浙江大学细胞培养-基本技术
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外植块培养步骤图解 .
操作步骤1 --- 取材
• 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。 • 把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出
后放在大平皿中携入超净台。
• 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌
镊子将皮肤扯向后腿。
• 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫
，置于无菌的培养皿上。
• 幼稚状态的组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的
脏器等更容易进行原代培养
.
意义
• 原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生
很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出 原来组织的特性。
• 利用原代培养做各种实验（药物测试、细胞分化及病毒学
方面）效果很好。
• 原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。
。
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胰酶消化法操作步骤 --- 消化、接种培养
也可将此步骤简化为：
• 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40
min，每隔5 min振荡一次。
• 静置，吸去上清，用细胞生长液漂洗消化后的组织块，用
吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组 织块下沉。
• 取细胞悬液接种至加了细胞生长液的培养瓶中（调整细胞
营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或1:3以上的比 率转移到新的容器中进行培养，即为传代培养。
• 也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各
种实验的必经过程。
• 悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
.
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1. 悬浮生长细胞传代 • 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再
能附着在培养瓶壁上，2-4 d就可在瓶内 形成单层，需要再次进行传代
细胞培养基本技术
培养技术 细胞系的建立和鉴定 培养物的固定、染色
显微镜观察
.
1、细胞培养技术
细胞原代培养 细胞传代培养 细胞冻存和复苏
细胞的运输
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1.1 细胞的原代培养
• 是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人
工条件下培养使其生存并不断生长繁殖的方法。 借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的 接触抑制、细胞的衰老、死亡等生命现象。
混匀传代。
• 直接传代法：悬浮细胞慢慢沉淀在瓶壁后，将上清培养液去除1/2-
2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
2. 半悬浮生长细胞传代（HeLa细胞） • 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使
细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
3. 贴壁生长细胞传代
• 采用酶消化法传代。常用消化液是0.25％胰蛋白酶液。
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消化法传代培养步骤
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贴壁生长细胞传代方法
选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯 旁，倒去瓶中的旧培
养液，加入2-3 ml的D- Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在 细胞表面的碎片(思考：还有什么作用？）
加入适量0.1-0.25％胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察
，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液
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原代细胞培养的实验目的和要求
• 掌握无菌操作技术 • 了解小鼠解剖操作技术 • 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 • 了解培养细胞的消化分散 • 了解倒置显微镜的使用
.
实验材料
• 实验动物：孕鼠或新生小鼠 • 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）
0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇
• 器材：灭菌镊子、剪刀、灭菌培养皿、细胞培养
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原代细胞培养结果
• 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长 • 如接种的细胞密度适宜，5-7 d即可形成单层
.
1.2 传代细胞培养
• 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或
倍增不同。在一代中，细胞培增3-6次
• 培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起
用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬
液。
以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻
轻摇匀， 37 ℃CO2培养箱培养。
观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。
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传代细胞培养结果
• 一般情况，传代后的细胞在2 h时左右就
• 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将
胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
• 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎
直至清洗液清亮为止。
.
操作步骤2 ---切割
• 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡
盐溶液漂洗。
• 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到
成1 mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗， 洗到组织块发白为止。
• 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃上清。
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胰酶消化法操作步骤 --- 消化、接种培养
• 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40 min，每隔5 min
振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
• 加入3-5 ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 • 静置5-10 min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 • 1000 rpm，离心5-10 min，弃上清液。 • 加入平衡盐溶液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 • 加入细胞生长液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。 • 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37 ℃下培养
浓度到5×105/ml左右），37 ℃下培养。 （注意：省略了离心、计数等步骤）
.
组织块直接培养法操作步骤
• 组织块接种：
– 将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。 – 翻转瓶底朝上，将细胞生长液加至瓶中，培
养液勿接触组织块。 – 37 ℃静置3-5 h，轻轻翻转培养瓶，使组织
浸入细胞生长液中（勿使组织漂起），37 ℃ 继续培养。
瓶、小瓶、烧杯、吸管、酒精灯
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原代细胞培养方法
冷消化
• 胰酶消化法 温消化
• 组织块直接培养法
一次性消化 分次消化
消化法：采用无菌操作的方法，把组织（或器官） 从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞 ，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。
Βιβλιοθήκη Baidu
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原
代
贴块法
培
养
方
法
分
类
消化法
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消化法的分类 分次消化
外植块培养步骤图解 .
操作步骤1 --- 取材
• 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。 • 把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出
后放在大平皿中携入超净台。
• 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌
镊子将皮肤扯向后腿。
• 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫
，置于无菌的培养皿上。
• 幼稚状态的组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的
脏器等更容易进行原代培养
.
意义
• 原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生
很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出 原来组织的特性。
• 利用原代培养做各种实验（药物测试、细胞分化及病毒学
方面）效果很好。
• 原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。
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胰酶消化法操作步骤 --- 消化、接种培养
也可将此步骤简化为：
• 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40
min，每隔5 min振荡一次。
• 静置，吸去上清，用细胞生长液漂洗消化后的组织块，用
吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组 织块下沉。
• 取细胞悬液接种至加了细胞生长液的培养瓶中（调整细胞
营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或1:3以上的比 率转移到新的容器中进行培养，即为传代培养。
• 也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各
种实验的必经过程。
• 悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
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细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1. 悬浮生长细胞传代 • 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再
能附着在培养瓶壁上，2-4 d就可在瓶内 形成单层，需要再次进行传代
细胞培养基本技术
培养技术 细胞系的建立和鉴定 培养物的固定、染色
显微镜观察
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1、细胞培养技术
细胞原代培养 细胞传代培养 细胞冻存和复苏
细胞的运输
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1.1 细胞的原代培养
• 是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人
工条件下培养使其生存并不断生长繁殖的方法。 借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的 接触抑制、细胞的衰老、死亡等生命现象。
混匀传代。
• 直接传代法：悬浮细胞慢慢沉淀在瓶壁后，将上清培养液去除1/2-
2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
2. 半悬浮生长细胞传代（HeLa细胞） • 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使
细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
3. 贴壁生长细胞传代
• 采用酶消化法传代。常用消化液是0.25％胰蛋白酶液。
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消化法传代培养步骤
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贴壁生长细胞传代方法
选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯 旁，倒去瓶中的旧培
养液，加入2-3 ml的D- Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在 细胞表面的碎片(思考：还有什么作用？）
加入适量0.1-0.25％胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察
，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液
.
原代细胞培养的实验目的和要求
• 掌握无菌操作技术 • 了解小鼠解剖操作技术 • 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 • 了解培养细胞的消化分散 • 了解倒置显微镜的使用
.
实验材料
• 实验动物：孕鼠或新生小鼠 • 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）
0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇
• 器材：灭菌镊子、剪刀、灭菌培养皿、细胞培养
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原代细胞培养结果
• 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长 • 如接种的细胞密度适宜，5-7 d即可形成单层
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1.2 传代细胞培养
• 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或
倍增不同。在一代中，细胞培增3-6次
• 培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起
用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬
液。
以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻
轻摇匀， 37 ℃CO2培养箱培养。
观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。
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传代细胞培养结果
• 一般情况，传代后的细胞在2 h时左右就
• 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将
胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
• 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎
直至清洗液清亮为止。
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操作步骤2 ---切割
• 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡
盐溶液漂洗。
• 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到
成1 mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗， 洗到组织块发白为止。
• 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃上清。
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胰酶消化法操作步骤 --- 消化、接种培养
• 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40 min，每隔5 min
振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
• 加入3-5 ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 • 静置5-10 min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 • 1000 rpm，离心5-10 min，弃上清液。 • 加入平衡盐溶液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 • 加入细胞生长液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。 • 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37 ℃下培养
浓度到5×105/ml左右），37 ℃下培养。 （注意：省略了离心、计数等步骤）
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组织块直接培养法操作步骤
• 组织块接种：
– 将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。 – 翻转瓶底朝上，将细胞生长液加至瓶中，培
养液勿接触组织块。 – 37 ℃静置3-5 h，轻轻翻转培养瓶，使组织
浸入细胞生长液中（勿使组织漂起），37 ℃ 继续培养。
瓶、小瓶、烧杯、吸管、酒精灯
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原代细胞培养方法
冷消化
• 胰酶消化法 温消化
• 组织块直接培养法
一次性消化 分次消化
消化法：采用无菌操作的方法，把组织（或器官） 从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞 ，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。
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原
代
贴块法
培
养
方
法
分
类
消化法
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消化法的分类 分次消化