环状糊精葡萄糖基转移酶的研究

α-环状糊精生成酶的研究

材料和方法

环状糊精是由葡萄糖经α-1,4键首尾相连成环状结构的一组化合物。通常由6、7和8个葡萄糖残基组成，分别命名为α-、β-和γ-环状糊精。其环状分子结构可以包接其它化合物分子，形成包接化合物，使被包接的物质与外界环境隔绝，具有抗氧化、抗挥发、抗光分解、掩盖异味等作用，因此环状糊精广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。β-环状糊精在水中的溶解度较低，应用受到一定的限制；α-和γ-环状糊精在水中的溶解度较高，更便于使用。我国目前仅有β-环状糊精实现工业化生产，α-环状糊精曾有人进行过一些研究，尚未投入生产。我们通过紫外线照射，使一株主要生产β-环状糊精的嗜碱芽孢杆菌发生变异，获得一株产α-环状糊精在50%以上的突变株。并对该突变株所产生的环状糊精生成酶(Cyclomaltodexdrin glucanotransferase,，简称CGTase)。的性质进行了研究，本文将报道研究结果。

一. 材料

菌种：

α-CD、β­CD：购自Sigma公司。其余试剂均为国产市售分析纯

二．方法：

（一）酶活力的测定

在10mL比色管，加0.3%可溶性淀粉0.2mL，0.2mol/L，pH10.0的硼酸缓冲液0.2ml，置40℃水浴中预热10分钟，加适当稀释的酶液0.1mL，准确反应10分钟。加4%的醋酸溶液0.5mL，然后加入0.0004mol/L的I2液3mL，摇匀，用蒸馏水定容至10mL。立即在700nm 处用光程1cm的比色杯测定吸光度A，以蒸馏水代替酶液作空白对照，测定淀粉液的吸光度A0。

酶活力的定义：在上述条件下，以使淀粉吸光度降低10%所需的酶量定义为一个酶的活力单位。

（A0-A）

酶活力u/mL == ————-×100×稀释倍数

A0

（二）环状糊精的测定：

1.纸层析定性测定

展开剂：65%正丙醇

显色剂：0.2%碘丙酮溶液

上行法，展开两次。显色后α-CD呈紫色，β-呈黄色，γ-呈褐黄色。

2. 比色法定量测定

⑴试剂

①3.75×10-3mol/L酚酞溶液

精确称取105℃烘干的酚酞0.0597克，溶解于95%的乙醇中，定溶至50mL。置4℃左右冰箱保存。使用前用蒸馏水稀释10倍。

②4×10­2mol/L碳酸钠溶液

精确称取105℃烘干的无水碳酸钠1.0599g，用新煮沸冷却后的蒸馏水溶解并定容至250mL。

③α-CD标准溶液

精确称取105℃烘干的α-CD20mg，用新煮沸并冷却的蒸馏水溶解并定容至25mL。

⑵标准曲线的制作：

在25mL的比色管中，各管分别加入α―CD标准溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL；酚酞工作液2.0mL；振荡1分钟后，加入4×10­2mol/L的Na2CO3溶液2.5mL；补加蒸馏水至刻度。立即在721分光光度计上于550nm处测吸光度E DF。以不加α―CD为对照测定酚酞的吸光度E F，以吸光度减少值△E（△E=E F-E DF）为纵坐标，α―CD浓度为横坐标作标准曲线。

⑶转化液环状糊精浓度的测定

转化液稀释100倍，取2.0mL稀释液，加酚酞工作液2.0mL，振荡1分钟后，加碳酸钠溶液2.5mL。按上述操作测定，并计算△E，从标准曲线上查出CD浓度，计算转化液的CD含量

（三）转化液淀粉浓度的测定

精确吸取转化液0.5mL，加3N盐酸10mL，煮沸水解3分钟，加酚酞指示剂2滴，用2 NaOH中和至中性，用碘量法测定总糖含量，折算成淀粉浓度。

（四）转化率的测定

由上述方法测得转化液的CD含量和淀粉浓度，按下列公式计算：

CD含量

转化率%=——————×100%

淀粉浓度

结果和讨论

一．酶的性质

1．温度对酶活力的影响：

在不同温度测定酶液活力，结果见图1。图1显示该酶的最适温度为50℃。

2．温度稳定性：

将酶液在不同温度下，保温放置22小时后，测定残余活力，结果绘于图2。图2显示该酶在45℃以下稳定。

3．pH对酶活力的影响

用不同pH值的缓冲液测定酶活力，结果见图3。图3结果显示，酶的最适pH为11。

4．酶的pH稳定性

将酶置于不同pH值的缓冲液中，在20℃保温放置24小时后测定酶活力，结果如图4。由图4可见，酶在pH8.0—12的范围内稳定。

5．金属离子对酶活力的影响

各种金属离子分别配成0.005 mol/L。酶液用各种金属离子的溶液适当稀释后。

测定酶活力。以不加金属离子时的酶活力为100%。结果如下表1。表1显示Li、Al和Ca 对酶有激活作用；Ba2+和Fe3+对酶有严重抑制；Ag+、Zn2+、Cu2+、Fe2+对酶有一定的抑制作

6. 酶的K m和V max值

用不同浓度的底物测定反应初速度。按Lineweaver-Burk双倒数法作图，求得K m= V max为

上述结果显示，该菌株产生的环状糊精酶在45℃以下pH8-12活力稳定，最适pH在酶的pH稳定范围以内，转化pH可控制在最适pH附近，因此确定转化淀粉制备环状糊精的

条件为pH10-11，温度40℃。

转化液层析结果见图6。