一株产志贺毒素_且山梨醇阳性的大肠杆菌O157_H7的分离与鉴定

一株产志贺毒素Ⅱ且山梨醇阳性的大肠杆菌O157:H7的分离与鉴定张书萧1,2，刘 喆1,2，邵东华2，陈晓平1 ，赵秋华3，马志永2（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，长春 130118；2. 中国农业科学院上海兽医研究所 动物源性食品安全研究中心，上海 200241；3.上海市闵行区动物疫病预防控制中心，上海 201100）ISOLATION AND IDENTIFICATION OF SHIGA TOXIN TYPE 2-PRODUCINGAND SORBITOL-POSITIVE ESCHERICHIA COLI O157:H7摘　要：在上海某猪场采集6份腹泻猪粪便样品和2份病死猪小肠内容物样品，增菌后经麦康凯培养基和伊红美兰培养基分离得到32株疑似大肠杆菌，通过PCR 方法分析O157特异基因rfbE 和血清学鉴定，分离获得一株肠出血性大肠杆菌O157:H7。

PCR 检测该菌株的毒力因子携带情况，结果表明其只携带志贺毒素Ⅱ，而不携带志贺毒素Ⅰ、紧密素和溶血素等毒力因子；生化试验发现该菌株与大多数O157:H7特性不同，可分解山梨醇；毒力试验和耐药性试验表明该菌株毒性较强，且耐药性很强，对大多数抗生素不敏感。

关键词：大肠杆菌O157:H7；分离；鉴定中图分类号：S852.612 文献标识码：A 文章编号:1674-6422(2011)02-0030-05ZHANG Shu-xiao 1,2, LIU Zhe 1,2, SHAO Dong-hua 2, CHEN Xiao-ping 1, ZHAO Qiu-hua 3, MA Zhi-yong 2(1. Colledge of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118; 2. Animal-borne Food Safely Research Center, Shanghai Veterinary Reseanch Institute, CAAS Shanghai 200241, China; 3. Animal Dicease Control and Preventionof Shanghai Minhang District, Shanghai, 201100, China)Abstract: A total of 32 strains of Escherichia coli were isolated from diarrhea samples (n =6) and intestine contents (n =2) collected from diseased pigs in Shanghai. PCR analysis of the rfbE gene of the isolates indicated that one of the isolates was positive for being the serotype of Escherichia coli O157:H7, which was further conformed by immunological assay. The isolate was found to carry Shiga toxin-producing gene 2, but not the Shiga toxin-producing gene 1 and some other toxic factors, as detected by PCR analysis. The isolate was able to catabolize sorbitol and resistant to almost all of antibiotics tested.Key words : Escherichia coli O157:H7; isolation; identi fication 收稿日期：2011-07-04作者介绍：张书萧，女，硕士研究生，食品科学专业通信作者：马志永，E-mail: zhiyongma@ Chinese Journal of Animal Infectious Diseases·研究论文·中国动物传染病学报2011,19(4): 30-34[19] Philippe B. Human circoviruses[J]. Vet Microbiol, 2004,98: 95-101.[20] Moen E M, Sleboda J, Grinde B. Serum concentrationsof TT virus and TT virus-like mini virus in patients developing AIDS[J]. Aids, 2002, 16(12): 1679-1682.[21] Philippe B, Pierre G, Jean F C, et al . Distribution andgenetic analysis of TTV and TTMV major phylogenetic groups in french blood donors[J]. J Med Virol, 2006, 78(2): 298-304.（上接第29页）· 31 ·第19卷第4期张书萧等：一株产志贺毒素Ⅱ且山梨醇阳性的大肠杆菌O157:H7的分离与鉴定大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)的主要血清型，人感染EHEC后可引起出血性肠炎(hemorrhagic colitis，HC)、溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)、血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)，其中，HUS和TTP的病情严重，病死率高[1]。

该病原菌严重威胁人类健康，已成为世界性的重要的公共卫生和食品安全问题[2]。

自1982年首次在美国爆发流行以来，迄今报告发生过大肠杆菌O157:H7感染的国家主要有美国、加拿大、英国、意大利、日本、爱尔兰、比利时、德国、澳大利亚、阿根廷、南非、以色列等，发病较多的国家主要有美国、加拿大和日本。

中国1986年首次报告大肠杆菌O157:H7感染的病例，之后在江苏、山东、河南、安徽、广西、福建等十几个省市发生大肠杆菌O157:H7感染的散发病例[3]。

肠出血性大肠杆菌引起人类致病的最常见血清型为 O157:H7，其已知的主要毒力因子有LEE毒力岛、志贺样毒素（stx）及溶血素（EHEC-Hly）等[4]。

国内外调查和监测结果表明，猪、牛、羊等家畜和鸡、鸭等家禽是大肠杆菌O157:H7的天然宿主，它们可能携带病菌但不一定发病[5]。

在上海地区，猪和牛是大肠杆菌O157:H7的主要宿主，阳性菌株分离率高于其他动物[6,7]。

虽然猪是大肠杆菌O157:H7的天然宿主，但该菌引起猪发病并不多见，只是少数猪场内有感染仔猪出现腹泻，并且个别急性死亡[8]。

2010年8月采集上海某猪场腹泻猪粪便样品和病死猪肠道内容物样品，从中分离得到1株产志贺毒素2且分解山梨醇的大肠杆菌O157:H7，本试验对该菌株的生化特性，耐药性和致病性情况作了研究和分析。

1 材料和方法1.1 材料1.1.1 培养基 营养肉汤（NB）为上海科技公司产品；麦康凯（MAC）和伊红美兰（EMB）培养基干粉为北京陆桥术有限责任公司产品。

1.1.2 试剂 E.coli O157和H7诊断血清为宁波天润生物药业有限公司产品；肠杆菌微量生化管和药敏试纸为杭州天和微生物试剂有限公司产品；2×Taq PCR MasterMix购自天根生化科技有限公司。

1.1.3病料 来源于上海市奉贤区某国营种猪场的6头腹泻猪粪便样品和2份病死猪肠道内容物样品。

1.1.4阳性菌株 E. coli O157:H7 ATCC35150来自美国菌种保藏中心。

1.1.5 主要仪器 Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR 扩增仪购自Applied Biosystems公司；DYY-GC型电泳仪购自北京市六一仪器厂；凝胶成像仪购自Bio-Rad Laboratories。

1.2 方法1.2.1 分离培养 用棉拭子沾取少量稀粪便和小肠内容物，混于500μL NB中，增菌6~8 h后，划线接种于MAC平板上，37℃培养16~20 h，挑取红色单菌落划线于EMB平板上纯化，37℃培养16~20 h，挑选菌落呈紫黑色且带有绿色金属光泽者做下一步鉴定。

1.2.2PCR鉴定 刮取少量菌落混匀于200 μL超纯水中，煮沸10 min，10 600×g离心10 min，取上清用于PCR检测。

使用O157抗原基因rfbE的特异性引物进行PCR扩增，以鉴定菌株是否为O157菌株，阳性者同时检测其毒力因子紧密素eae、志贺毒素stx1、stx2和溶血素hlyA的存在情况，引物见表1。

引物由上海英骏生物工程有限公司合成。

PCR反应条件如下: 94℃预变性2 min，然后进入循环；94℃变性30 s， 退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃延伸10min。

特异基因rfbE、毒力因子stx1、stx2、eae和hlyA的72℃延伸时间分别为30 s、45 s、50 s、30 s和30 s。

然后进行1%琼脂糖凝胶电泳，golden view染色后观察结果，凝胶成像系统拍照，重复3次进行验证。

1.2.3 生化试验 将细菌分别接种于葡磷胨水、蛋白胨水、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、棉子糖、侧金盏花醇、木胶糖、硫化氢、苯丙氨酸、枸橼酸盐、尿素和山梨醇12种肠杆菌微量生化管中，37℃培养24 h，观察结果并记录，确定其各项生化特性。

1.2.4血清学鉴定分别点1滴大肠杆菌O157诊断血清和一滴大肠杆菌H7诊断血清于干净的玻片上，刮取少量PCR阳性菌与其混匀，上下晃动玻片，1 min内观察是否有凝集现象，凝集者即为阳性，同· 32 ·2011年7月中国动物传染病学报时以生理盐水作为阴性对照，以ATCC35150作为阳性对照。

1.2.5 致病力试验[9]取C57健康小鼠10只，随机分为2组。

第1组6只，为试验组，第2组4只，为对照组。

分离得到的O157:H7菌株经LB 过夜培养后，调整细菌浓度为1010CFU/mL，用生理盐水洗涤2遍后重悬，试验组小鼠每只腹腔注射300 μL。