生物合成药物学(第七章)

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二、发酵液的预处理和固液分离 1. 发酵液的预处理（抗生素为例） （1）控制PH和一些高价金属离子的去除 草酸：改变发酵液胶体状态和去除Ca离子， 三聚磷酸钠：可去除Mg离子等 黄血盐：可去除Fe离子等 （2）杂蛋白质的去除 等电点沉淀法、变性沉淀法、加各种沉淀剂、加絮凝剂 （3）多糖的去除 酶将其转化为单糖，降低粘度，提高虑速 （4）有色物质的去除 离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等 2. 发酵液的固液分离 过滤：真空鼓式过滤机和板框压滤机 离心：管式离心机、叠片式离心机和三项倾析离心机
色谱柱
检测器
W aters 486
进样器
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Biosynthetic pharmaceutics 3. 离子交换操作条件的选择 操作过程：交换吸附、洗脱（解吸）和树脂再生 交换吸附：选取溶液在交换过程的PH值是该操作的基本 条件； 洗脱（解吸）：是吸附的逆过程，洗脱条件和吸附条件 相反，在酸性下吸附应在碱性条件下洗脱，在碱性条 件下吸附应在酸性条件下洗脱； 树脂再生：让使用过的树脂重新获得使用性能的处理过 程。
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第七章 生物合成药物的分离纯化工程学基础
一、概述 生物合成药物的分离纯化，其目的在于从发酵液或培 养液中分离纯化成具有一定纯度、符合药典或其他法 定标准规定的各种药物，又称发酵液的后处理或下游 加工过程。这是生物工程中的一个重要组成部分，它 不但决定产品的质量和安全性，也决定着产品的收率 与成本。 1. 生物合成药物的一般分离纯化方法 发酵液 预处理固液分离 初步纯化（提取） 高度 纯化（精制） 成品加工
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微生物细胞的破碎 机械法：高压匀浆法、高速珠磨法、超声波法 非机械法：化学渗透法、酶解法、冻结－融化法、干燥法等。 三、溶剂萃取法 传质速度快、分离效率高、便于连续操作和自动控制等优点。抗生 素、有机酸、维生素和甾体激素等均用此法。 1. 影响萃取的因素 PH值、温度、盐析作用、溶剂的选择 2. 反应萃取：抗生素的提取 3. 双水相萃取：蛋白质、酶、核酸的等生物大分子 4. 反胶束萃取：酶和活性蛋白质等生物物质 5. 超临界流体萃取：CO2、氨、水等
Biosynthetic pharmaceutics 影响盐析的因素 盐析剂的种类和数量: MgSO4,(NH4)2SO4,Na2SO4,NaH2PO4； 盐析的温度与PH值： 以不降低酶活为原则，多数在常温下进行盐析，在等电点 处沉淀； 溶液中的杂质： 以最大可能沉淀出需要的酶为原则。 2. 有机溶剂沉淀法 定义：在水溶液中加入一定量亲水性有机溶剂，以降 低溶质的溶解度，使其沉淀析出的方法； 应用范围：蛋白质、酶、核酸、多糖等物质的分离；
3.
Biosynthetic pharmaceutics 四、离子交换法 是利用某些生物药物能在溶液中形成带电粒子，与合 成离子交换树脂之间结合力的差异来进行分离的方法。
Biosynthetic pharmaceutics 1. 离子交换树脂的分类 强酸性阳离子交换树脂(-SO3H) 弱酸性阳离子交换树脂(-COOH,酚羟基） 强碱性阴离子交换树脂（三甲氨基等） 弱碱性阴离子交换树脂（-NH2,-NHR等） 2. 树脂和操作条件的选择 树脂选择：强碱性产物宜选用弱酸性树脂、弱碱性产物 宜选用强酸性树脂、强酸性产物宜选用弱碱性树脂、 弱酸性产物宜选用强碱性树脂
五、吸附法
吸附法是利用一些吸附剂，在适宜的PH条件下，使发酵 液中所需的产物被吸附剂吸附，然后再用适当的洗脱剂将 产物解吸，以达到浓缩和提纯的目的。 吸附的类型 物理吸附、化学吸附、离子交换吸附。 影响吸附的因素 吸附剂的性质、吸附物的性质、溶剂和温度的影响、PH值 和其他组分的影响。 几种常见的吸附剂 按化学结构分：有机吸附剂如活性炭、纤维素、聚酰胺、 大孔树脂等；无机吸附剂如白土、氧化铝、硅藻土等。
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七、色谱分离法（层析法）
优点：分离效率高、设备简单、操作方便，无需加热等。 1. 色谱分离法的分类及操作方式 （1）色谱法的分类 按两相所处的状态 液相色谱：以液相作为流动相 气相色谱：以气相作为流动相
Biosynthetic pharmaceutics 按分离过程的机理 吸附色谱：依靠各组分对固定相的吸附力不同而分离； 分配色谱：依靠各组分在两相的分配系数不同而分离； 离子交换色谱：依靠各组分对离子交换剂的化学亲和力 不同而分离； 凝胶色谱：依靠各组分的分子大小或形状不同而分离。 按操作形式分 柱色谱：将固定相装在柱内，使混合物溶液沿一个方向 移动而得以分离,如HPLC； 纸色谱：用滤纸作为固定相载体，混合物溶液点样后， 用流动相展开，以达到分离鉴定的目的； 薄层色谱：在玻璃板（或其他材料）上涂布固体粉末薄 层为固定相，点样后用流动相展开，以达到分离鉴定 的目的。
Biosynthetic pharmaceutics （2）色谱分离法的进行方式 洗脱法：应用于柱色谱法中； 展开法：应用于纸色谱和薄层色谱法。
八、结晶与重结晶 制备纯物质的有效方法，应用于许多抗生素、 维生素、氨基酸等生物药物的提纯。 结晶步骤：过饱和溶液的形成、晶核的生成、 晶体的成长。 重结晶：将晶体用合适的溶剂溶解后再次进行 结晶，以提高纯度。
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六、沉淀法
优点：简单、经济、浓缩倍数高等。 应用范围：抗生素、氨基酸、酶、多肽、蛋白质、核酸等的提 取分离 1. 盐析法 定义：在高浓度中性盐存在下，他们在水溶液中的溶解度降 低而产生沉淀。 应用范围：主要适用于酶、蛋白质等生物大分子。 优点：无机盐不易引起蛋白质的变性失活，非蛋白质杂质很 少沉淀，设备简单，操作方便。
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（1）发酵液的预处理与固液分离 预处理：酸化、加热降低发酵液的粘度，或加入絮凝剂使生物细 胞或溶解的大分子杂质聚集成较大的颗粒，便于沉降除去。 分离方法：过滤和离心分离 （2）初步纯化 吸附法、离子交换法和溶剂萃取法：抗生素等小分子物质的提取； 沉淀法：蛋白质类生物活性物质的提取，也可用于抗生素等小分子 物质的提取（起浓缩作用，但纯化的效果较差）； 双水相萃取和反胶束萃取：酶和蛋白质类生物药物的提取和分离； 超临界萃取：食品工业和生物工程； 超虑：大分子物质的脱盐与浓缩。 （3）高度纯化（精制） 离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、聚焦层析、疏水层析等。 （4）成品加工 浓缩和结晶， 产物为注射用：在结晶前进行除菌和去热原（加入 活性炭吸附经石棉虑板过滤），产品为固体须干燥。
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九、成品干燥
1. 直接干燥 气流干燥、喷雾干燥、沸腾干燥等。 2. 间接干燥 真空干燥、冷冻干燥、辐射干燥（红外线及远红外干 燥）。 3. 介电干燥 高频干燥和微波干燥。
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色谱泵及控制器
数据处理及控制
Biosynthetic pharmaceutics 4. 应用实例 庆大霉素的提取和纯化： 苯乙烯强酸性阳离子交换树脂 吸附（PH7－7.5） 洗涤树脂 洗脱（1mol/L氨水） 树脂脱色 浓缩 酸化（PH4.5－5.5） 活性炭脱色 无菌喷雾干燥 成品
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Biosynthetic pharmaceutics 特点：分辨率高于盐析沉淀法，溶剂沸点较低回收方便， 但易使蛋白质变性失活，通常在低温下操作，以减少 变性作用。 影响沉淀的因素 溶剂的种类和用量：甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮等； 温度与PH值：低温有利于沉淀，提高收率，PH值在等电 PH PH 点附近较好； 3. 等电点沉淀 此法主要应用于两性电解质产物，并且在等电点时溶 解度很低的产物，如谷氨酸、四环素等。 4. 其他沉淀方式 形成难溶性盐或复合物的沉淀法、加高分子聚合物沉 淀。