凝胶色谱柱使用注意事项共31页

基本内容
• 1. Sephadex LH-20结构特点 • Sephadex LH-20是Sephadex G-
25经羟丙基化处理后得到的产物。
• 葡聚糖凝胶中的葡萄糖部分与羟丙基
结合成醚键形式。
• 亲脂性的羟丙基是同时具备吸附性层
析和分子筛功能的独特层析介质。
交联葡聚糖凝胶的化学结 构
2 Sephadex LH-20性质
乙醇
3.2-
异丙醇
3.1-
四氢呋喃 3.1-
二氯乙烷 3.5-
甲苯
1.5-
装柱
• 将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒
入柱内，在保证胶粒不变形的前提下， 应在尽可能高的压力下装柱，反压不 要超过1.5ba。
• 柱装得不好往往造成洗脱区带加宽，
甚至使一些本来可以分开的区带重叠。 如装柱时的操作压力太大，会使凝胶 床压得太实，从而降低流速。
• 交联度小，机械强度低，不耐压，溶胀性
大
• 具亲脂性和亲水性，水及有机溶剂中都能
应用
• 可用于分子筛层析、吸附层析和分配层析 • 应用范围广泛，适合用有机溶剂分离嗜脂
性分子
• 载样量高，极少需要再生
• 主要性能参数
• 分离范围（球蛋白） 100-4000
• 颗粒大小（微米） 20-150
• 应用范围
• 在洗脱过程中，所有组分一般都可被
洗脱下来，所以装好柱后，可反复使 用，无需特殊的再生处理。
• 多次使用后，凝胶颗粒可能逐渐沉积
压紧，流速变慢。这时只需将凝胶自 柱内倒出，重新填装。或使用反冲法， 使凝胶松散冲起，然后自然沉降，形 成新的柱床，这样流速会有所改善。
污染处理方法
• Sephadex LH20柱子被弄脏了，大
多数情况下是由于样品没滤, 将柱头 堵住,或由于样品的死吸附(一般很少 发生),使柱子的柱头部分污染。
• 一般的处理是将被污染的柱头部分的
填料弃去,具体做法很简单,只将被污 染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起, 倒掉即可。
凝胶色谱柱使用注意事项
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
• 如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的
溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器 的位置，如使用相同的溶剂，在以后的 层析中柱平衡可以省略。
上样
• 一般要求样品粘度小于0.01Pa·s（帕斯
卡.秒），这样才不致于对分离造成明显 影响。。
• 上样量视被分离物的结构性能的差异而
定－差异大，可大；差异小，应小。
• 使溶胀胶体积沉淀之后占总体积
的75%，上层溶剂占25%，这 时，悬浮液从一个容器倒入另一
容器时胶粒可移动。
L•• H溶-剂20在溶m不l胀/同g体干积溶胶剂中溶的剂 溶胀性溶胀m体l/g积 能干胶
• 二甲亚砜
3.6 吡啶
3.5 水
3.5 甲醇
4.0 丙醇
1.6
4.2-4.4 4.0-4.3 3.8-4.2 3.7-4.2 3.4-3.8
• 吸附原理 • 吸附：范德华力或产生氢键
• 反相分配原理 • 分配：极性与非极性溶剂组成的混合
剂（反相溶剂）中起到反相分配的效 果
• 使用反相溶剂洗脱，极性大的化
合物保留弱，先被洗脱下来，极 性小的化合物保留强，后出柱。
• 如果使用正相溶剂洗脱，这主要
靠凝胶过滤作用来分离。
使用方法
• 制备凝胶悬浮液 • 装柱 • 平衡 • 上样 • 洗脱 • 再生 • 污染处理
• 常用溶剂：水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二
氯甲烷 甲醇-水 氯仿-甲醇
• 用低级醇为溶剂时，对芳香族、
杂环族化合物仍有吸附作用。但 用氯仿时则可去除对上述化合物 的吸附作用，而对含羟基与羧基 的化合物却有吸附作用。
再生方法
• 凝胶再生通常是先用2-3个柱体积的
洗脱液进行清洗，如更换洗脱液，则 需要重新平衡
• 洗脱液的成分也不应改变，以防凝胶颗
粒的胀缩引起柱床体积变化或流速改变。
溶剂的选择
• 主要考虑能溶解样品、湿润凝胶、不腐
蚀色谱仪、纯度高、毒性低、溶解性能 好，能溶解多种高分子、粘度尽可能低。
• 适用溶剂：满足上述条件，根据分离 要
求选择即可，如：水 DMF 丙酮 乙醇 乙 酸乙酯 甲醇 氯仿 THF 正丁醇 二氯乙烷
• 样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好，
但过少的样品量会造成设备和器材的浪 费，降低工作效率，还会造成样品稀释。
洗脱
• 所有的缓冲液都应该离心或经过
0.45um的膜过滤以除去杂质。
• 洗脱流速应根据情况而定，最大张性流
速约12cm/min（反压1.5ba），建议 流速为1-10cm/min。流速不宜过快且 要稳定。
胆固醇 ，脂肪酸，
激素，维他命，天然产物
• PH稳定性
2-13
• 最高流速 （厘米／小时） 500
3应用原理
凝胶层析的分子筛原理
l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分 子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之 外；3 大小分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱 出层析柱，小分子尚在进行中
• 一般是在柱内先装入约1/3高度的水
或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅 拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使 其自然沉降。如此连续操作，可以得 到一个均匀的柱床。
平衡
• 新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一
般用3～5倍体积的缓冲液在恒压下流过 床。
• 上wenku.baidu.com前，用洗脱液平衡层析柱至少两个
柱体积直到基线变得平稳为止。
制备凝胶悬浮液
• Sephadex LH-20在使用之前必
须进行溶胀。
• 在室温下，将凝胶溶胀于层析溶
剂中至少三小时。
• 在溶胀的过程中，要尽量避免过
分搅拌，否则会破坏球形胶粒， 且要避免使用磁力搅拌器
• 将干胶往水里加，边加边搅，以
防凝胶结块，然后放到沸水浴中 加热接近100℃，几个小时就可 以使其溶胀，还可起到除去颗粒 内部气泡和杀菌作用。
45、法律的制定是为了保证每一个人 自由发 挥自己 的才能 ，而不 是为了 束缚他 的才能 。—— 罗伯斯 庇尔
Sephadex LH-20
中药生物技术 S0620336
刘利
• 基本内容 • • 使用方法 • • • • 注意问题
1结构
2性质
3应用原理
1一般使用过程
2溶剂选择
3再生方法
4污染处理方法