血管内皮祖细胞(EPC)与自体骨髓干细胞移植
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AL PROGENITOR CELL AND AUTO BONE MARROW STEM CELL TRANSPLANTATION
血管内皮祖细胞（EPC）
较高的数量和迟发的高增殖潜能
实验证明，外周循环中成熟的EC数量极少，约 2.6±1.6（2-3）个/ml ，而EPC则约500-1000个/ml， 两者比较相差悬殊 成熟微血管内皮细胞在体外能很快进入增殖期，但 4-6周（8-10代）后增殖活力即逐渐下降。与此相 反，外周血、胎肝、骨髓来源的CD34+细胞在15-20 天后形成迅速生长的鹅卵石样内皮细胞层，并能稳 定传代30次以上，其增殖潜能是脐静脉内皮细胞的 10倍。Lin等发现骨髓来源的EPC与EC体外扩增能力 之比为50:1。
结
果
培养48小时，可见长梭形、三 角形、纺锤形或不规则形贴壁 细胞呈集落样生长 第9～11日，原代细胞汇合成 层，近似单层铺路石状排列
EPCs原代汇合时（×200） 第48小时（×200）
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AL PROGENITOR CELL AND AUTO BONE MARROW STEM CELL TRANSPLANTATION
(1)胚胎发育上的时空联系：在鼠胚7.5日龄、人胚13日龄胚外造血启动， 卵黄囊的胚外中胚层聚集成血岛（blood island）。位于血岛外层的细胞 分化成原始的血管内皮细胞，血岛中央的细胞则变成原始的造血细胞。 多个血岛腔隙相互联结成网状结构，形成原始血管床，此过程称之为血 管发生(vasculogenesis) 。 (2)造血细胞与血管内皮细胞共同具有众多细胞表面标记：SCL/TAL-1、 CD34、VEGFR-2、GATA-2、PECAM-1、Tie-1、Tie-2和CD133等 。 (3)某些胚胎源细胞的双系分化能力：有人用VE-cadherin从胚胎中分离 到不表达CD45和Ter119的“内皮细胞”，发现该细胞可产生包括T和B 淋巴细胞在内的造血细胞，证明了胚胎期内皮细胞系与造血细胞系的同 源性。同时有实验表明，小鼠、鹌鹑、鸡的胚胎干细胞、Flk-1+细胞、 Tie-2+细胞及VE-cadherin+细胞在不同生长因子刺激下可同时产生造血 和内皮系细胞
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血管内皮祖细胞（EPC）
来源（二） Reyes等人从人及啮齿类动物的骨髓中分离出一种多潜 能成体祖细胞（multipotent adult progenitor cell, MAPC），细胞表型为CD34-/HLA-DR-/CD133+/VEG FR-2+,同时胚胎干细胞表面标记Oct-4+。这种细胞增殖 80代未见衰老，同时单个MAPC既能分化为中胚叶的肢 芽组织细胞（脂肪细胞、基质细胞、成骨细胞等），又 能分化为中胚叶的内脏组织细胞（内皮细胞）。在VEGF 诱导下，能产生CD34+/VE-cadherin+/flk-1+细胞，后者 恰与EPC的表型一致 来源（三） CD45+的单核、巨噬细胞 来源（四） 循环于血液中脱落的内皮细胞
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血管内皮祖细胞（EPC）与 自体骨髓干细胞移植
吴英锋 谷涌泉 郭连瑞 张建
首都医科大学血管外科研究所 首都医科大学宣武医院血管外科
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意义：
（1）更正并充实了长期以来人们所认识的血管新生机制 （2）为缺血性疾病及恶性肿瘤的治疗提供了新的靶点
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血管内皮祖细胞（EPC）
分子标记及生物学特性
骨髓中的早期EPC尚不表达VE-cadherin和vW因子 ， 在成体外周血中发现的EPC是较成熟的EPC，基本失 去了CD133抗原但仍保留CD34 和VEGFR-2阳性， 外周血的EPC还以不同强度表达内皮系的其他标志 分子：CD31、CD146、VE-cadherin、vW因子和内 皮型NO合成酶等，成熟的血管内皮细胞（EC）则 高表达VEGFR-2、VE-cadherin和vW因子 CD133抗原的丢失标志着外周循环中的EPC在向着 成熟EC转化
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血管内皮祖细胞（EPC）
动员
Байду номын сангаас
不同祖系的细胞由骨髓释放到外周血称为动员 许多生长因子、酶、配基及表面受体调节EPC的动 员 基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的活化可能是动员的 第一步 其他促使动员的信号尚不清楚，但至少包括来自外 周的促血管生长因素 明显的例子包括肢体缺血、血管损伤、烧伤和冠脉 旁路术后循环中EPC数量的迅速增加，这些事件都 与内源性VEGF水平的增高有关
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技术路线
犬颈外静脉 酶法获取EC 2%明胶衬底 DMEM培养 原代汇合 继续培养 犬骨髓10～18ml(n=5) 梯度密度离心 获取单个核细胞(BMMNC) IMDM培养 接种24孔板玻片 原代汇合 继续培养 Fn衬底 EGM-2MV培养 原代汇合(平均10天) 传代，继续培养
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血管内皮祖细胞（EPC）
分子标记及生物学特性
从形态特征上不能与成熟血管内皮细胞区别 近年来发现 CD133在EPC表达而在成熟血管内皮细 胞则无表达 一般认为，早期EPC的三个表面标志性抗原： CD133、CD34和内皮细胞生长因子受体-2 （VEGFR-2）,后者在人类称KDR,在鼠类称flk-1
（1）根据EPC表型用免疫磁珠法获得。先用Ficoll液密度 梯度离心获取单个核细胞，然后用标记有相应细胞表面 抗体的免疫磁珠将单个核细胞中的带有特定表面抗原的 EPC筛选出来，一般选用CD34和/或CD133免疫磁珠 （2）贴壁法特定培养基分化分离EPC。通过密度梯度离 心得到单个核细胞后，把这些细胞接种在表面涂有胞外 基质（主要用Fn）培养容器里，使用添加有特殊生长因 子的培养基培养。这些特殊的促生长因子有VEGF、干细 胞生长因子（SCGF）、牛脑提取物以及复加bFGF、IGF、 EGF、ascorbic acid 的混合物
结
2.0
果 * *
原代汇合时，平均每毫 升骨髓可获细胞约 (1.3±0.3)×106 细胞生长曲线
MTT Value
1.5
1.0
第5代，细胞增殖明显 减缓
.5
ECs(n=12) 0.0 1 2 3 4 5 6 7 EPCs(n=12)
day
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图1 EPC的来源，AB代表angioblasts
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1997年Asahara等首先描述了循环于外周血中 的内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）。
应用免疫磁珠法首先从外周血分离CD34+细胞，经在纤 维连接蛋白（fibronectin, Fn）预衬的培养皿培养，这 些细胞转变成内皮特征细胞。
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血管内皮祖细胞（EPC）
分离
EPC可从脐带血及成体外周血、胎肝、骨髓中获取 目前，分离EPC的方法主要有以下两种
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血管内皮祖细胞（EPC）
来源（一） 普遍认为内皮细胞系与造血细胞系共同来源于中胚层 的一种共同祖先细胞——血液血管干细胞
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贴壁培养材料和仪器
EGM-2MV 培养液(包含5%FBS、VEGF、hFGF-b、hEGF、IGF-1、 Hydrocortisone和Ascorbic acid等) (Cambrex )，IMDM培养液 (Hyclone)，DMEM完全培养液(中日友好临床医学研究所)，FBS (Hyclone) Fibronectin (Sigma)， Histopaque-1077(Sigma)， MTT(Sigma)，Dil-ac-LDL (BTI) 抗Ⅷ因子单抗 (Zymed)，抗flk-1单抗(Santa Cruz)，抗CD133单 抗(Miltenyi Biotec) APC标记的CD34单抗(BD)，FITC标记的CD133单抗(R&D)，PE标记 VEGFR-2单抗(R&D) 酶标仪(Pasteur)，流式细胞仪(Becton Dickinson)，Olympus倒 置相差显微镜，Olympus普通光学显微镜，Nikon荧光显微镜 ， JEM-1010型透射电子显微镜(JEOL)
送FCM 第7日送FCM
3、7日免疫组化 爬片作免疫组化
第10日送FCM
Dil-ac-LDL摄取实验 生长曲线测定
TEM检测
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血管内皮祖细胞（EPC）
概念
EPC又称为血管母细胞/成血管细胞 （angioblast）,是指能分化为血管内皮细胞 的前体细胞，包括从血液血管干细胞 (hemangioblast)到成熟内皮细胞之间的多 个阶段的细胞。 换句话说，EPC是向成熟内皮细胞分化过程 中的具有特殊表型和特性的过渡细胞群体。
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血管内皮祖细胞（EPC）
较高的数量和迟发的高增殖潜能
实验证明，外周循环中成熟的EC数量极少，约 2.6±1.6（2-3）个/ml ，而EPC则约500-1000个/ml， 两者比较相差悬殊 成熟微血管内皮细胞在体外能很快进入增殖期，但 4-6周（8-10代）后增殖活力即逐渐下降。与此相 反，外周血、胎肝、骨髓来源的CD34+细胞在15-20 天后形成迅速生长的鹅卵石样内皮细胞层，并能稳 定传代30次以上，其增殖潜能是脐静脉内皮细胞的 10倍。Lin等发现骨髓来源的EPC与EC体外扩增能力 之比为50:1。
结
果
培养48小时，可见长梭形、三 角形、纺锤形或不规则形贴壁 细胞呈集落样生长 第9～11日，原代细胞汇合成 层，近似单层铺路石状排列
EPCs原代汇合时（×200） 第48小时（×200）
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(1)胚胎发育上的时空联系：在鼠胚7.5日龄、人胚13日龄胚外造血启动， 卵黄囊的胚外中胚层聚集成血岛（blood island）。位于血岛外层的细胞 分化成原始的血管内皮细胞，血岛中央的细胞则变成原始的造血细胞。 多个血岛腔隙相互联结成网状结构，形成原始血管床，此过程称之为血 管发生(vasculogenesis) 。 (2)造血细胞与血管内皮细胞共同具有众多细胞表面标记：SCL/TAL-1、 CD34、VEGFR-2、GATA-2、PECAM-1、Tie-1、Tie-2和CD133等 。 (3)某些胚胎源细胞的双系分化能力：有人用VE-cadherin从胚胎中分离 到不表达CD45和Ter119的“内皮细胞”，发现该细胞可产生包括T和B 淋巴细胞在内的造血细胞，证明了胚胎期内皮细胞系与造血细胞系的同 源性。同时有实验表明，小鼠、鹌鹑、鸡的胚胎干细胞、Flk-1+细胞、 Tie-2+细胞及VE-cadherin+细胞在不同生长因子刺激下可同时产生造血 和内皮系细胞
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来源（二） Reyes等人从人及啮齿类动物的骨髓中分离出一种多潜 能成体祖细胞（multipotent adult progenitor cell, MAPC），细胞表型为CD34-/HLA-DR-/CD133+/VEG FR-2+,同时胚胎干细胞表面标记Oct-4+。这种细胞增殖 80代未见衰老，同时单个MAPC既能分化为中胚叶的肢 芽组织细胞（脂肪细胞、基质细胞、成骨细胞等），又 能分化为中胚叶的内脏组织细胞（内皮细胞）。在VEGF 诱导下，能产生CD34+/VE-cadherin+/flk-1+细胞，后者 恰与EPC的表型一致 来源（三） CD45+的单核、巨噬细胞 来源（四） 循环于血液中脱落的内皮细胞
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血管内皮祖细胞（EPC）与 自体骨髓干细胞移植
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分子标记及生物学特性
骨髓中的早期EPC尚不表达VE-cadherin和vW因子 ， 在成体外周血中发现的EPC是较成熟的EPC，基本失 去了CD133抗原但仍保留CD34 和VEGFR-2阳性， 外周血的EPC还以不同强度表达内皮系的其他标志 分子：CD31、CD146、VE-cadherin、vW因子和内 皮型NO合成酶等，成熟的血管内皮细胞（EC）则 高表达VEGFR-2、VE-cadherin和vW因子 CD133抗原的丢失标志着外周循环中的EPC在向着 成熟EC转化
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血管内皮祖细胞（EPC）
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不同祖系的细胞由骨髓释放到外周血称为动员 许多生长因子、酶、配基及表面受体调节EPC的动 员 基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的活化可能是动员的 第一步 其他促使动员的信号尚不清楚，但至少包括来自外 周的促血管生长因素 明显的例子包括肢体缺血、血管损伤、烧伤和冠脉 旁路术后循环中EPC数量的迅速增加，这些事件都 与内源性VEGF水平的增高有关
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技术路线
犬颈外静脉 酶法获取EC 2%明胶衬底 DMEM培养 原代汇合 继续培养 犬骨髓10～18ml(n=5) 梯度密度离心 获取单个核细胞(BMMNC) IMDM培养 接种24孔板玻片 原代汇合 继续培养 Fn衬底 EGM-2MV培养 原代汇合(平均10天) 传代，继续培养
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血管内皮祖细胞（EPC）
分子标记及生物学特性
从形态特征上不能与成熟血管内皮细胞区别 近年来发现 CD133在EPC表达而在成熟血管内皮细 胞则无表达 一般认为，早期EPC的三个表面标志性抗原： CD133、CD34和内皮细胞生长因子受体-2 （VEGFR-2）,后者在人类称KDR,在鼠类称flk-1
（1）根据EPC表型用免疫磁珠法获得。先用Ficoll液密度 梯度离心获取单个核细胞，然后用标记有相应细胞表面 抗体的免疫磁珠将单个核细胞中的带有特定表面抗原的 EPC筛选出来，一般选用CD34和/或CD133免疫磁珠 （2）贴壁法特定培养基分化分离EPC。通过密度梯度离 心得到单个核细胞后，把这些细胞接种在表面涂有胞外 基质（主要用Fn）培养容器里，使用添加有特殊生长因 子的培养基培养。这些特殊的促生长因子有VEGF、干细 胞生长因子（SCGF）、牛脑提取物以及复加bFGF、IGF、 EGF、ascorbic acid 的混合物
结
2.0
果 * *
原代汇合时，平均每毫 升骨髓可获细胞约 (1.3±0.3)×106 细胞生长曲线
MTT Value
1.5
1.0
第5代，细胞增殖明显 减缓
.5
ECs(n=12) 0.0 1 2 3 4 5 6 7 EPCs(n=12)
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图1 EPC的来源，AB代表angioblasts
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1997年Asahara等首先描述了循环于外周血中 的内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）。
应用免疫磁珠法首先从外周血分离CD34+细胞，经在纤 维连接蛋白（fibronectin, Fn）预衬的培养皿培养，这 些细胞转变成内皮特征细胞。
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血管内皮祖细胞（EPC）
分离
EPC可从脐带血及成体外周血、胎肝、骨髓中获取 目前，分离EPC的方法主要有以下两种
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血管内皮祖细胞（EPC）
来源（一） 普遍认为内皮细胞系与造血细胞系共同来源于中胚层 的一种共同祖先细胞——血液血管干细胞
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贴壁培养材料和仪器
EGM-2MV 培养液(包含5%FBS、VEGF、hFGF-b、hEGF、IGF-1、 Hydrocortisone和Ascorbic acid等) (Cambrex )，IMDM培养液 (Hyclone)，DMEM完全培养液(中日友好临床医学研究所)，FBS (Hyclone) Fibronectin (Sigma)， Histopaque-1077(Sigma)， MTT(Sigma)，Dil-ac-LDL (BTI) 抗Ⅷ因子单抗 (Zymed)，抗flk-1单抗(Santa Cruz)，抗CD133单 抗(Miltenyi Biotec) APC标记的CD34单抗(BD)，FITC标记的CD133单抗(R&D)，PE标记 VEGFR-2单抗(R&D) 酶标仪(Pasteur)，流式细胞仪(Becton Dickinson)，Olympus倒 置相差显微镜，Olympus普通光学显微镜，Nikon荧光显微镜 ， JEM-1010型透射电子显微镜(JEOL)
送FCM 第7日送FCM
3、7日免疫组化 爬片作免疫组化
第10日送FCM
Dil-ac-LDL摄取实验 生长曲线测定
TEM检测
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AL PROGENITOR CELL AND AUTO BONE MARROW STEM CELL TRANSPLANTATION
血管内皮祖细胞（EPC）
概念
EPC又称为血管母细胞/成血管细胞 （angioblast）,是指能分化为血管内皮细胞 的前体细胞，包括从血液血管干细胞 (hemangioblast)到成熟内皮细胞之间的多 个阶段的细胞。 换句话说，EPC是向成熟内皮细胞分化过程 中的具有特殊表型和特性的过渡细胞群体。