(种子学课件)种子超低温贮藏

表2 几种作物种子冷冻时含水量的临界值
较多的研究报道认为，冷冻和解冻速率对多数
植物种子冷冻到液氮温度影响不大。然而莴苣 和芝麻种子却不一样。Roos(1981)用莴苣种子 做试验，其含水量接近于HMFL值即19％，发 现用200℃／min的速率冷冻几乎百分之百的成 活，若用22．2℃／min或更低的速度冷冻，生 活力明显下降。水分非常低的芝麻种子以1～ 30℃／min缓慢冷却时，几乎100％存活而不受 水分的影响。但以200℃／min冷冻时，种子生
种子含水量超过HMFL，冷冻到一定 温度，种子死亡。例如，小麦种子含水 量高于26．8％，冷冻到-7℃则发芽率下 降到25％(表2)。根据试验，小麦种子含 水 量 为 5.7 ％ ～ 16.4 ％ ， 在 液 氮 温 度 (196℃) 冷 冻 保 存 24 个 月 之 后 发 芽 率 仍 在 92%～96%，同对照相比没有明显差异。
种子超低温贮藏
一、种子超低温贮藏的概念和意义
1.种子超低温贮藏的概念
种子超低温贮藏是指利用液态氮(196℃)为冷源，将种子等生物材料置于 超低温下(一般为-196℃)，使其新陈代谢 活动处于基本停止状态，而达到长期保 持（种子）寿命的贮藏方法。
在 -196℃ 低 温 下 ， 原 生 质 、 细 胞 、 组织、器官或种子代谢过程基本停止并 处于“生机暂停”的状态，大大减少或 停止了与代谢有关的劣变，从而为“无 限期”保存创造了条件。
物种，目前还只能无性保存。如果建立了超低
温冷冻保存技术，可改进这类植物种质wenku.baidu.com期保 存的方法从而改良育种和繁殖技术。
3.对干燥和液氮均敏感的种子 这类种子就是顽拗型种子，它们的
寿命很短，难以保存。
三、种子超低温贮藏的技术关键
1.寻找适合液氮保存的种子含水量 只有 在合适的含水量范围内，种子才能在液 氮内存活。
2.冷冻和解冻技术 不同种子的冷冻和解 冻特性有差异，需分别探讨，以掌握合 适的降温和升温速度。
3.包装材料的选择 根据报道，包装材料 有牛皮纸袋，铝箔复合袋等。有的包装 材料能使种子与液氮隔绝，如种子与液 氮直接接触，有些种子会发生爆裂现象， 而影响种子的寿命。
4.添加冷冻保护剂 常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜 (DMSO)、甘油、PEG等，也有报道脯氨酸的效果很好。 使用冷冻保护剂的量应是足够起到冷冻保护作用，但 又不超过渗透能力和中毒的界限。 （渗透性冷冻保护剂主要包括二甲基亚砜、甘油、聚乙二 醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞 冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外 产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电 解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤， 同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱 水皱缩。在使用渗透性冷冻保护剂时，需要一定时间 进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作 用。)
2.忍耐干燥对液氮敏感的种子
许多果树和坚果类作物如李属、胡桃属、榛属
和咖啡属的植物种子属于这种类型。这类种子 多数能干燥到含水量10％以下，但是不能忍耐40℃以下的低温。例如榛子含水量可降到6％， 冷冻到0～-20℃不失去生活力。但是当温度降低 到-40℃以下种子生活力受损。忍耐干燥对液氮 敏感的种子多数含有较高的贮存类脂(如脂肪等)， 有的种含量高达60％～70％。含油量是否是引 起种子对液氮敏感的因素，尚不清楚。这类种 子的寿命一般少于5年。研究这类种子的保存技 术非常必要。因为这类种子多属于主要经济作
表1 不同含水量种子经LN2保存7天后的发芽率（石思信等，1985）
适 合 于 冷 冻 保 存 的 最 高 含 水 量 (high moisture freezing limits，HMFL)就是种子 含水量的临界值。在同一植物种中这个
临界值有一个不大的变动范围，但是植 物种间有明显的差异(表2)。
活力随含水量下降而下降。冷冻速率对种子生
活力的影响同种子含水量有关，假如种子含水
量在适宜范围内，则慢速或快速冷冻对多数种 子的成活率没有明显影响。
在冷冻和解冻过程中，由于温度的剧烈变 化，种子要经受极大的物理压力。如果 种子的细胞间质承受不了这种压力，就 会产生物理损伤。当种子在回升到室温 之前在液氮蒸汽上停留一段时间可减少 损伤，因此损伤产生在冷冻和解冻过程 中。当种子只暴露在液氮气相中（约150 ℃），种子没有损伤，小部分损伤发 生在-150 ℃~-196 ℃之间。
5.解冻后的发芽方法 经液氮贮存后种子的 发芽方法是一个容易被研究者忽视的问 题，液氮保存顽拗型种子难以成功，可 能与保存后的发芽方法不当有关，致使 还有生活力的种子在发芽过程中受损伤 或死亡。如茶籽在超低温保存后，最适 发芽方法是在5％水分(W／Ⅳ)沙床中于 5℃土1℃预吸处理15d，然后移到25℃发 芽。预处理后的种子，细胞膜修复能力 增强，渗漏物减少，发芽率提高(Hu等， 1994)。
2.种子超低温贮藏的应用和意义
这种保存方式不需要机械空调设备 及其他管理，冷源是液氮，容器是液氮 罐，设备简单，保存费用只相当于种质 库保存的1／4。液氮保存的种子不需要 特别干燥，一般收获后，常规干燥即可， 也能省去种子的活力监测和繁殖更新， 是一种省事、省工、省费用的种子低温 保存新技术。适合于长期保存珍贵稀有 种质。