, i 7,8
K T2 i4 i
,i 9,10
10
2
f i
f K1
10
2 i
i 1
i K1
0
f
特点 K2
i 110
临床诊断 ---直接寻找差异---
肽段组学，肽段特征矩阵，LC-MS策略，信号直接对比+有选择鉴定
定量数据分析的基本方法
5
无
标
标
定
记
量
定
量
不包括MRM、iTRAQ和SC定量
计算问题
6
图谱定量信息提取---同位素峰簇处理 肽段定量指标计算---比值计算，XIC处
理，母离子误差校正 RT对齐---LC-MS策略和LC-MS/MS策略
1
蛋白质学组中质谱数据定量分 析方法研究
谢红卫 国防科学技术大学机电工程与自动 化学院自动控制系
2010.5.15
主要内容
2
研究背景（我们对定量问题的认识）
定量数据分析面对的问题 定量数据分析的基本方法 已有定量软件和应用情况
研究内容和结果
定量信息提取方法及问题 多批次定量数据的对应及重复实验 差异显著性检验 计算问题和软件开发
软件在可视化、 速度、数据文 件格式支持、 算法精度和实 验策略支持等 方面有很大发 展空间
定量软件-Mascot
14
支持的定量类型
多种标记定量， MS/MS图谱 定量， emPAI， 重复实验 Label free， 选择信号最强的3 个肽段
数据处理算法特色
基于m/z和RT的对齐，多种XIC积分方法，多参数鉴定结果过滤，outliers排 除，归一化处理（利用均值）
信号归一化 目的：针对无标记定量，消除不同实验间的系 统误差 基本方法：寻找不变量
差异显著性检验 从肽段到蛋白质的信息综合：平均？筛选？ 异方差问题：信号越弱，误差分布越宽
一个例子
12
XIC
定量信息:TGVIVGEDVHNLFTYAK
图谱计数SC 126 70 3 4
XIC面积SA(对数) 8.54 7.56 5.15 5.89
保留时间RT 53.661617 58.135022 59.199630 57.643797
上样量（ug/ul） 3.0 0.3 0.03
0.003
鉴定信息
AVG_ISO_DIS
SC CH XCorr ∆Cn LM(ug/ul)
126 2 5.1
0.62 3.0
14 3 2.63 0.33 3.0
70 2 5.58 0.47 0.3
未来工作
3
第一部分：研究背景
定量数据分析面对的问题
4
大规模Biomarker 发现 ---低丰度蛋白质---
信号S/N低+鉴定信息少 重复实验数据综合 蛋白质和肽段预分离技术 策略的数据综合
Biomarker验证 ---靶标分析---
靶标挑选（MRM）肽段分析效率预测（绝对定量）生物样本蛋白质表达 的随机变化影响
RT对齐
10
LC-MS策略：寻找共同的肽段信号，建立非线 性模型
LC-MS/MS策略：利用共同鉴定肽段的RT建立 对齐模型
对齐模型：3次样条，局部回归，小波，分段线 性，偏移向量等
作用：对LC-MS/MS策略，可以弥补鉴定信息的 不足，提高MS图谱信号利用率
信号归一化和差异显著性检验
11
4 3 2.8
0.40 0.3
3 2 4.9
0.49 0.03
4 2 4.34 0.003
数据产生 LTQ/FT分析Yeast样品，SEQUEST搜 库，Target-decoy过滤（FDR=0.01）， 取Scan number最小的记录
定量软件
13
Cencus、 CRAWDAD、 MaxQuant
的不同 信号归一化---消除系统误差 差异显著性检验---考虑信号强度影响
质谱信号与定量
7
标记：配对的同位素峰
无标记：同位素峰
图谱定量信息提取方法
8
基本方法
最大值法，平滑积分法，信号求和，构建3D peaks （MaxQuant），函数拟合
附加处理
小波去噪，同位素分布约束，信噪比过滤
结果形式
问题：同位素峰分布测量误差
19
ERRi
ExpIso[i]
6
IsoDis[i] / IsoDis[i],i 1 ~ 6
ExpIso[i]
i1
1.8
Iso1
1.6
Iso2
Iso3
1.4
Iso4
Iso5
1.2
Iso6
Density
1
0.8
0.6
0.4
0.2
-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Data
X
肽 段 水 平
X XIC处理 小波去噪 平滑去噪
XIC定量
平滑积分
连续性截断
函数拟合
误差分析
信号加和
共3*4*3*4*3=432种计算流程
比较原则：重复实验的CV值最小
目前结论： （1）不进行去噪处理的信号加 和方法最优 （2）高信号水平的处理结果 CV值都比较小
定量信息提取：标记定量
17
图谱水平：
标记定量：比值，定量指标 无标定量：定量指标
肽段定量指标计算
9
可选步骤
去噪处理：小波，平 滑滤波
XIC峰形拟合：复杂的 类高斯函数
XIC边界确定：信噪比， 连续性，局部最小 值
母离子匹配误差分布： 提高精度？
标记定量：比值计算，MaxQuant采用了最小二乘拟合法 问题：不同试剂标记的肽段XIC平移，差异越大，表现越明显 无标记定量：定量指标计算
使用方法
在搜库前定义修饰和定量的参数（通过修改XML文件实现），搜库，然后 使用Distiller定量
15
第二部分：研究内容和结果
定量信息的提取：Label free
16
图 谱 水 平
去噪方法 谱峰定量信息
X 不去噪
Xcalibur默认
最大值 平滑积分
小波去噪
函数拟合
信号加和
同位素峰
X 单一 最高 全部
2 i
i 1
i K 2
0
f C
10
2 i
i 1
i C
0
可定义一般模式，支持自定义标记方法，支持多重标记
能够充分利用同位素分布信息
能够直接解决谱峰叠加问题
定量信息提取：标记定量
18
肽段水平
实现了多种算法：XIC面积比， 图谱比值平均，主成分分析， 最小二乘回归
采用了异常值排除策略
实现了基于XIC连续性的截断