质谱数据定量方法解析共39页
质谱分析法--定性与定量_图文
三、定量方法
2. 内标法
Ø 单点校正法 Ø 内标标准曲线法
三、定量方法
2. 内标法
内标物要满足以下要求： （a）试样中不含有该物质； （b）与被测组分性质比较接近； （c）不与试样发生化学反应； （d）出峰位置应位于被测组分附近。
ESIESI+
m/z- 179→79.9 m/z + 202→122
甜蜜素
SN/T 1948-2007 进出口食品中环己基氨
基磺酸钠的检测方法
应研究样品基质和检测器 性能引起的图谱改变
化合物 麻黄碱 伪麻黄碱
保留时间 （min）
6.9
8.0
定性离子对
166/148 166/133 166/148 166/133
•C7H6N2O2 8.50 0.72 0.45
化合物 C7H11N4
M+1 9.25
C8H6 O3 8.36
C8H8NO2 9.23
C8H11N2O 9.61
C8H12N3 9.98
二、定性（确证）方法
1. 基本原则
Ø质谱法只有在与色谱分离在线或脱机联用时才能作 为确证方法 Ø在分析仪器上的进样顺序是：空白溶剂、阴性控制 样品、要确证的样品、阳性控制样品再进样，最后是 阴性控制样品
Ø 扫描速度
ü色谱峰的数据点数目和峰宽、扫描时间有关
Ø 分辨率
质谱仪主要性能指标
质谱仪主要性能指标
分辨率
磁质谱的分辨率定义最为严格：对两个相等 强度的相邻峰，当两峰间的峰谷不大于其峰高10%时 ，则认为两峰已经分开，其分辨率：
质谱法简介—质谱法基本原理(分析化学课件)
m/z 123 －CH3
－CO 108
80
m/z 80 离子是由分子离子经过两步裂解产生的，而不是一步形成的
质谱法基本原理
4.同位素离子
大多数元素都是由具有一定自然丰度的同位素组成。化合物 的质谱中就会有不同同位素形成的离子峰，由于同位素的存在， 可以看到比分子离子峰大一个质量单位的峰M+1；有时还可以 观察到M+2，M+3。通常把由同位素形成的离子峰叫同位素峰。
离子子还可能进一步裂解成更小的碎片离子，在裂解的同时也可能
发生重排。
质谱法基本原理
3.亚 稳 离 子（m*）
在离子源中形成的碎片离子没有进一步裂解，而是在 飞行进入检测器的过程中发生自行的裂解，这样所形成的低 质量的离子叫亚稳离子。 形成过程 m1 (母离子) m2 (子离子) 中性碎片
表观质量 m m22
37
(a+b)n=(3+1)2=9+6+1
即三种同位素离子强度之比为9:6:1。 这样，如果知道了同位素的元素个数，可以推测各同
位素离子峰强度之比。 同样，如果知道了各同位素离子强度之比，可以估计
出分子中是否含有S、Cl、Br原子以及含有的个数。
质谱法基本原理 四、质谱法的特点与主要用途
❖ 特点： ❖ 1．样品用量少。灵敏度高，精密度好。 ❖ 2．分析速度快。 ❖ 3．分析范围广，适合联机。 ❖ 4．能够同时给出样品的精确分子质量和结构信息
色谱-质谱联用分析法 气质联用（GC-MS）的应用领域：
气质联用已经成为有机化合物常规检测中的
必备工具。环保领域的有机污染物检测，特别是
低浓度的有机污染物；药物研究生产质控的进出
口环节；法庭科学中对燃烧爆炸现场调查，残留
质谱分析学习.pptx
（3）麦氏重排
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四、醇
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五、酚
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六、醛酮
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八、胺
1、分子离子峰 脂肪族胺的分子离子峰很弱， 环胺、芳胺的分子离子峰很强。
2、断裂方式
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九、酰胺
1、分子离子峰 酰胺类分子离子峰通常可测到。
2、断裂方式（具有羰基裂解的特点）
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十、硝基化合物
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这规则用于其他碎片离子时，则是含偶数个氮原子的奇电子 离子其质量是偶数；而含偶数个氮原子的偶电子离子其质量 将是奇数。而分子离子均是奇电子离子。应含偶数个（不含 氮）氮原子。 （4）必须有合理的质量碎片的丢失。分子离子峰的裂解过程 中常常会失去小质量的中性碎 片和自由基。因此裂解过程中 分子离子（母离子）与子离子之间的质量差一定要合理，例 如出现质量差15或18，就丢失-CH3或一个分子水是合理的。 而丢失4~13原子质量单位是不合理的。因为分子离子
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醇类容易失水，出现(M-18) +峰。有些硝基化合物、易于分 解的有机化合物及支链烷烃，在电子轰击条件下得不到分子 离子峰，只有碎片峰。
（3）分子离子应符合氮规则。有机化合物主要由C、H、O、 N、S、CI、Br、1、F、P等元素组成。在质谱中有机化合 物分子中含有偶数个（包括零）氮原子的分子离子，质量一 定是偶数；而含有奇数个氮原子的分子离子，质量数一定是 奇数，这个规则称为“氮规则”。因为某些元素的最大丰度 的同位素（轻同位素）的原子的质量数为偶数，其化合价亦
质谱分析法
m:离子质量 υ :离子的速度 z:离子所带的电荷数 U:加速电压
加速后的离子进入磁场，在磁场的作用下，带电离子按曲 线轨迹飞行； mυ2 离心力 =向心力； = Bzυ 曲率半径： 质谱方程式：
R 2Um 1 R = ( 2 )2 Bz 2 2 m BR = z 2U
离子在磁场中的轨道半径R取决于: m/z ; B; U (1)若加速电压U和磁场强度B都一定时，不同m/z 的离 子，由于运动的曲率半径不同，在质量分析器重彼此 被分开，并记录各m/z离子的相对强度。 (2)固定R，B，连续改变加速电压U，电场扫描法。 固定R，U，连续改变磁场强度B，磁场扫描法。
质谱图解析 （C6H12O结构未知，酮） 结构未知，
解析： 1． 100，分子离子峰 2．85，失去CH3（15）的产物 3．57, 丰度最大, 稳定结构 失去CO(28)后的产物
O CH3 ‖∣ CH3-C-C-CH3 ∣ CH3
第七章 质谱分析法
1、什么是质谱？ 2、质谱仪主要是由进样系统、离子源、质量分析器、检测器、 数据记录系统组成的。 3、离子源和质量分析器都需要在高真空下工作。 4、质谱方程式；
1.质谱法是唯一可以确定物质分子质量的方法，且可 以确定化合物的化学式和进行结构分析。 2.灵敏度极高，鉴定最小量达10-10g，检出限可达10-14g。
质谱分析法基本原理
质谱法是采用高速电子来撞击气态分子或原子， 质谱法是采用高速电子来撞击气态分子或原子，将 电离后的正离子加速导入质量分析器中， 电离后的正离子加速导入质量分析器中，然后按质荷比 （m/z）的大小顺序进行收集和记录，即得到质谱图。 ）的大小顺序进行收集和记录，即得到质谱图。 质谱不是波谱，而是物质带电粒子的质量谱。 质谱不是波谱，而是物质带电粒子的质量谱。
质谱数据定量分析方法
3,4 5,6
K1Ti2 K2Ti4 i
, i 7,8
K T2 i4 i
,i 9,10
10
2
f i
f K1
10
2 i
i 1
i K1
0
f
特点 K2
i 110
2 i
i 1
i K 2
0
f C
10
王腾蛟 硕士生---马海滨
谢谢大家！
RT对齐
LC-MS策略：寻找共同的肽段信号，建立非线性 模型
LC-MS/MS策略：利用共同鉴定肽段的RT建立对 齐模型
对齐模型：3次样条，局部回归，小波，分段线 性，偏移向量等
作用：对LC-MS/MS策略，可以弥补鉴定信息的 不足，提高MS图谱信号利用率
信号归一化和差异显著性检验
图 谱 水 平
去噪方法 谱峰定量信息
同位素峰
X 不去噪
Xcalibur默认 小波去噪
最大值 平滑积分 函数拟合 信号加和
X
单一 最高
全部
X
肽 段 水 平
X XIC处理 小波去噪 平滑去噪 连续性截断
XIC定量
平滑积分 函数拟合
误差分析
信号加和
共3*4*3*4*3=432种计算流程
比较原则：重复实验的CV值最小
定量精度和参数优化
到定量完成的全流程 自动化，有GUI界面
速度：1 s可以定量1000
个肽段
支持pepXML，protXML， mzXML，mzData， mzML
蛋白质组装和未鉴定肽 段搜索
RT对齐、信号归一化
LC-MS策略支持软件XICFinder
质谱分析的原理与方法
灵敏度高：微克级样品
有机质谱仪绝对灵敏度为50pg（pg为1012g）
无机质谱仪绝对灵敏度为10-14g
分析速度快,可多组分同时检测 仪器结构复杂，价格昂贵
质谱仪
质谱仪的结构
进样系统 离子源 质量分析器 检测器和记录器
GC—MS（气相色谱—质谱联用仪）
Gas Chromatograph—Mass Spectrometer
分子离子峰必要的、但非充分的条件： 1、它必须是图谱中最高质量端的离子（分子
离子峰的同位素峰及其络合离子除外）；
2、它必须是奇电子离子；
3、它必须能够通过丢失合理的中性碎片，产
生图谱中高质量区的重要离子。
分子离子峰与碎片峰的区分： 1、注意质量是否符合氮元素规则； 2、注意该峰与邻近峰之间的质量差是否合理 （一般认为质量差为4-14，21-25，37，38， 50-53，65，66等是不合理的丢失）； 3、注意M+1峰（醚、酯、胺、酰胺、氨基酸 酯和胺醇等）； 4、注意M-1峰（醛、醇或含氮化合物）。
LC—MS（液相色谱—质谱联用仪） Liquid Chromatograph—Mass Spectrometer
质谱表示方法
Abscissa: m/e (mass charge ratio) 横坐标：质荷比 Y—coordinate: ion—current intensity 纵坐标：离子流强度
根据“氮规则”、M=181，化合物分子式为e 71
+
CH3 CH2CH3
CH3CH2CH2CH2CH2CH3
CH3CH2CH2CH2+ + m/e 57 CH3CH2CH2+ + m/e 43 CH3CH2+ + m/e 29
质谱数据定量分析方法
考虑了XIC截断，同位素峰叠加，母离子误差校 正等问题
提供了信噪比、同位素分布拟合优度等过滤 测试：发现采用严格过滤规则，则鉴定肽段也
可能不能定量，说明和LC-MS/MS策略可以相互 补充
第三部分：进一步的思考
预分离和信号归一化
SDS分离 蛋白质多条带分布 条带切割的不均匀性 不同实验之间信号不可比
标记定量：比值，定量指标 无标定量：定量指标
肽段定量指标计算
可选步骤
去噪处理：小波，平 滑滤波
XIC峰形拟合：复杂的 类高斯函数
XIC边界确定：信噪比， 连续性，局部最小 值
母离子匹配误差分布： 提高精度？
标记定量：比值计算，MaxQuant采用了最小二乘拟合法 问题：不同试剂标记的肽段XIC平移，差异越大，表现越明显 无标记定量：定量指标计算
定量软件-Mascot
支持的定量类型
多种标记定量， MS/MS图谱 定量， emPAI， 重复实验 Label free， 选择信号最强的3 个肽段
数据处理算法特色
基于m/z和RT的对齐，多种XIC积分方法，多参数鉴定结果过滤，outliers排 除，归一化处理（利用均值）
使用方法
在搜库前定义修饰和定量的参数（通过修改XML文件实现），搜库，然后 使用Distiller定量
差异显著性检验 从肽段到蛋白质的信息综合：平均？筛选？ 异方差问题：信号越弱，误差分布越宽
一个例子
XIC
定量信息:TGVIVGEDVHNLFTYAK
图谱计数SC 126 70 3 4
XIC面积SA(对数) 8.54 7.56 5.15 5.89
保留时间RT 53.661617 58.135022 59.199630 57.643797
质谱数据定量分析方法详解演示文稿
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一个例子
XIC
定量信息:TGVIVGEDVHNLFTYAK
图谱计数SC 126 70 3 4
XIC面积SA(对数) 8.54 7.56 5.15 5.89
保留时间RT 53.661617 58.135022 59.199630 57.643797
4.3
0.72 0.003
2.2
0.34 0.003
数据产生 LTQ/FT分析Yeast样品，SEQUEST搜库， Target-decoy过滤（FDR=0.01），取Scan
number最小的记录
第十二页，共三十四页。
定量软件
Cencus、 CRAWDAD、
MaxQuant
软件在可视化、 速度、数据文 件格式支持、 算法精度和实 验策略支持等 方面有很大发 展空间
XIC峰形拟合：复杂的类高 斯函数
XIC边界确定：信噪比， 连续性，局部最小值
母离子匹配误差分布： 提高精度？
标记定量：比值计算，MaxQuant采用了最小二乘拟合法 问题：不同试剂标记的肽段XIC平移，差异越大，表现越明显 无标记定量：定量指标计算
第九页，共三十四页。
RT对齐
LC-MS策略：寻找共同的肽段信号，建立非线性模型 LC-MS/MS策略：利用共同鉴定肽段的RT建立对齐模
型 对齐模型：3次样条，局部回归，小波，分段线性，偏
移向量等
作用：对LC-MS/MS策略，可以弥补鉴定信息的不足，
提高MS图谱信号利用率
第十页，共三十四页。
信号归一化和差异显著性检验
信号归一化 目的：针对无标记定量，消除不同实验间的系 统误差
基本方法：寻找不变量
最全面的质谱定性与定量分析方法基础知识讲解！
最全面的质谱定性与定量分析方法基础知识讲解！质谱基础及相关术语基础1.质谱仪的基本结构2.各种离子化方法的使用范围Molecular Weight3.质谱仪的主要性能指标相关术语质谱峰类型♫分子离子·必须是化合物谱图中质量最高的离子·必须是奇电子离子、符合氮规则·必须能通过丢失合理的中性离子，产生谱图中高质量区的重要离子♫准分子离子♫碎片离子♫同位素离子·由于天然同位素的存在，因此在质谱图上出现M+1，M+2等峰，由这些同位素所形成的峰称之为同位素峰。
定性（确证）方法基本原则质谱法只有在与色谱分离在线或脱机联用时才能作为确证方法。
在分析仪器上的进样顺序是：空白溶剂、阴性控制样品、要确证的样品、阳性控制样品再进样，最后是阴性控制样品。
色谱分离1.保留时间测试部分中分析物的保留时间（或相对保留时间），应在一个特定的保留时间窗口范围内与校正标准的保留时间相符。
保留时间窗口与该色谱系统的分辨能力相当。
分析物和内标的保留时间之比，应与校正溶液的相对保留时间一致，GC偏差为±0.5%，LC偏差为±2.5%。
2.关于保留时间的讨论√ GBT16631-2008高效液相色谱法通则：同样条件下重复试验的保留数据的分散性，RSD≤3%；√ JJG705-2002液相色谱仪检定规程：定性测量重复性（6次测量）RSD≤1.5%；√ JJF（闽）1032-2010液相色谱-质谱联用仪校准规范：定性重复性RSD≤2%；√ JY/T021-1996分析型气相色谱方法通则：整机重复性保留时间RSD≤5％；√ GB/T22260-2008饲料中甲基睾丸酮的测定高效液相色谱串联质谱法：试样保留时间与标准品的相对偏差不大于15%；√ GB/T22147-2008饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的测定液相色谱质谱联用法：样品与标准品保留时间的相对偏差不大于0.5%；3.质谱检测（1）全扫描scan用记录全扫描质谱图进行质谱测定时，在标准品参考图谱中所有相对丰度>10%（分子离子、分子离子的特征加成物、特征碎片离子、同位素离子等）的特征离子都必须检测。
质谱法分析技巧
质谱法分析技巧质谱法是一种常用的化学分析技术，通过对样品中的化合物进行分子质量和结构的研究，可以获得丰富的信息。
在实验室中，质谱法广泛应用于生物医药、环境监测、食品安全等领域。
本文将介绍一些质谱法分析的基本技巧，帮助读者更好地理解和应用这一分析方法。
一、质谱仪的基本原理质谱仪是质谱法分析的核心设备，它主要由离子源、质量分析器和检测器三部分组成。
首先，离子源将样品中的分子转化为离子，常用的离子化方法有电子轰击、化学电离和电喷雾等。
然后，质量分析器根据离子的质量-电荷比（m/z）对离子进行分离和筛选。
最后，检测器测量离子的数量，生成质谱图。
通过质谱图，我们可以确定样品中的化合物种类、含量和结构等信息。
二、样品制备技巧样品制备是质谱法分析的首要环节，它直接影响到分析结果的准确性和可靠性。
在样品制备过程中，需要注意以下几个方面。
首先，样品应尽可能纯净，避免杂质的干扰。
其次，样品要适当稀释，以避免离子过多导致信号过饱和。
此外，对于固体样品，可以选择适当的溶剂进行提取，增加分析的灵敏度和准确性。
三、质谱参数的优化质谱参数的优化对于获得高质量的质谱图至关重要。
在质谱仪的操作过程中，可以调整离子源温度、碰撞能量、离子化电压等参数，以达到最佳的分析效果。
例如，对于高分辨质谱分析，可以增加离子源温度和离子化电压，以提高质谱分辨率。
此外，对于复杂样品，可以采用多级质谱（MS/MS）技术，通过连续碰撞诱导解离（CID）的方式，获得更加详细的结构信息。
四、质谱数据的解析质谱数据的解析是质谱法分析的关键步骤，它需要结合化学知识和专业软件进行。
首先，需要对质谱图进行峰识别和质量校正，确定峰的位置和相对丰度。
然后，可以通过与数据库比对、质谱图解析软件等手段，确定化合物的分子质量和结构。
在数据解析过程中，需要注意对比实验和对照实验的差异，以排除杂质和误判的可能性。
五、质谱法的应用领域质谱法作为一种高灵敏度、高选择性的分析方法，广泛应用于生物医药、环境监测、食品安全等领域。
质谱分析方法
4．质量分析器
质谱仪的质量分析器位于离子源和检测器 之间，依据不同方式将样品离子按质荷比m／ z分开。质量分析器的主要类型有：磁分析器、 飞行时间分析器、四极滤质器、离子捕获分 析器和离子回旋共振分析器等。随着微电子 技术的发展，也可以采用这些分析器的变型。 （l）磁分析器 最常用的分析器类型之一就是扇形磁分析 器。离子束经加速后飞入磁极间的弯曲区， 由于磁场作用，飞行轨道发生弯曲，见图 21．7。
解: 要分辨N+2和CO+，要求质谱仪分辨率 至少为：
Rneed 27.995 = = 2545 28.006 27.995
质谱仪的分辨率： Rsp=245/0.52=471 Rsp＜Rneed， 故不能满足要求。
质谱仪的分辨本领由几个因素决定： （i）离子通道的半径；(ii）加速器与收集 器狭缝宽度；（iii）离子源的性质。 质谱仪的分辨本领几乎决定了仪器的 价格。分辨率在500左右的质谱仪可以满足 一般有机分析的要求，此类仪器的质量分析 器一般是四极滤质器、离子阱等，仪器价格 相对较低。若要进行准确的同位素质量及有 机分子质量的准确测定，则需要使用分辨率 大于10000的高分辨率质谱仪，这类质谱仪 一般采用双聚焦磁式质量分析器。目前这种 仪器分辨率可达100000，当然其价格也将会 是低分辨率仪器的4倍以上。
R = m/W0.05
如果该峰是高斯型的，上述两式计算结果是 一样的。
【例16．1】要鉴别N+2（m/z为28．006）和CO+ 16． 要鉴别N m/z为28．006）和CO （m/z为27．995）两个峰，仪器的分辨率至少是多少? m/z为27．995）两个峰，仪器的分辨率至少是多少? 在某质谱仪上测得一质谱峰中心位置为245u，峰高5 在某质谱仪上测得一质谱峰中心位置为245u，峰高5 ％处的峰宽为0.52u，可否满足上述要求？ ％处的峰宽为0.52u，可否满足上述要求？
干货质谱是如何做到定量的？
干货质谱是如何做到定量的？食品实验室服务质谱信号的强度=粒子总数 x 离子化效率（就是你说的离子化难易程度）引言采用一系列方法测定或者至少能够固定（以LCMSMS为例，就是优化电压，喷雾角度，流动相组成比例，三气的流量，基质的组成全部固定下来）特定方式下的离子化效率，质谱是可以用于定量的。
举个例子，调谐好系统之后，你喷入1ppb的利血平溶液，得到的信号为一万；再喷入10ppb的利血平得到的信号为十万。
然后你喷入未知浓度的利血平，发现其信号值为五万，你就可以认为未知浓度的利血平为5ppb。
质谱的定量和紫外检测器，蒸发光检测器没什么本质区别，只不过质谱的线性范围比较令人抓狂而已。
当然还有一系列的问题，比如说特别是很多生物分析的样品，你稀释十倍之后很可能质谱信号的强度不会下降十倍。
1ppm对应的离子计数为一万，0.1ppm对应的离子计数不是一千而很可能是五千三千。
任何物理量的定量过程都无非是和“尺子”去对比，质谱分析当然也不例外。
要实现质谱定量分析一般有两种方法。
1外标法将待测物质A的标准品（特点是纯度非常高，有时也可称之为该物质的纯品）用某种有机溶剂S稀释成不同的浓度的标准溶液，分别取等量（一般是等体积）的这些不同浓度的标准溶液进行质谱分析。
由此可以得到一组样品量和信号值一一对应的数据，以其绘制成的曲线称为标准曲线。
现在就有了一把还不错的尺子，然后就可以去拿要检测的实际样品R进行质谱分析了。
根据标准曲线就可以由得到的信号值去反推物质A在该实际样品R中的含量了。
2内标法将已知量待测物质A的同位素标记物I掺杂到实际样品中去，然后进行质谱分析。
同位素标记物一般是利用H原子的同位素氘，即A里面的H在其同位素里都换成了氘，这样通过A的化学式就能推算出，A和I的质谱峰的差别也就知道了。
根据两者信号的比值和I的实际掺杂量就能推算出A的质量。
为什么选择同位素标记物进行标定呢？原因就是因为两者之间的各种物理和化学属性非常接近，除了分子量的差别几乎可以认为一模一样，因此就可以排除由于样品中基质的干扰（离子抑制之类的）引起的误差。