蛋白质组学定量研究常见方法-PPT课件

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1：双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量：抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离：蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色（银染、 考染等）。 3、蛋白质的 定性与定量分 析：通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点，质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
4：化学标记法—ICAT
ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子 的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每 个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特 异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰 物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造 成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生β -消除反应 使部分标签断裂。
蛋白质组学定量研究常见方法
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蛋白质组学定量研究常见方法

1：常规双向电泳 2：DIGE 3：15N等同位素标记 4：ICAT 5：iTRAQ 6：SILAC
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5: 化学标记法—iTRAQ
简介：
iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图 中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱 中，信号离子表现为不同质荷比(113-119，121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以 鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。
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4：化学标记法—ICAT
A: ICAT试剂结构，包括3个部分， SH反应集团， biotin标签，同位素臂， 试剂具有两种形式：重型（含8个氘） 和轻型（不含氘） B: ICAT标记定量技术流程，来源不同 处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和 轻型ICAT试剂标记，标记后等量混合， 胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标 记的多肽，质谱分析，依据MS质谱峰 图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段。
1：常规双向电泳

一、双向电泳概述： 双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)的基本原理是利用 蛋白质的等电点（pI)和分子量(Mr)不同而分离蛋白质：第一向电泳—— 等电聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）根据蛋白质的等电点不同将蛋 白质分离，第二向电泳——十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 （Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS—PAGE）利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质分离。 双向电泳一次可以从细胞、组织或其它生物样本中分离上千种蛋白 质，凝胶上的斑点都对应着样品中的蛋白质，且各种蛋白质的等电点，分 子量和含量的信息都能通过质谱鉴定和软件分析获得。因此其在蛋白质组 分析、疾病标志物检测、细胞差异分析、药物开发、癌症研究等领域都得 到了广泛的应用。 二：双向电泳分离蛋白质混合物具有以下优势： 1、经典方法、应用范围广、适用于各类材料； 2、经济实惠，可大规模多个样本筛选和分析。
2：DIGE
简介： DIGE — 双向荧光差异凝胶电泳，利用荧光染料（Cy2, Cy3, Cy5） 能与蛋白质赖氨酸的氨基反应而使蛋白质被标记，标记后蛋白质的等电 点和分子量基本不受影响，等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳， 蛋白质表达量的变化则通过不同荧光的强度来体现。 技术优势： 1：高效性，同一块凝胶上可以电泳两个样品，减轻了工作量； 2：与常规银染相比灵敏度更高； 3：检测动态范围更大； 4：定量精确, 采用内标而消除了胶与胶之间的实验误差； 5：统计学分析，ImageMaster7.0（DIGE）软件可以得到统计学 可信的结果，降低了操作者之间的偏差。
辉骏生物：fitgene/免费服务热线：400-69-16632：DIGE
DIGE荧光定量方法流程图. 1、样品准备：提取对照组和 不同实验组的蛋白质,定量,cy3 和cy5交叉标记，同时将所有实 验组与对照组的样品等量混合后 cy2标记，作为内标。 2、蛋白质分离：等量混合三 种荧光素标记后的蛋白质，2DPAGE电泳分离，荧光显色。 3、蛋白质定量分析：Image Master 7.0（DIGE)分析同一蛋 白质不同处理后的表达量变化。
15
优点： 15 高效性： N标记法是体内标记技术，标记效率可高达95%； 重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； 15 灵活性：在培养基中添加同位素标记 N ，操作方便。
缺点： 14 15 （1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对 N/ N标记的蛋白质或肽段的相应质 量位移进行预测。 15 14 15 （2）由于使用的 N培养基纯度>96%，无法完全置换 N,所以 N标记的肽段在质谱中 会有额外的同位素峰。
3：代谢标记法— N标记法
简介： 15 在培养基中添加 N，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混 合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE分离，质谱鉴定和定量。 根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根 据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。