快繁技术

2 兰花的遗传转化
兰花基因工程研究起步晚, 主要是因为兰科植 物对根癌农杆菌或发根农杆菌不敏感, 缺乏合适的 表达载体, 而一些直接转移的方法如 PEG 介导和 电激法成功率不高[ 16] 。目前报道的兰花的遗传转 化主要通过两种方式进行: 农杆菌介导法和基因枪 转化法, 其中基因枪转化法应用较多, 成功率也较 前者高一些。 211 靶材料
兰花遗传转化中常用的选择标记基因有潮霉 素磷酸转移酶基因( hpt ) 和新霉素磷酸转移酶基因 ( neo) , 选择培养中则相应地使用潮霉素(Hyg) 和卡 那霉素( Km) 作为选择剂 。兰花对普遍使用的一些
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抗生素如卡那霉素存在天然抗性, 因此常需要高于 500mgPL 的 Km 来筛选转化细胞[ 24] 。较低浓度的选 择压力导致假阳性率增加, 抗生素浓度过高又必然 对植物造成一定程度的伤害。Knapp 等[ 25] 报道使 用 bar 基因作为三个不同属兰花 ( Cattleya, Brassia, Porituenopsis) 转化的选择标记基因, 以 bialaphos 为 选择剂, 获得了选择效率较高的转化植株, 此选择 系统可用于各属兰花。You 等[ 26] 报道使用甜椒的 铁氧还 蛋白 类 似基 因( ferredoxin2like protein ( pflp ) gene) 作 为 选 择 标 记 基 因, 以 胡 萝 卜 欧 式 杆 菌 ( Erwinis carotovora ) 作为选择剂筛选兰花转化子, 结 果表明转基因兰花植株对胡萝卜欧式杆菌显示较
兰花是兰科植物的统称, 一种宿根性的多年生 草本花卉。兰科植物种类繁多, 全世界约有 800 个 属, 25000 个种[ 1] 。兰科植物大多为观赏类花卉, 有 极高的观赏价值, 有些种类如白芨、天麻等具有极 高的药用价值。由于兰花种子细小, 且需相关共生 菌共同作用才能萌发生长, 人工培育成苗率低, 而 分株繁殖周期长, 繁殖率低, 因此可以将优良单株 通过组织培养在短期内大批量扩繁, 获得品质优良 的群体。目前, 兰花是观赏花卉中依靠组织培养繁 殖种苗的最重要种类, 其组培苗的数量约占观赏植 物组培苗总量的 40% [ 2] 。成熟的组织培养体系是 进一步遗传转化的基础, 随着组织培养技术在兰花 中的广泛应用, 兰花的基因工程研究也取得了很大 进展。
兰花的培养方式包括固体培养、半固体培养和
液体培养三种。本实验室比较了固体培养和液体
培养对大花蕙兰圆球茎增殖与分化的影响, 发现利 用固体培养基培养圆球茎增殖速度慢, 继代不及时 易分化出芽, 较适合于芽和根的分化培养; 液体振 荡培养增殖较快, 一般 10 天左右就可见每个圆球 茎周围又新长出 2~ 3 个小球茎, 可成倍地降低成 本, 大大减少兰花固体培养中常见的褐化现象, 但 生长不够健壮, 色淡, 质地较疏松, 玻璃化 比率较 高。杨玉珍等[ 13] 认为半固体培养 基( 减少琼脂用 量) 最佳, 圆球茎增殖量大, 色深绿, 健壮。作者认 为在整个快繁生产过程中, 可以采用上述几种培养 方式相结合的方法, 即利用半固体培养或液体培养 进行圆球茎增殖, 利用固体培养分化和生根, 增加 繁殖系数, 降低污染, 减少成本, 利于大规模生产。
培养基中添加的植物生长调节剂的种类、配比
和浓度对圆球茎增殖与分化起主导作用。在种子 萌发及芽诱导中, 生长素使用浓度范围较大( 011~ 510 mgPL) , 其浓度一般高于细胞分裂素, NAA 诱导 效果好于 2, 42D 和 62BA[ 16] 。大花蕙兰对 KT 的敏 感程度高于对 62BA 的敏感程度, 相同浓度的 NAA 下, KT 用量稍微增减即会产生明显差异, 低浓度的 KT 对圆球茎增殖有 明显促进作 用, 高于 011mgPL 则会抑 制其生长[13] 。而 卡特丽亚 兰的培养 中, 62 BA 对其圆球茎诱导及增殖却非常有效, KT 与其相 比效应弱得多[ 6] 。丁 兰等[ 6] , 彭晓明等[ 4] 报道, 降 低细胞分裂素浓度或适量增高生长素浓度, 促进圆 球茎分化, 尤其在无激素的培养基上, 圆球茎分化 率极高, 很快均匀分化出苗和根。
内的幼茎切段, 是组培快繁中常用的材料, 且容易 成功, 变异较小, 性状均一, 繁殖速度快[ 2] 。不论以 何种器官为外植体, 兰花组织培养基本都通过这样 的再生途径: 外植体 y 圆球茎 y 丛生圆球茎 y 分化 成苗。原球茎( protocorm) 为兰科等少数植物专有, 最初指兰花种子发芽过程中胀大的圆锥状胚, 本身 可以增殖, 以后能萌发出小植株。在兰花的组织培 养中, 从顶芽、侧芽组织和种子中萌发的植株器官 培养, 都能诱导出类似原球茎的胚性组织, 即圆球 茎( protocorm2like bodies, PLBs) [ 2] 。
高抗性, pflp 基因可作为兰花基因工程的抗性选择 标记基因。这对避免目前遗传转化中大量使用抗
生素对植物及生态环境所造成的危害有十分重要
的意义。 许多兰花遗传转化的报道中, 以 GUS 基因为
报告基因。GUS 具良好的稳定性, 灵敏度高, 易于 检测, 是目前植物基因工程研究工作中使用最广泛 的一种报告基因[ 27] 。利用 GUS 报告系统已经建立 了石斛兰[ 18,20, 28, 29] 、蝴蝶兰[ 23, 30,31] 、大花蕙兰[ 24] 与文 心兰[ 32] 的农杆菌介导遗传转化体系或基因枪直接
通过切割圆球茎可以加速兰花的繁殖与分化有很大影 响。杨玉珍等[ 13] 对大花蕙 兰进行了随机 分切、纵
切、碾压、井字型切割法研究, 20 天后观察, 随机分 切法虽操作快捷, 但有大量切割过于碎小的培养块 死亡; 纵切 法操作细致、费时, 但 圆球茎增 殖数量 多, 大小一致; 碾压和井字型切割( 底部不分开) 圆 球茎增殖时间可缩短, 可加快继代, 但单个继代圆 球茎增殖倍数减少。张菊野等[ 14] 除采用上述方法
外, 还采用了掰开法( 即将大丛圆球茎顺势掰散成 小丛或单个) , 以掰开法对圆球茎的损伤最小, 增殖
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吕永杰 等: 观赏兰科植物组培快繁及遗传转化的研究进展
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效果也最佳。Amaki 等[ 15] 对杂种兰圆球茎纵切后 却发现此种切割方式可促进其形成苗。 112 培养基
兰科不同属植物的最适基本培养基各不相同, 常用的基本培养基为 MS, KC 及 VW。杨玉珍在对 大花蕙兰进行增殖培养时, 发现 MS, 1P2MS, VW, KC 均可用于圆球茎增殖, 但以 KC 效果最佳[ 13] 。而蝴 蝶兰的组培快繁中则以 MS 居多, 效果也好[ 7~ 9] 。
第 23 卷第 10 期
中 国生 物 工 程 杂 志
CHINA BIOTECHNOLOGY
2003 年 10 月
观赏兰科植物组培快繁及遗传转化的研究进展*
吕永杰1 李仕贵1* * 周晓禾2
( 1 四川农业大学 成都 温江 611130 2 四川西周科技有限公司 成都 温江 611130)
摘要 兰花作为一种高档花卉, 近年来其组培快繁和基因工程研究取得了比较大的进展。综述 的观赏兰科植物组织培养内容包括外植体、培养基及培养方式等, 遗传转化内容包括靶材料、选 择标记基因、报告基因、启动子和转化方法等并总结了兰科植物基因工程研究的成果、最新进展 及存在的问题。 关键词 兰科 圆球茎 组织培养 遗传转化
兰花遗传转化主要以圆球茎、愈伤组织或幼胚 作为靶材 料。圆球茎易 诱导, 转 化后也易 分化成 苗, 但圆球茎和幼胚遗传转化后易产生嵌合体, 不 利于鉴定筛选[ 18~ 22] , 且幼胚也不容易获 得。胚性 愈伤组织是比较好的靶材料, 遗传转化后不必经历 胚胎发生阶段, 可直接得到再生植株, 在此过程中, 非转化 细 胞 可 以 更有 效 地 被 去 除[ 18] 。Griesbach 等[ 21] 曾使用 花粉和 幼胚作 为靶 材料进 行遗 传转 化, 但只有幼胚产生了转化子; Belarmino 等[ 23] 使用 悬浮细胞为靶材料成功地转化了蝴蝶兰; Tee 等[ 22] 使用不同类型的愈伤组织及离体诱导的花序顶端 组织作靶材料对 石斛兰中的一个种 Sonia 17 进行 转化, GFP 的表达率都较高, 但后期培养中, 以花序 顶端 组 织为 靶 材 料轰 击 的 个体 成 活 率低 ( 低于 50% ) 。 212 选择标记基因及报告基因
Chia 等[ 19] 以 荧 光 素 酶 基 因 ( firefly luciferase gene) 作为石斛兰遗传转化的选择标记基因兼报告 基因。转化 3 周后的圆球茎切成约 2mm 的小块, 培养在含有荧光素的培养基 中, 并放于摄影2光电 倍增系统的暗盒中检测发光细胞。高倍解剖镜下
将发光细胞与其它细胞分离后继续培养 3 周, 该检 测2分离过程重复 3 次, 仅 8 个月即得到石斛兰转 化株, 缩短了筛选时间, 提高了选择效率。 213 启动子
蔗糖是植物组织培养中的首选碳源。曾宋君 等在蝴蝶兰[ 8] 、墨兰[ 11] 、石斛兰[ 17] 的组织 培养中, 以白糖、片糖代替蔗糖进行实验, 发现白糖与片糖 的效果比蔗糖 还好, 大大 降低了快繁生 产中的成 本。由于以糖作 碳源极易引起微生物污 染, 20 世 纪 80 年代末期, 古在丰树首次提出了无糖培养微 繁殖和闭锁型种苗生产的理念, 目前已为美、英、韩 等国家应用于生产, 但在我国的应用还较少。其不 同之处在于培养基中不再加糖, 组培苗由玻璃瓶内 培养改为箱式大容器培养, 输入可控制量的 CO2 气
转化体系。近年来, 绿色荧光蛋白基因( GFP ) 作为 一种新型的报告基因开始在植物基因转化及基因
表达调控研究中得到应用, 并显示出较其他报告基 因更大的优越性: 无需底物、酶、辅因子等物质; 便 于活体 检测; 检 测时只 需光 照, 对细 胞 无毒 害作 用[ 33] 。由于兰花愈伤组 织较其他植物生 长缓慢, 且增殖率低, 因此使用对植物无毒害的 GFP 报告 系统十分适用于兰花的遗传转化, 在基因枪轰击转 化石斛兰后第 2 天即达到最高的表达率[ 22] 。