微生物快速检测方法精编版

电阻抗法测定细菌总数
M=(R0-RT)/R0×100% 其中R0表示开始时培养基的阻抗值
RT表示任意时刻培养基的阻抗值 M表示培养基电阻减少的百分数。
➢ 电阻越小细菌活动越多，在一定范围内，菌落形成单位的 对数Log(CFU)与IDT（阻抗检测时间）呈直线关系。
电阻抗法测定细菌总数
优缺点： ➢ 电阻抗法较省力，样品细菌数在4～18小时内出结果。但
培养膜法_快速检测纸片技术
优点：
➢ 可节约玻璃仪器、培养基。 ➢ 可节省培养基等试剂的配置灭菌和玻璃仪器灭菌和清洗的
时间、人力和费用。 ➢ 因为有显色剂和小方格，计数方便。 ➢ 节约稀释的繁琐动作。 ➢ 可快速测试致病菌，节省大量的实验步骤。
缺点
➢ 成本比传统方法要稍高些。 ➢ 测试细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌时不能节约培养
致病菌快速检测方法
显色培养基法：技术成熟，产品很多。 免疫学方法：产品最多，特异性和敏感性都很高，但
有假阳性存在，阳性结果需要确认。通常的原理有EIA， ELISA，GLISA，荧光酶免、免疫磁分离等方法。 分子生物学方法：以基因探针检测法和PCR法为主。 基因芯片
显色培养基法
原理
快速检测的新方法
1、ATP生物荧光法 2、电阻抗法 3、颜色变化 4、流式细胞技术及激光扫描技术 5、其它：热量法，放射测量法
培养膜法_快速检测纸片技术
原理
二片塑料膜构成，上薄为盖，下厚为培养基。
操作方法：
检样稀释→取1ml滴于下膜正中央→盖上膜→扩展器压成 20cm2圆圈 →37℃培养24h →计数(显色的斑点)
微生物快速检测方法简介
常见微生物检测项目
常规微生物项目
细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、霉菌及酵母菌
致病微生物项目
沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157： H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假 单胞菌等
常规微生物检测方法
传统计数改良法
1、培养膜法 2、螺旋平板计数法：螺旋接种仪＋菌落计数 3、滤膜法：常用于一些可过滤样品的检测
流式细胞技术
原理
液体样品流过仪器中的激光照射的流动池，当微生物流过 显微镜聚焦的流动池时就能被自动地检测到。
特点
检测方法与使用的仪器有高度的特异性，所以应遵循生产 厂商提供的方法。
流式细胞技术
FOSS公司BactoScan FC牛奶中总菌数快速检测 仪
➢ 采用流式细胞原理。对微生物进行核酸染色，用流式细胞 技术进行计数。
➢ 优点：速度快(50-150样品/小时) ➢ 缺点：死活细胞一起检测，消耗成本较高，仪器比较难保
养。灵敏度不够高。 ➢ 适合牛奶企业检测原奶中细菌总数。
流式细胞技术
美国Chemunex公司微生物快速检测系统
➢ 将流式细胞技术与活细胞荧光探针标记及激光扫描技术相 结合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高 端的ScanRDI和D-count微生物快速检测仪。
螺旋平板法
阿 基 米 德 螺 旋 型 轨 迹
平皿旋转
接种针往外移动 同时自动将样品 稀释1000倍
螺旋平板法
优点
➢ 与传统方法相比，无需稀释梯度，每个梯度倒2个平板， 节省了大量人力物力。
缺点
➢ 检测时间并没有缩短，菌落总数仍需要培养48小时。 ➢ 需要配合自动菌落计数仪，否则人工计数更麻烦。
➢ 其最大的特点是只检测活细胞数，速度极快，处理量大。 ➢ 检测步骤：1、过滤；2、标记，直接对活细胞和酵母进行
标记；3、激光扫描。
三种型号的差异
产品型号 主要参数
Bactiflow
总活菌数
√
酵母和霉菌数
√
大肠杆菌和大肠菌群
贾第鞭毛虫和隐孢子虫
处理速度
10-14个样品/小时
灵敏度 适用范围
100-100,000个细胞/g 适用于含菌量较高的
在选择性培养基的基础上经过改良。 利用细菌特有的生理生化反应，使培养基中的指示剂产生 颜色变化，以将目标菌与其他菌区别开来
酶联免疫技术—mini-Vidas全自动免疫分析仪
利用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目 标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲 洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本。
在荧光显微镜荧光检测器下获得结果。 PCR方法一般不需增菌太长时间，通过PCR方法对待测微
生物的特征片断进行扩增，然后通过凝胶电泳或荧光PCR 技术判断结果。
分子生物学方法
优缺点
➢ 分子生物学方法检测致病菌，特异性较强，技术较为前沿， 特别是相对国标方面来说。
➢ 假阳性概率仍然较高，因此只能作为一种初筛方法。 ➢ 速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出结果，与免疫
与阻抗法类似，可以实现wk.baidu.com速检测。 缺点：需要购买原厂的预装培养基，
应用范围受限制，成本高昂。
梅里埃的BacT/Alert微生物检测仪
基于微生物生成产生CO2的原 理。CO2积累越多，底部的 CO2传感器变黄，由LED发射 一束光至底部，探头检测反射 光的强度。光强度与微生物数 量有一定关系。
对于菌数太低的不好，样品中还不能用防腐剂，否则结果 是乱七八糟的。 ➢ 电阻抗法制作标准曲线过程中工作量较大，但以后的检测 简便的多，不需要一系列稀释，只需样品1ml，培养基 9ml，测量管一只。
通过颜色变化检测
微生物生长导致培养基pH值发生变 化，由光学检测器检测底部琼脂层 的颜色变化，记录达到突变点的时 间。
➢ 金黄色葡萄球菌 使用了具有热稳定的核酸酶反应片，核酸酶反应产生的粉 红色环带色围着一个红色或兰色菌落即为金黄色葡萄球菌， 26小时可确认结果。
螺旋平板法
DWS螺旋平板接种仪
自动菌落计数仪
螺旋平板法
原理
样品制备的菌悬液在琼脂表面形成阿基米德螺旋型轨迹。 当用于分液的空心针从平板中心移向边缘时，菌液体积减 少，注入的体积和琼脂半径间存在指数关系。培养时菌落 沿注液线生长。用一计数的方格来校准与琼脂表面不同区 域有关的样品量，计数每个区域的已知菌落数，在计算细 菌浓度。
法比没有速度优势。 ➢ 目前不少产品已经通过AOAC的认证。
清洗保养要求特别高。另外，有存在假阴性的可能。
电阻抗法测定细菌总数
原理
供细菌生长的液体培养基是电的良导体，在特制的测量 管底部装入电极插头，即可对接种生长的培养基的阻抗变 化进行检测。阻抗变化的产生是由于微生物生长过程中的 新陈代谢使培养基中的大分子营养物质(糖、脂类、蛋白 质等）被分解成小分子代谢物，即较小的带电离子（乳酸 盐、醋酸盐、重碳酸或氨等）这些代谢产物的出现和聚集， 增强了培养基的导电性能，从而降低了其阻抗值。
优点是检测灵敏度高，速度快，可以在48小时的时间内快 速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单核李斯特菌， 空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。
分子生物学方法
基因探针法及PCR方法在国外已经有相当成熟的表现。 有普通PCR，荧光PCR，实时荧光PCR（定量PCR）等多
种方法。 基因探针法一般也需要增菌，然后加探针试剂杂交，然后
时间。
培养膜法_快速检测纸片技术
应用
➢ 细菌总数 测试片中含有一种红色指示染剂，使所有菌落易认别计数。
➢ 大肠菌群 测试片中含有指示剂，使菌落为红色，且有气泡产生。
➢ 大肠杆菌 指示剂可使所有菌落为红色，并可留住大肠杆菌产生的气 泡。 24小时可确定大肠杆菌数。
培养膜法_快速检测纸片技术
➢ 霉菌和酵母菌计数 测试片中加入的抗生素，可以抑制细菌生长；指示剂使酵 母菌易认别计数；霉菌可产生特有的色泽。
滤膜法
滤膜法常用于可过滤样品的微生物检测。
优点
灵敏度增大，菌落无扩散情况，便于计数。
缺点
需要额外的支出购买真空泵，多联支架及一次性滤膜； 如果抽滤过程空气洁净度不够，有可能造成二次污染， 尤其是对菌数要求特别严格的产品，如啤酒，澄清果 汁，桶装饮用水等。
ATP生物荧光法
原理
ATP＋萤光素+萤光素酶+O2—AMP+Ppi+CO2+氧化萤光 素+光
在细菌生长的过程中，用微量量热计测量产热量等热数据， 经计算机处理，绘制成以产热量对比时间组成的热曲线图， 以此推断细菌存在数量。
发射测量法
利用细菌在代谢碳水化合物时产生CO2的原理，把微量的 放射性标记引入葡萄糖或其他糖类分子中。细菌生长时， 糖被利用并放出标记的CO2，将生成的放射性标记CO2从 培养装置中导出或用化学法吸收后，利用专用的放射测量 仪来测定放射性CO2 。放射量与菌数成正比。
应用
➢ 用于食品生产线和管道进行快速清洁程度检测。 ➢ 用于水质检测。 ➢ 改良后用于食品的商业无菌检测或终产品检验。
ATP生物荧光法
表面清洁度/水质检测
涂抹采样
混合:震荡5s 10秒获得结果
检测
ATP生物荧光法
ATP法检测成品的优缺点
➢ 优点：大大缩短库存时间，减少物流压力和成本。 ➢ 缺点：ATP方法需要消耗大量的较昂贵的试剂，对仪器的
食品、化妆品及水等
样品。每天检测量不
大于40个样品。
ChemScan RDI
Real-time analyser D-count
√ √
√ √ 90分钟内出定量结果 1-5000个细胞 特别适用于医药工业、饮用水 尤其是直饮水中对可过滤的样 品进行有害肠道菌及原生动物 进行快速检测
√ √
50个样品/小时 1-1000cfu/g(mL) 适用于含菌量较低的 不可过滤的食品、化 妆品等样品。每天检 测量大于40个样品。
微量量热法
利用细菌生长时产生热量的原理设计而成。微生物在生长 和代谢的过程中，能产生大量的代谢热。由于各种微生物 的代谢产物热效应不同，因此可显示出特异性的热效应曲 线图。热效应曲线图的形成，是由于培养基含有多种成分， 微生物则产生多种不同的代谢产物，以此表现出的热效应 为多个曲线峰，如为单一营养成分，则只有一个峰出现。