实训二、葡萄糖标准曲线的绘(完)制

实训二、葡萄糖标准曲线的绘制

一、实训目的

1、了解DNS法测定还原糖的基本原理

2、通过DNS法测定还原糖的含量，建立吸光度与还原堂含量之间的线形关系，用于后续纤维素酶酶活性的测定

3、通过定量操作，让学生形成准确称量、测定的理念。

二、实训原理

具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度（吸光度OD值）与还原糖量（此处即为葡萄糖量）成正比关系。

三、实训方法

1、DNS溶液的配制

称取3，5－二硝基水杨酸3.15g(化学纯)，加水500ml，搅拌5s，水浴至45℃，然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容到100ml），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步加入四水酒石酸甲钠91g，苯酚 2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质全部溶解。停止加热，冷却到室温后，用水定容到1000ml，用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月。

（笔者注：在处理酸、碱和配制DNS试剂时，请尽可能戴上保护眼镜和乳胶手套，实验应在通风橱或通风良好的房间进行。一旦皮肤或者眼睛接触了上述物质，应及时用大量的清水冲洗）

2、 0.1％葡萄糖标准液

准确称取100mg分析纯的葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100ml，保存于冰箱中备用。

3、葡萄糖标准曲线的绘制

取9支具塞刻度试管，分别按表1顺序加入各种试剂。

表 1 试剂加入顺序

将上述各试剂依次混匀后，在沸水浴中加热10min，然后立即用流动冷水冷却，每个试管加蒸馏水至25ml刻度线，充分混匀后，用空白管溶液调零点，在UV751GD紫外/可见分光光度计（540nm）处测吸光度。以葡萄糖质量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

四、结果记录与分析处理

1、测定不同葡萄糖含量的OD值，建立以葡萄糖质量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标的关系式，要求用计算机作图，求出具体的线形关系式，同时相关系数R值不得低于0.9975

2、每根试管要求测定两次，两个数据之间的绝对差值不得超过算术平均值10%。变异系数不超过10%。

3、学会分析数据，当所做线形关系不符合要求时，能作出自己的分析和判断