【转基因水稻讲义】转基因抗虫水稻
《转Cry1Ab基因抗虫水稻的检测方法研究》
《转Cry1Ab基因抗虫水稻的检测方法研究》一、引言随着现代农业科技的进步，转基因作物因其抗虫、抗病等特性，在农业生产中得到了广泛应用。
其中，转Cry1Ab基因抗虫水稻因其显著的抗虫效果，成为了研究的热点。
然而，对于这种转基因水稻的检测方法仍需深入研究，以确保其安全性和有效性。
本文旨在研究转Cry1Ab基因抗虫水稻的检测方法，为农业生产提供科学依据。
二、材料与方法1. 材料本研究所用材料为转Cry1Ab基因抗虫水稻及其对照组非转基因水稻。
2. 方法（1）DNA提取：采用CTAB法提取转基因水稻和对照组水稻的基因组DNA。
（2）PCR扩增：利用特异性引物，对提取的DNA进行PCR 扩增，扩增Cry1Ab基因片段。
（3）电泳检测：将PCR产物进行电泳，观察条带，初步判断Cry1Ab基因是否成功转入水稻中。
（4）荧光定量PCR：利用荧光定量PCR技术，对转基因水稻中Cry1Ab基因的拷贝数进行精确检测。
（5）免疫学检测：采用Western Blot技术，对转基因水稻中Cry1Ab蛋白进行检测。
三、实验结果1. PCR扩增结果电泳结果显示，转基因水稻组在Cry1Ab基因特异位置出现条带，而非转基因水稻组则无此条带，初步判断Cry1Ab基因已成功转入水稻中。
2. 荧光定量PCR结果荧光定量PCR结果显示，转基因水稻中Cry1Ab基因的拷贝数显著高于非转基因水稻，证明了转Cry1Ab基因的成功导入。
3. Western Blot结果Western Blot结果显示，转基因水稻中成功表达了Cry1Ab蛋白，而非转基因水稻组则无此表达。
四、讨论本研究采用多种方法对转Cry1Ab基因抗虫水稻进行检测，包括PCR扩增、电泳检测、荧光定量PCR和Western Blot等。
实验结果表明，这些方法可以有效地检测出转基因水稻中Cry1Ab 基因的成功导入及其表达情况。
其中，PCR扩增和电泳检测为初步判断方法，可快速筛选出转基因水稻；荧光定量PCR和Western Blot则为精确检测方法，可对转基因水稻中Cry1Ab基因的拷贝数和表达情况进行精确测定。
抗虫转基因水稻检测技术研究综述
抗虫转基因水稻检测技术研究综述
抗虫转基因水稻是通过转基因技术将抗虫基因导入水稻中，以提高水稻的抗虫能力。
由于抗虫转基因水稻具有抗虫能力强、减少农药使用量等优点，因此在农业生产中具有广泛应用前景。
为确保抗虫转基因水稻的品质和安全性，对其进行检测是必不可少的。
抗虫转基因水稻检测技术包括两个主要方面：转基因水稻的鉴定与定量检测。
转基因水稻的鉴定主要是通过检测转基因水稻中是否存在外源基因和指纹图谱分析来确保其转基因性质。
转基因水稻的定量检测主要是通过检测转基因水稻中外源基因的拷贝数目来确定转基因水稻的含量。
常用的转基因水稻鉴定技术有PCR法、Southern blot法和ELISA法等。
PCR法是最常用的技术，它可以通过特异引物扩增出外源基因的片段，并通过凝胶电泳分析来确定是否存在转基因水稻。
Southern blot法是一种基于DNA杂交原理的技术，可以通过与特定探针的杂交来检测转基因水稻中的特异序列。
ELISA法是一种免疫学方法，可以通过免疫反应来检测转基因水稻中的外源蛋白。
转基因水稻的检测还需要考虑到可能存在的误差和假阳性问题。
为减少误差和假阳性结果，需要选择合适的检测方法、使用合适的标准品和质控品，并进行合理的实验设计和数据分析。
对抗虫转基因水稻进行检测是确保其品质和安全性的重要手段。
目前已经有多种检测技术可以用于转基因水稻的鉴定和定量检测，但仍需要不断改进和完善，以满足农业生产中对抗虫转基因水稻的需求。
抗虫转基因水稻检测技术研究综述
抗虫转基因水稻检测技术研究综述作者：向阳来源：《安徽农学通报》2019年第10期摘 ;要：近年来，随着抗虫转基因水稻研究的进一步发展，世界各地实验室在抗虫转基因水稻研究方面均有收获，抗虫转基因水稻检测随之成为众多科学家的关注点。
该文综述了抗虫转基因水稻检测技术的研究进展，为进一步开展转基因水稻检测的研究工作提供参考。
关键词：抗虫 Tail-PCR;转基因水稻;基因芯片;检测技术中图分类号 ;S511 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）10-0015-04稻米是全世界近一半人口消费的主要粮食作物，对于人类的生存和发展起着极其重要的作用，是我国食用人口比重最大的粮食作物。
研究表明，当前制约水稻稳产、高产以及稻米品质的主要是各类害虫，所以防治虫害成为了重中之重。
在防治害虫时，使用生物防治手段，不仅制约因素多、还不易控制，而使用化学农药不仅破坏生态平衡、还可以使螟虫产生抗性;培育抗虫水稻新品种，增强水稻的抗虫性，是一种更经济环保的方法。
然而，传统的抗虫水稻育种周期长，有限的遗传资源，不明确的抗虫机制，还会产生新的生物型害虫，导致抗虫性不稳定，极大地制约了水稻抗虫育种的进程。
因此，利用基因工程技术获得转基因抗虫水稻，是水稻防虫侵害的最有希望和前途的方法。
1 抗虫转基因水稻简介抗虫转基因水稻就是利用转基因技术将抗虫基因导入水稻的受体细胞中，使寄主在水稻细胞内抗虫基因得到表达并遗传，使水稻自身产生抗虫蛋白，进而形成抗虫的新型水稻品种。
在水稻转基因抗虫研究中，被广泛应用的水稻抗虫基因是从苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）中发现的Bt基因。
1989年，人类第一次培育转基因水稻植株，此植株是由中国农業科学院杨虹等将Bt基因利用原生质体电融合技术导入粳稻台北309的基因组DNA中培育出的新型水稻[1]。
现至今已有多个实验室成功培育出转基因水稻新品种。
金永梅等[2]将Cry1C*、 Cry2A*这2个不同的Bt抗虫基因利用农杆菌介导法同时导入到水稻品种吉粳88中去，获得了二价抗虫转基因水稻。
转基因水稻品种
转基因水稻品种一、转基因水稻的概念转基因水稻是指通过基因工程技术将外源基因导入水稻基因组中，从而使水稻获得新的性状或特性的水稻品种。
例如，可能导入抗虫基因使水稻能够抵抗特定害虫的侵害，或者导入抗除草剂基因方便田间杂草管理等。
1. 抗虫转基因水稻- Bt转基因水稻- 原理：将苏云金芽孢杆菌（Bt）中的杀虫蛋白基因导入水稻。
Bt蛋白能够特异性地毒杀鳞翅目害虫，如螟虫等。
当害虫取食转基因水稻后，Bt蛋白在害虫肠道内被激活，与肠道上皮细胞表面的特异性受体结合，造成肠道穿孔，最终导致害虫死亡。
- 优势：显著减少化学杀虫剂的使用量。
传统防治螟虫等害虫需要多次喷洒农药，这不仅成本高，而且农药残留会对环境和人类健康造成潜在威胁。
抗虫转基因水稻能在很大程度上解决这些问题，提高水稻产量的稳定性。
- CpTI转基因水稻- 原理：豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因被导入水稻。
CpTI能够抑制害虫体内的胰蛋白酶活性，从而影响害虫的消化过程，达到抗虫的目的。
- 优势：具有较广的抗虫谱，对多种害虫都有一定的抑制作用。
同时，由于其作用机制与Bt蛋白不同，两者结合使用可以延缓害虫对单一抗虫基因产生抗性。
2. 抗除草剂转基因水稻- 例如，导入抗草甘膦基因的水稻。
- 原理：草甘膦是一种广谱性的除草剂，它通过抑制植物体内的5 - 烯醇丙酮莽草酸 - 3 - 磷酸合成酶（EPSPS）的活性来杀死植物。
抗草甘膦转基因水稻中导入了经过修饰的EPSPS基因，这种基因编码的酶对草甘膦不敏感，从而使水稻在使用草甘膦除草剂时能够正常生长，而杂草被有效清除。
- 优势：方便田间杂草管理。
在传统水稻种植中，人工除草劳动强度大，化学除草容易对水稻产生药害。
抗除草剂转基因水稻可以在水稻生长期间精准地使用草甘膦进行除草，提高田间管理效率，减少杂草与水稻争肥、争光等情况，有助于提高水稻产量。
三、转基因水稻的安全性争议1. 环境安全方面- 基因漂移问题- 争议点：转基因水稻中的外源基因可能通过花粉传播等方式漂移到野生稻或其他近缘植物中，从而可能改变野生植物的基因组成和生态特性。
抗虫转基因水稻检测技术研究综述
抗虫转基因水稻检测技术研究综述抗虫转基因水稻是指通过基因工程技术将一些具有抗虫能力的基因导入水稻基因组中，使其具有抵抗某些害虫的能力。
这种技术在水稻产量和品质的提高方面发挥了重要作用，但同时也引起了一些争议，其中之一就是如何检测抗虫转基因水稻。
传统的检测方法主要包括基于PCR、ELISA等方法的分子检测和基于生物学特性的表型检测。
这些方法在检测方面都具有一定的局限性，例如PCR方法检测的准确性和灵敏度受到DNA样本的质量和数量的影响，而表型检测方法则需要大量的时间和劳动力，并且受到外部环境的影响较大。
为了克服传统检测方法的局限性，一些新型的检测技术被提出并逐渐得到应用。
其中包括基于PCR的数字PCR技术、基于序列检测的测序技术以及基于高通量测序的整个转录组测序技术。
数字PCR技术是一种新兴的PCR技术，它通过将DNA分子随机地分配到微小反应室中，将PCR扩增过程从一般的大规模PCR反应中分离出来，从而克服了PCR反应中的竞争性影响，提高了检测的灵敏度、准确性和可重复性。
数字PCR技术也适用于检测非常低的DNA浓度，因此可以用于检测转基因水稻样品中极低的基因副本数。
另一种新兴的检测技术是测序技术，它包括Sanger测序和测序和高通量测序两种。
Sanger测序技术是一种利用序列分离和读取的传统测序技术，适用于对特定区域进行测序，但适用性较弱且高成本。
高通量测序技术则是一种通过并行测序方法读取数百万个序列的技术。
这种技术可以快速、准确、全面地分析整个基因组或转录组，因此可以检测到转基因水稻样品中的任何可能的异构体。
整个转录组测序技术是一种通过测定RNA样品中所有基因的表达信息来识别转基因水稻的新技术。
与其他方法不同，这种技术可以检测出转基因水稻植株和非转基因水稻植株之间的基因表达差异，并进一步确定植株是否被转基因改造。
总的来说，新的检测技术对于抗虫转基因水稻的检测具有更高的灵敏度、准确性和可靠性。
然而，这些技术也需要更高的实验室设施和专业知识，因此应该在政府和科研机构的支持下，逐渐推广应用。
转基因技术在水稻害虫防治中的应用
2.1 Bt 抗虫基因
苏云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性土壤芽胞
杆菌。
ICP 本 身 不 具 有 生 物 活 性 ， 又 称 为 原 毒 素
( protoxin) 原毒素被靶标昆虫取食后，在昆虫中
肠的碱性环境中被降解为有毒的活性肽，并与昆
虫中肠道上皮纹缘膜细胞上的特异受体相结合，
引起细胞膜穿孔，破坏细胞渗透平衡，最终导致
cDNA克隆。
2.3 植物外源凝集素基因
植物外源凝集素是一类具有高度特异性的糖结 合蛋白 它被昆虫取食后，特异性地与昆虫消化道 围食膜上的糖蛋白相结合，影响营养物质的正常 吸收; 另一方面，在昆虫消化道内诱发病灶，促进 消化道内细菌的繁殖，使昆虫得病或拒食生长停 滞甚至死亡 。
与 Bt 杀虫蛋白相比，凝集素最大的应用价值 在于它对 Bt 杀虫蛋白不能控制的同翅目害虫如褐 飞虱、黑尾叶蝉表现出明显的抗性。 目前在抗虫转基因水稻方面应用最广泛的植 物外源凝集素是雪花莲凝集素( GNA) ，它对人和 哺乳动物的毒副作用极低。
令人鼓舞的是，为了最大限度地降低抗虫转基因水稻 的安全隐患，研究者们在外源抗虫基因的选择与修饰表达 调控与遗传转化等技术层面都开展了诸多有益的探索，尤
其是抗生素选择标记基因的剔除和目的基因组织特异性诱
导性表达调控等技术已趋于成熟，为抗虫转基因水稻走向
商业化积累了一定的技术储备。
另一方面，随着转基因科普宣传力度的
2.2 蛋白酶抑制剂基因
蛋白酶抑制剂( PI) 是植物防御系统中的重要成员。它 的抗虫机理不同于Bt 杀虫蛋白，可与昆虫消化道内的蛋白 消化酶相结合，形成稳定的酶抑制剂复合物，阻断或削弱 蛋白酶的水解作用; 另一方面，酶抑制剂复合物可能作为一 个负反馈信号使昆虫厌食 。 上述双重效应使昆虫降低对蛋白的利用率，减少食物
抗虫转基因水稻检测技术研究综述
抗虫转基因水稻检测技术研究综述【摘要】抗虫转基因水稻是通过基因工程技术将具有抗虫性的基因导入水稻中，以提高水稻对害虫的抵抗能力。
针对抗虫转基因水稻的检测技术是确保市场上水稻产品的安全性和合法性的重要手段。
目前主要的检测方法包括PCR技术、ELISA技术和免疫层析技术。
这些技术在抗虫转基因水稻的快速检测和定量分析中起着关键作用。
随着技术的发展，抗虫转基因水稻检测技术已经取得了一定的进展，但仍面临着一些挑战和难题。
未来，需要进一步完善检测技术，提高检测的准确性和灵敏度，同时加强标准化和国际合作，以推动抗虫转基因水稻检测技术的发展，为水稻品质和食品安全做出贡献。
【关键词】抗虫转基因水稻、检测技术、PCR技术、ELISA技术、免疫层析技术、发展现状、未来发展趋势、研究展望1. 引言1.1 研究背景抗虫转基因水稻是通过基因工程技术将抗虫基因导入水稻中，使其具备抗虫能力的一种转基因作物。
随着转基因技术的不断发展，抗虫转基因水稻在农业领域中得到了广泛应用，对提高水稻产量、降低农药使用量、改善生态环境等方面具有重要意义。
随着全球人口的持续增长，粮食安全问题日益突出，水稻作为世界上最主要的粮食作物之一，其产量和质量对人类生存和发展具有重要意义。
由于害虫侵害导致的减产现象在水稻种植中普遍存在，传统的农药防治方式已经不能满足需求。
利用基因工程技术开发抗虫转基因水稻成为解决这一问题的重要途径。
近年来，随着抗虫转基因水稻品种的不断推广和种植规模的扩大，对其检测技术的研究也变得愈发重要。
检测技术的准确性和灵敏度直接影响到抗虫转基因水稻的合理种植和质量控制，对保障粮食安全和生态环境具有重要意义。
对抗虫转基因水稻检测技术进行深入研究和探索具有重要的现实意义和应用价值。
1.2 研究目的研究目的是为了探讨抗虫转基因水稻检测技术的研究现状，总结各种检测方法的优缺点，为进一步提高检测技术的准确性和灵敏度提供参考。
通过对不同检测方法的比较和分析，寻找出更加高效和可靠的检测技术，为抗虫转基因水稻的生产和管理提供科学依据。
抗虫转基因水稻检测技术研究综述
抗虫转基因水稻检测技术研究综述抗虫转基因水稻是通过将具有抗虫基因转移到水稻中，使其表达抗虫蛋白，从而达到抗虫的目的。
因其具有很强的抗虫能力和良好的品质特性，被广泛研究和应用，但也面临着一系列的检测技术难题。
本文综述了目前抗虫转基因水稻检测技术的研究进展。
抗虫转基因水稻的检测技术主要包括基因检测、蛋白检测和代谢产物检测。
基因检测是通过检测转基因水稻中的特定抗虫基因，确认其是否存在。
目前，常用的基因检测方法有PCR、Southern blot和实时荧光定量PCR等。
PCR是最常用的检测方法，其基本原理是通过特定引物扩增转基因水稻中的抗虫基因序列。
Southern blot是一种高灵敏度的基因检测方法，它通过DNA迁移和探针杂交来检测目标基因序列。
实时荧光定量PCR能够精确测量转基因水稻中的目标基因拷贝数目，具有高灵敏度和高特异性的优点。
蛋白检测是通过检测转基因水稻中表达的抗虫蛋白，确定其存在和含量。
常用的蛋白检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹和质谱分析等。
ELISA是最常用的检测方法，它通过将抗虫蛋白与特异性抗体结合来检测其存在和含量。
免疫印迹是一种用于检测目标蛋白的免疫检测方法，它利用特异性抗体与目标蛋白结合后形成蛋白-抗体复合物，通过蛋白胶体颗粒或酶底物的显色反应来检测目标蛋白的存在。
质谱分析是一种高灵敏度的蛋白检测方法，它通过检测蛋白分子的质荷比（m/z）来确定其存在和含量。
代谢产物检测是通过检测转基因水稻中的代谢产物，确定其与非转基因水稻的差异，从而间接确认其是否为转基因水稻。
代谢产物检测的常用方法有核磁共振谱和高效液相色谱质谱分析等。
核磁共振谱能够通过检测样品中的代谢物谱图，确定转基因水稻与非转基因水稻在代谢产物上的差异。
高效液相色谱质谱分析是一种高灵敏度、高分辨率的分析方法，能够检测水稻中的化合物，从而确定其是否为转基因水稻。
抗虫转基因水稻检测技术是转基因水稻研究中的重要环节，通过基因检测、蛋白检测和代谢产物检测等多种技术手段，能够准确、快速地鉴定转基因水稻的存在和含量，为保障转基因水稻的安全性和可追溯性提供了重要支持。
试评价转基因抗虫水稻生态安全性-最新年文档
试评价转基因抗虫水稻生态安全性1转基因抗虫水稻的安全性现代科学在创造社会文明时给人类带来了不可预知的风险，转抗虫基因植物可能带来的安全性问题已成为焦点，转基因作物是能够自行转移和繁殖的生命活体，转基因水稻的安全首先表现在食品上。
目前我国有一半以上的人口以稻米为主食。
转基因抗虫水稻的环境安全性主要包括对非靶标生物的影响，对天敌的影响和对稻田节肢动物群落的影响。
害虫对转基因水稻的抗性风险。
自二次世界大战以后，生长全周期的调查结果显示，人类与害虫斗争的历史与人类历史一样悠久。
人们在不断的探索中开始施用化学农药，这种方法在很长时间对害虫防治的状况取得明显成效。
但随着时间的推移和自然的变化规律，有好多种昆虫和螨类对化学农药产生了抗性，与此同时，我们也看到化学农药给环境和人类健康造成的不良影响，这使生物防治受到人们广泛的重视，如Bt 的生物杀虫剂，由于其专一性强，并且我们也看到它对环境无害，同时也表现出对人、畜安全，因此在好多国家和地区进行了推广和应用。
随着科学技术的飞速发展，基因工程技术有了长足的进步，许多植物成功地转入了Bt 毒蛋白基因，对谷物起到了很好的防虫效果；而昆虫对Bt 杀虫剂同样由于适者生存的原因产生了抗性，这种单一的杀虫毒素持续高水平表达单一的杀虫毒蛋白，使害虫加速对Bt的抗性进化。
现在植物生物技术的发展硕果累累，我们所能看到的转基因作物商品化的历史还比较少，转基因水稻具有极大的发展前景，它能够为粮食安全保障提供全新的途径。
目前，随着社会化水平的提高，其商品化生产的瓶颈在于生物安全评估，我们的研究结果对转基因水稻的生态环境是否存在负效应还没有确定，现在，随着我国对转基因水稻生物安全研究正在不断加大力度，因水稻在其生物安全使转基性方面能够有利于人类生存与发展。
2转基因水稻对水稻害虫室内抗性评价2.1试验材料为转基因抗虫水稻历汕优63，还有感虫对照水稻TNl 等，有严格安全隔离和控制措施的田间试验圃，试验用虫包括水稻螟虫、稻纵卷叶螟、褐飞虱，每份材料分8 行种植40 株，在室内用感虫品种TNl 植株饲养、扩繁，备用。
最新我国转基因水稻的研发和食用安全性初步研究教学讲义PPT
转基因水稻的营养生物利用率的评价
营养评价检测指标（一）
1.日摄食量、食物利用率 2.生长发育指标
体高、体长、胸围和胴体长,背膘厚、第四掌骨 骨密度等 3. 血液生化指标：
血常规，血糖，血脂，血清酶等
Hale Waihona Puke 转基因水稻的营养生物利用率的评价
营养评价检测指标(二)
4. 组织学检测指标： 肝脏，肾脏，肠道，生殖腺，胰腺等的大
氨基酸评分（AAS）: FAO/WHO
营养质量指数（INQ): Hansen R.G
氨基酸模式
结果及结论
转基因水稻的营养成分分析
由各实验数据统计结果可知，上述转 基因水稻与对照水稻相比，物理性状、 营养成分和蛋白质营养价值无差别，具 有实质等同性。
整体动物水平上的食用安全性的研究
转基因水稻的营养生物利用率的评价 转基因水稻的免疫毒理学评价 转基因水稻的亚慢性（90天喂养）毒理学实验 转基因水稻致畸实验 转SCK水稻中hpt基因在大鼠体内代谢的 初步研究
抗白叶枯病转Xa21基因水稻 及亲本对照
转基因水稻的营养成分分析
测定的指标
水稻中43种营养成分: 水分、蛋白质和18种氨基酸、灰分、脂肪和6
种脂肪酸、总淀粉、粗纤维、维生素B1、维生 素B2、维生素E、铁、锌、铜、镁、锰、钾、钠、 钙、磷和膳食纤维 (国标法，AOAC)
能量 (弹式热量计测热法)
蛋白质质量
转因食品的主要性状：抗除草剂、抗病虫害、 增加营养成分、对抗不良环境、延长食品的货架 期、食物疫苗/药物
我国对转基因植物的管理
转基因生物安全评价管理的原则
本办法评价的是农业转基因生物对人类、动植物、 微生物和生态环境构成的危险或者潜在的风险。
转Bt抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策
转Bt抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策生命科学研究2009年水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一，全球约三分之一以上的人口以水稻为主食，仅中国就有8亿人［1，2］.同时，水稻也是受害虫侵袭最为严重的粮食作物之一.据不完全统计，全世界每年因虫害造成的损失占水稻总产量的5%以上，约为1×106t ［3，4］.特别是近年来，二化螟等蛀茎害虫的发生逐年加重，对水稻生产造成严重威胁.传统化学防治方法的长期使用，不但增加生产成本，造成环境污染，而且破坏了生态平衡，因此选育抗虫水稻是防治害虫最经济、有效的方法，随着植物细胞生物学和分子生物学的发展，利用基因工程将外源抗虫基因导入水稻，使水稻自身产生抗虫蛋白从而达到防治害虫的目的已成为现实［5］.目前，国内外已培育出多个高抗水稻螟虫（Cnapha locrocis medinalis ）的转抗虫基因材料，中国的转基因水稻已获准进入田间试验和环境释放［6］，但是由于转入的外源基因并非来自传统的基因库，转抗虫基因植物可能带来生态效应和环境风险问题已成为国际社会关注的焦点.因此，在转Bt （Bacillus thuringien -sis ）基因水稻进入大田试验和商品化生产阶段前进行生态风险性和安全性评价极其必要.1转Bt 基因抗虫水稻的研究进展苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ，Bt ）是一种广泛存在于土壤中的革兰氏阳性菌，由在芽孢转Bt 抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策王丽冰，刘立军，颜亨梅*（湖南师范大学生命科学院中国湖南长沙410081）摘要：转基因抗虫水稻的商品化种植已成为国内外广泛关注的热点问题.综述了转Bt （Bacillus thuringiensis ）抗虫基因水稻的研究进展、食品安全性、生态安全性以及对转Bt 基因水稻本身的性状变化的影响，并提出了防范策略，以期为转Bt 基因水稻的生物安全性评价和商品化种植提供科学参考.关键词：转Bt 基因抗虫水稻；食品安全性；生态安全性；防范策略中图分类号：S511 文献标识码：A文章编号：1007-7847（2009）02-0182-07Advances on Transgenic Bt Rice and Bio -security and StrategiesWANG Li -bing ，LIU Li -jun ，YAN Heng -mei *（College of Life Sciences ，Hunan Normal University ，Changsha 410081，Hunan ，China ）收稿日期：2008-04-08；修回日期：2008-11-05基金项目：国家自然科学基金资助项目（30570226）作者简介：王丽冰（1981-），女，湖南永州人，湖南师范大学硕士研究生，主要从事分子生态学研究，E -mail ：wlb_lanshan@/doc/ae10050144.html, ；*通讯作者：颜亨梅（1950-），男，湖南安仁人，湖南师范大学教授，博士生导师，主要从事动物生态学研究，E -mail ：yanhm03@/doc/ae10050144.html,.Abstract ：Commercialization of insect -resistant transgenic rice has become an important debatable issue in the world.It summarized influences of the research development ，the food safety ，the ecology security ofthe transgenic Bacillus thuringiensis （Bt ）anti -insect rice as well as character change of the transgenic Bt rice ，and proposed the guard strategies ，which could provide scientific reference in biological safe research and commercialization of the transgenic Bt rice.Key words ：transgenic Bt anti -insect paddy rice ；food safety ；ecology security ；guard strategy（Life Science Research ，2009，13（2）：182～188）第13卷第2期生命科学研究Vol．13No．22009年4月Life Science Research Apr ．2009·综述·第2期形成时产生的具有高度特异性杀虫活性的晶体蛋白所决定，称为杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein，ICPs）.ICP常以原毒素形式存在，当昆虫取食ICP后，在昆虫消化道内，在中肠消化酶的作用下，原毒素被活化即降解成具有毒性的多肽，活化的毒素分子与昆虫中肠上皮细胞上的特异受体结合，致使细胞膜产生一些穿孔，破坏细胞的渗透平衡，引起细胞肿胀裂解，使昆虫幼虫停止取食，最终导致死亡.Bt毒素是较早被利用的杀虫剂，它对人、哺乳动物无毒害作用.目前Bt毒素已成为植物基因工程及转基因育种应用中最广泛、最具有潜力和应用前景的抗虫基因.近20年来，Bt基因在水稻中的转化，表达及其转基因植物的鉴定和抗虫性已有许多报道，进展较快.1989年中国农业科学院生物技术中心杨虹等首次报道了用原生质体电融合技术成功地将Bt基因导入水稻“台粳209”［7］，紧接着于1991年谢道昕用花粉管通道技术成功地将Bt基因导入水稻栽培品种“中花11号”.他们所用的Bt基因都是直接从苏云金杆菌中分离纯化得到的，经分子生物学检验，证明Bt基因已整合到水稻基因组中［8］.虽然国内外迄今尚无Bt水稻商品化应用的实例，但获得Bt转基因抗虫植物的报道已有不少［8~16］.1995年与加拿大渥太华大学合作，利用农杆菌介导法成功地将密码子经过优化的Bt杀虫基因Cry1A（b）导入了许多水稻品种［17］，并从粳稻品种秀水11的转基因后代中获得了遗传稳定且对二化螟等8种鳞翅目害虫表现高抗性的Bt转基因抗虫水稻“克螟稻”［18，19］.1996年瑞士苏黎士植物科学研究所Wunn报道了用基因枪法将Cry1A（b）基因导入籼稻“IR58”.在R0、R1、R2代对鳞翅目水稻害虫有明显的抗虫效果，对二化螟，三化螟的最高致死率为100%，并从叶片中检测出Bt蛋白可溶性蛋白0.009%［20］.1997年国际水稻所（IRRI）Ghareyazi报道了用基因枪法得到转Cry1A（b）基因的香粳品系“827”，能表达相对分子质量为67kDa 的毒蛋白，表达量相当于可溶性蛋白的0.1%.T2代植株叶片对一龄二化螟，三化螟有高度抗性［21］.该研究所指出，应用C4PEP羧化酶基因为启动子使Cry1A（b）基因在水稻籽粒灌浆期功能叶片中高效表达，而在水稻籽粒（胚和胚乳）中不表达，这一研究结果对解决人类食用转基因抗虫水稻安全性问题具有开创性意义.1998年，浙江大学与加拿大渥太华大学利用农杆菌介导法将密码子优化的Cry1A基因导入粳稻品种秀水12中，获得的KMD1和KMD2“克螟稻”株系历代植物能够抵抗包括二化螟、三化螟、稻众卷叶螟和大螟等8种水稻害虫的危害，初孵幼虫的致死率高达100%［17］.目前该品种（秀水11）已经农业部审批在浙江省进入生产性试验阶段［19］.由于害虫极易对单个抗虫基因产生抗性，因此将两种或两种以上具有不同杀虫基因导入同一种植物中可有延缓抗性的产生.Cheng等以Ubi基因为启动子，利用农杆菌介导法获得转Cry1A（b）/Cry1A（c）双价抗虫基因水稻［14］.中科院遗传所采用农杆菌介导法将Cry1A （c）和经修饰的CpT1基因共同转入水稻“明恢86”，获得对靶标害虫具有较强抗性的双价抗虫水稻［2］，目前该品种已批准在北京和福建进入环境释放，且产业化形式良好.2转Bt基因水稻的食品安全性随着《农业转基因生物安全管理条例》的实施，转基因植物的安全问题越来越受到社会的广泛关注.尽管目前专家们还无法证明转Bt基因水稻给人类健康和生态环境有害或无害，但很大程度上影响了消费者对转基因食品的接受心理，并进一步阻碍了转Bt基因水稻的商品化.培育转基因水稻品种的最终目的是使转基因水稻进入市场，达到产业化生产，但能否实现此目标，很大程度上取决于它们的环境安全性和食品安全性，即关键要保证转基因水稻对环境和消费者是无害和安全的［22］.水稻是人类的主要食品，将Bt毒蛋白基因导入水稻，在水稻中得到表达，对人类的安全性存在潜在威胁，可以说转基因水稻对人类的安全性是影响推广应用转Bt 基因抗虫水稻的一个至关重要的限制因素［23］.由于Bt杀虫蛋白只能特异地与靶标昆虫中肠上皮细胞的受体结合，在哺乳动物组织中无此类特异性受体，因而不产生毒性.但是除插入基因及其表达产物外，由外源基因表达产物引起的刺激效应及其基因随机插入引起的位置效应，有可能会产生有害的成分［24］.另外，由于人们在构造载体时除目的基因外，还串联一些报告基因和王丽冰等：转Bt抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策183生命科学研究2009年选择性标记基因，这些基因表达产物的安全性目前尚无定论［25］.同时，稻米作为人们日常生活中的主食，其消费数量也相当可观，因此有必要对转基因产品进行动物毒理性分析.王忠华等以“克螟稻”米粉为材料进行经口急性毒理试验和大鼠90d喂养试验，结果未见试验动物出现明显中毒症状，大鼠解剖也未见异常病理改变，表明KMD2稻米在≤64g/kg体重的剂量内对哺乳动物是安全的，对蒸煮后的米饭进行ELISA检测，结果未检测到Bt杀虫蛋白，表明蒸煮后稻米中的Bt杀虫蛋白可能发生降解或变性［26］.外源基因的组成型表达是导致转基因作物生产食品安全性风险的重要原因［27］，对于抗虫转基因水稻而言，抗虫基因在转基因稻米中的大量表达是消费者担心的焦点.虽然Bt作为生物杀虫剂在生产中已安全使用了许多年，也没有证据表明Bt毒蛋白对人类产生毒害作用［28］，但是Bt 毒蛋白在转基因水稻种子中的大量表达无疑会给消费者造成一定的心理压力.为此，李永春等利用在水稻中特异不表达，而在水稻其它营养器官中高效表达的特异性启动子序列RSP1和RSP2［29］，构建了抗虫基因Cry1A（c）的3个组织特异性表达载体并用于水稻遗传转化，获得了一批转基因水稻材料.为进一步培育食用安全性较高的转基因抗虫水稻品系奠定了重要基础.由于转基因作物是人造的生命，而不是大自然原有的品种.虽然至今没有任何证据证明转基因食品引发了安全问题，转Bt基因抗虫水稻在实验的过程中也一直没有发现安全问题，但更重要的是，现在并没有一例转基因作物是人类的主粮.面对转基因水稻，我们必须极为谨慎，因为稻米在各年龄层段都是饮食中重要的部分，包括刚断奶婴儿吃的米糕和稀粥.3转Bt基因水稻的生态安全性随着转基因工程技术的飞速发展，转基因水稻从实验室逐渐走向开放环境，转基因水稻可能带来的生态安全性问题也引起了科学家的关注.因为水稻是稻田生态系统的基础，转基因水稻的介入无疑会影响以水稻为基础的整个稻田生态系统.首先，转基因水稻通过食物链对第二营养级植食性昆虫的生长发育和繁殖产生直接影响；其次，对以植食性昆虫为食的寄生或捕食性天敌产生间接影响；最后，转基因水稻本身的物理性状、农艺性状、营养物质、挥发性和非挥发性次生物质等都可能产生非预期的变化，进而对各个营养层的节肢动物种类组成、数量和发生动态产生非预期的影响，从而引起稻田群落结构的变化［5］.3.1转Bt基因抗虫水稻对稻田生物群落的影响大多数情况下，转Cry1A（b）/Cry1A（c）籼稻对稻田节肢动物群落功能团组成及结构无明显的负面影响［30］.在生长发育的前中期，转Cry1A（c）/ CpT1水稻对稻田节肢动物群落产生一些负面作用，但在其它时期对群落没有明显影响［31］.崔旭红等［32］研究表明转Bt水稻对二化螟和三化螟具有高抗性，而对天敌蜘蛛影响不大，对害虫飞虱也没有影响，对中性昆虫和捕食性天敌的影响也不大.这说明转Bt基因水稻对水稻节肢动物群落影响不大，使用转Bt基因水稻并没有影响水稻田间节肢动物的生态平衡.何树林等［33］研究发现，转Bt基因水稻在分蘖期和抽穗期的稻田蜘蛛种类和数量与对照水稻品种无差异.转Bt基因水稻田间水生动物种类有鱼类、虾类、蝌蚪、水生昆虫和田螺等，与对照品种水稻田间水生动物种类和数量组成一致.说明转Bt基因水稻对稻田蜘蛛和水生动物种类、数量无明显影响，转Bt基因水稻对稻田生态系统环境来说初步证明是安全的.陈茂等通过连续3年的调查证实，从Bt稻田区向对照稻田区扩散的飞虱、叶蝉对Bt水稻没有偏好性，它们的卵寄生蜂也存在这一现象.可见Bt基因抗虫水稻并不会引起田间非靶标类群同翅目害虫数量的上升，相反，对这类害虫还有一定的趋避作用［34，36］.现有的研究结果均显示：Bt抗虫基因水稻对非靶标生物无明显负面影响，相反却提高了稻田生态系统的稳定性.这主要是是由于抗虫转基因水稻的种植大幅度减少了农药的使用量，促进稻田种类增多，生物多样性提高.转双价基因Bt/cpti水稻经过2年大田面积田间试验研究，表明该转基因水稻引发非靶标害虫稻飞虱灾变的风险较小；对稻田捕食性节肢动物亚群落的物种数变化的趋势、物种组成、优势种组成及种群数量没有显著影响；并能提高稻田中捕食性节肢动物的发生数量，尤其在水稻黄熟期能显著提高稻田中捕食性节肢动物亚群落的数量，在成熟收割前期能显著提高稻田中捕食性亚群落的物种丰富度［31，35］.因此，就目前研究可知，转Bt基因抗虫水184第2期王丽冰等：转Bt抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策稻并未对稻田生物群落的稳定性产生影响.3.2转Bt基因水稻对土壤微生物群落及酶活性的影响Bt水稻的长期种植可能会使Bt杀虫蛋白在土壤中残留、富集.而土壤生态系统是生物循环和能量转化的重要场所，Bt杀虫蛋白在土壤中的富集可能影响土壤中的特异性生物功能类群及土壤生物多样性.因此，近年来Bt杀虫蛋白在土壤中的残留及其对土壤生态系统的影响逐渐受到国内外研究者的关注.有研究表明，有苏云金芽孢杆菌产生的Bt 蛋白进入土壤后，与土壤粘粒和腐殖酸迅速结合，结合态的Bt蛋白仍然保持杀虫活性，而且不易被土壤微生物分解，保持杀虫活性的结合态Bt蛋白在土壤中存留时间至少可达234d［37］.土壤酶活性反映了土壤中各状况密切相关.目前，有关转Bt基因作物对土壤生态功能影响的报道极少.吴伟祥等［38］在实验室条件下发现Bt 水稻秸秆种生物化学过程的强度和方向，是土壤微生物生态系统重要的生物学特性.土壤中的脲酶，磷酸酶、脱氢酶、纤维素酶、蔗糖酶和芳香硫酸酯酶等与土壤中的N、P、S、C等营养元素循环及植物营养对土壤蛋白酶、中性磷酸酶、脲酶的活性无显著影响，但对脱氢酶活性具有明显促进作用.孙彩霞等［39］实验发现，Bt水稻生长15d时，土壤脲酶的活性显著下降，土壤酸性磷酸酶的活性显著提高，而土壤芳香硫酸酯酶、蔗糖酶和脱氢酶活性的变化差异不显著；生长30d时，土壤脲酶的活性仍限制下降，土壤酸性磷酸酶、芳香硫酸酯酶和脱氢酶的活性显著升高，而土壤蔗糖酶活性的变化差异仍不显著.这种差异的产生可能是由于外源Bt基因插入水稻染色体中的某一位置引发不同生长发育阶段基因表达的多效性，进而引起水稻秸秆化学组成的变化所致.王洪兴等［40］研究了转基因水稻及其亲本秸秆在降解过程中对土壤微生物主要类群的影响，发现转Bt基因水稻细菌数量显著低于非转基因处理，转基因水稻真菌数量则显著高于非转基因和对照，放线菌数量则没有明显变化规律，非转基因秸秆降解反硝化细菌活性高于转基因，而解磷微生物活性处理之间无明显差异.3.3转Bt基因水稻花粉对昆虫的影响家蚕是我国重要的经济昆虫，有研究表明，家蚕取食了用Bt基因水稻花粉处理的桑叶后，对其致死率没有太大的影响，但对其体重和中肠细胞亚显微结构有一定影响［41，42］.但上述试验是室内处理剂量，实际稻桑工作环境下家蚕接触花粉的量远远小于室内处理剂量，可能不会造成太大影响.4转Bt基因水稻对昆虫产生抗性的影响苏云金杆菌杀虫剂在农业上的应用已有几十年的历史，由于Bt基因植物体内持续表达，害虫在整个生长周期都受到Bt杀虫蛋白的选择，将促使害虫对转基因植物产生相应抗性.害虫对转基因植物的抗性发展，不仅会削弱转基因植物本身的效益，而且会导致杀虫剂的再次大量使用，对环境产生负面影响.已知至少10种蛾类、2种甲虫和4种蝇类在实验室对Bt毒素产生了抗性，但在大田中仅有小菜蛾（Plutellaxylostella）对此毒蛋白产生了耐受性［43］，主要原因是Bt毒蛋白作用时间短，保留性低，使得选择压力小.有多项研究表明：敏感昆虫如一直以Bt植物为食会引起极高的致死率，从而达到防治害虫的目的；但另一方面，高杀死产生高的选择力，抗性产生和发展的速度与选择压力成正比关系，一旦害虫产生抗性，将对转Bt基因水稻的田间防治效果和可持续应用构成严重的威胁［44］.5转Bt基因水稻本身的性状变异对转Bt基因水稻的研究不仅需要关注其与近缘物种的基因流、害虫抗性以及非目标生物和生态系统的影响等问题，也要重视转Bt水稻本身生理生化特性的变化.不少文献报道了转基因植物会产生一系列性状变异.Lynch等［45］报道了转基因水稻表现出植株变小，花期推迟，育性降低等变异.吴刚等发现转Cry1A（b）、Cry1A（c）Bt基因的水稻在室温及田间生长条件下，与对照相比，在株高、穗长、单株粒重、百粒重和结实率等方面都显著降低，而单株有效分蘖数增多，生育进程推迟，落粒性增强.转基因植物性状变化除了由无性变异引起外，还由于外源基因的导入破坏了受体基因的活性，影响了受体植物的代谢过程，使表型发生了改变.所以在进行转Bt基因育种时，根据育种目标，选择优良表现型且较强杀虫活性的转基因植物，对于创造具优良性状的抗虫植物至关重要.185生命科学研究2009年贾乾涛等［46］报道了转Bt基因水稻中16种氨基酸，除叶片中蛋氨酸含量高于常规水稻外，其余氨基酸含量及其总量均低于常规水稻且绝大多数差异性显著，而茎杆中，转Bt基因水稻除组氨酸含量差异不显著外，蛋氨酸、酪氨酸、赖氨酸和脯氨酸含量与常规水稻差异性显著，其余氨基酸含量差异性均极显著.分析造成这种现象的原因可能是转Bt基因水稻中Bt基因的插入影响了水稻的生理生化反应，从而影响了氨基酸含量的变化及其表达.贾乾涛等［47］还对Bt水稻不同生长期几种重要成分的含量研究发现，在大部分生长期，Bt水稻和非Bt水稻氮、磷和硅的含量差异显著或极显著，但它们的变化趋势基本一致，氮和磷的含量在拔节期之后均呈下降趋势，而硅的含量则随水稻的生长发育呈上升趋势；在水稻生长前期，Bt水稻可溶性糖和还原性糖的含量不非Bt水稻低，但在后期比非Bt水稻高，且差异均显著或极显著，这表明Bt基因的插入使水稻的生理生化过程发生了变化，从而造成了生化物质含量的差异，但是这种变化究竟是与Bt基因有关还是与启动子有关或基因插入的位点有关尚待进一步深入研究.6展望目前的研究大多停留在实验室水平，而转Bt 基因水稻释放的现实环境为大田，因此有必要开展大田条件下的综合研究.将室内与大田研究相结合，更能反映实验室结果的可靠性与真实性，由于大田条件下影响影子繁多（如土、肥、气、热和水等），加大了研究的难度.但随着新技术与方法的不断引入和研究力度的加大，必将加快这方面的研究进程，从而使转基因植物朝着有利于人类生存与发展的方向前进.转Bt基因水稻的研究为防治害虫提供了一个较为经济便捷的途径，但转Bt基因水稻田是一种比较特殊的生态系统，它对鳞翅目害虫的控制，会使得其田间的物种的种类，节肢动物的优势度发生变化.因此转基因水稻对环境安全性的影响还需要更深入和长期的研究.对于转Bt基因水稻而言，目前在田间还未发现对Bt杀虫蛋白产生抗性的害虫类型，但这并不表明抗虫转基因水稻在靶标害虫的抗性上没有生态风险，昆虫成虫的移动和交配的细节是一定困难的，需要数年的跟踪和数据的积累.转Bt基因水稻通过食物链的传递是否对生态环境产生影响，必须通过其在生态系统中长期积累和级联放大效应才能最终显现出来，因此需要进行长期延续不断的调查研究.任何新技术都存在不同程度的风险，因此，不能因为暂时还没有发生转基因植物危害人畜和生态环境的案例而忽视其安全性问题，在转Bt 基因水稻投放市场前必须经过科学、严谨和长期的安全性评价.其生物安全性对策是：1）坚持“实质等同性”原则.对环境和生态系统进行长期的跟踪研究，确认其生物安全性.2）采用“终止子技术”.使Bt水稻收获的种子在诱导剂作用下不能育种.3）“高剂量”和“避难所”策略相结合.因高剂量能杀死大多数的抗性杂合子，且庇护所的代价小，易被农民接受.同时，避难所可以去除昆虫对Bt杀虫晶体蛋白产生的抗性基因，防止抗性等位基因在昆虫群体中固定，并且可以稀释昆虫群体中产生的抗性.4）“多基因”策略.针对Bt杀虫晶体蛋白只对某一种或几种害虫具有毒杀作用，而且害虫对Bt杀虫晶体蛋白产生抗性的问题，可以采用两种以上不同的对昆虫无交互抗性的Bt杀虫晶体蛋白基因转化植物或者使用Bt杀虫晶体蛋白和其它不同杀虫机理的杀虫蛋白组合，同时或分别导入同一受体植物内，避免昆虫产生抗性.总之，为了使转Bt基因水稻能早日得到推广，同时又保证安全，科研人员还需要在安全性方面着手，力争从转Bt基因水稻对人类、环境、生态等方面多层次、多角度地进行研究，以确保生物技术的健康发展.参考文献（References）：[1]杨友才，周清明.转基因水稻研究进展[J].湖南农业大学学报（自然科学版）（YANG You-cai，ZHOU Qing-ming.Adv- ances of the research on rice gene transformation[J].Journal ofHunan Agricultural University），2003，29（1）：85-88.[2]朱祯.高效抗虫转基因水稻的研究与开发[J].中科学院院刊（ZHU Zhen.Research and development of highly insert-resistant transgenic rice[J].Bulletin of the Chinese Academy of Sciences），2001，（5）：353-357.[3]HERDT R W.Research priorities for rice biotechnology//KUSHG S，TOENNIESSEN G H.CAB International.Philipippines：Wallingford/IRRI，Los 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转基因水稻
背景技术
转基因生物技术的研究，大多分布在抗虫基因工程、抗盐基因工程、抗病基因工程、抗逆基因工程、品质基 因工程、品质改良基因工程、控制发育的基因工程等领域。如抗虫基因工程将Bt基因导入棉花、玉米、水稻、烟 草、马铃薯等作物，毒杀害虫；或将胶蛋白酶抑制剂基因导入作物，干扰害虫消化作用，而导致害虫死亡。
参考资料 1 转Bt/CpTI基因水稻知识产权调查报告 ．知网[引用日期2019-09-16] 2 中国转基因水稻获美国 食用许可 ．新浪[引用日期2018-07-24] 3 一种与植物抗盐相关的蛋白及其编码基因与应用 CN 103626857 A ．谷歌[引用日期2014-04-02] 4 Bt蛋白Cry2Ac-like、其编码基因及应用 ．谷歌[引用日期2014-04-02] 5 转基 因水稻研发进展 ．上海农科院图书馆[引用日期2014-08-18] 6 湖北曾铲除上万亩转基因水稻 7 美开始种......
中国农科院植保所研究员吴孔明透露，首个获批的是华中农业大学张启发院士课题组的Bt抗虫转基因水稻， 接下来要进行品种审定、种子生产许可、种子经营许可等常规品种需要经历的程序，离商业化还需2-3年时间。
通过安检
该实验室在回复给书面报告中表示，农业部向该校发放的转基因水稻 “华恢1号”和“Bt汕优63”的安全 证书，签发日期为2009年8月17日，有效期5年，适用地为湖北。
国际水稻所将抗虫基因导入水稻，育成抗二化螟、纵卷叶螟的转基因水稻。
1995年，中国农科院开始Bt抗虫转基因水稻的研发工作。1999年成果通过了农业部的成果鉴定，同年开始 中间实验。
2001年，美国批准一种药用型转基因水稻商业化种植。
2002年，中国农科院Bt抗虫转基因水稻完成环境释放，2003年到2004年进行生产性试验。
抗虫转基因水稻检测技术研究综述
抗虫转基因水稻检测技术研究综述抗虫转基因水稻是通过将特定的抗虫基因导入水稻，使其具有抵抗虫害的能力。
为了确保转基因水稻的安全性和环境友好性，对其进行检测是非常重要的。
本文综述了目前常用的抗虫转基因水稻检测技术。
一、抗虫鉴定技术抗虫鉴定是通过观察转基因水稻对虫害的抵抗性来确认其是否为抗虫转基因水稻的方法。
这是最直观的检测方法，但需要大量的时间和劳动力。
二、基因组学方法1. PCR技术PCR技术是一种常用的转基因水稻检测方法。
通过特异性引物，可以扩增出抗虫基因在转基因水稻中的片段。
这种方法能够准确快速地检测出转基因水稻的存在。
2. Southern blottingSouthern blotting是一种基于DNA的电泳分离和转移的技术。
通过使用与抗虫基因相应的DNA探针，可以检测出转基因水稻中抗虫基因在基因组中的存在。
2. ELISA技术ELISA技术是一种常用的免疫学检测方法。
通过使用与抗虫蛋白相应的抗体，可以检测出转基因水稻中抗虫蛋白的含量。
四、转录组学方法转录组学是研究一个细胞或组织中基因转录过程的一种方法。
通过分析转基因水稻和野生型水稻的RNA序列差异，可以检测出转基因水稻中抗虫基因是否被表达和转录。
抗虫转基因水稻的检测技术主要包括抗虫鉴定、基因组学方法、蛋白质组学方法和转录组学方法。
这些方法在检测抗虫转基因水稻中起到了重要的作用，并且随着科技的不断发展和进步，这些方法也在不断完善和优化，提高了检测的准确性和效率。
我们也需要加强对转基因水稻检测技术的研究，以满足抗虫转基因水稻的安全性和环境友好性要求。
转基因抗虫水稻生态安全性研究进展_韩兰芝
应用与环境生物学报 2006,12(3):431～436 C h in J A ppl Environ B iol=ISSN10062687X 2006206225转基因抗虫水稻生态安全性研究进展3韩兰芝 吴孔明33 彭于发 郭予元(中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室 北京100094)摘 要 我国转基因抗虫水稻的商业化种植已成为国内外广泛关注的热点问题.本文系统综述了转基因抗虫水稻的遗传转化、基因漂流、靶标害虫的抗性风险、对非靶标生物和稻田节肢动物群落的影响以及B t杀虫蛋白在土壤中的残留等方面的研究进展.现有研究表明,B t水稻对二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等主要靶标害虫具有较高的抗性水平,对稻飞虱、叶蝉、捕食性天敌等非靶标生物的生长发育和稻田节肢动物群落的稳定性无明显影响.靶标害虫的抗性和转基因水稻与杂草稻、野生稻之间的基因漂移风险是转基因抗虫水稻商业化种植的主要环境安全问题.参60关键词 转基因抗虫水稻;靶标和非靶标生物;节肢动物群落;抗性治理;基因漂流;环境安全CLC S511.035.3:S435.112Research Advances i n Ecolog i ca l Safety of I n sect2Resist an t Tran sgen i c R i ce3HAN Lanzhi,WU Kong m ing33,PE NG Yufa&G UO Yuyuan(S tate Key L aboratory for B iology of P lant D iseases and Insect Pests,Institute of Plant Protection,Chinese Acade m y of A gricultural Sciences,Beijing100094,China)Abstract Commercializati on of insect2resistant transgenic rice in China has become an i m portant debatable issue in the world.The current advances in insect2resistant gene transfor mati on,gene fl ow,resistance manage ment of target pests,i m pacts on non2 target organis m and arthr opod community structure in rice habitat,and degradati on and re mains of B t t oxin in s oil are revie wed in this paper.The p investigati ons show that B t rice possesses high efficiencies f or contr olling the stri ped stem borer, yell ow stem borer and rice leaf r oller,and there are no significant differences in gr owth and devel opment of non2target organ2 is m s,such as rice p lanthoppers,leafhoppers and p redat ors,and the stability of arthr opod community structure bet w een B t rice and conventi onal rice habitats.It is indicated that gene fl ow fr om transgenic rice t o weed rice or wild rice,and resistant man2 agement of target pests t o B t rice are the maj or ecol ogical risks f or commercializati on of B t rice.Ref60Keywords insect2resistant transgenic rice;target and non2target organis m;arthr opod community structure;resistant manage2 ment;gene fl ow;ecol ogical safetyCLC S511.035.3:S435.112 水稻是世界上最重要的粮食作物之一,全世界有30多亿人口以稻米为食.同时水稻又是虫害最多的粮食作物之一,田间害虫种类达624种以上,每年因虫害损失的稻谷占总产量的5%～10%[1].特别是近年来,二化螟等蛀茎害虫的发生正逐年加重,对水稻生产造成严重威胁.传统化学防治方法的长期使用,不但增加生产成本,造成环境污染,而且还破坏了生态平衡,因此选育抗虫水稻是防治害虫最经济、有效的方法.随着植物细胞生物学和分子生物学的发展,利用转基因工程将外源抗虫基因导入水稻,使水稻自身产生抗虫蛋白从而达到防治害虫的目的已成为现实.1993年,Fuji m ot o等首次报道成功获得转B t基因水稻以来[2],众多研究者又相继将不同类型的B t杀虫蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因和植物或动物源凝集素基因转入不同水稻品种,获得一系列对靶标害虫控制效果显著的转单价或双价抗虫基因水稻[3～13],这些研究均为水稻害虫的防治提供了新策略.由于转入的外源基因并非来自传统基因库,转基收稿日期:2005203221 接受日期:20052042253国家973项目资助(No.001CB1090) Supported by the State"973"Pr ogra m of China33通讯作者 Corres ponding author(E2mail:wkm@)因抗虫水稻可能带来的生态效应和环境风险已成为国际社会关注的焦点.近年来转基因抗虫水稻的研究概况、靶标害虫的抗性风险、对非靶标生物、稻田节肢动物群落及根际土壤生态系统的影响以及基因漂移等均有大量报道,现就有关进展综述如下.1 转基因抗虫水稻的研究概况在水稻抗虫方面,应用最多的杀虫蛋白为苏云金杆菌(B acillus thuringiensis,B t),它是一种能够产生晶体蛋白(in2 secticidal crystal p r otein,I CP)的芽孢杆菌,靶标害虫取食B t 后,晶体蛋白在昆虫碱性肠道内溶解,经中肠蛋白酶的消化作用,将晶体蛋白降解为活性蛋白,活性蛋白与中肠膜受体结合,毒蛋白插入昆虫中肠细胞膜内,形成跨膜离子通道或孔,导致细胞溶解,最终使昆虫死亡[14].它还具有专一性强、效果好、对人畜安全等优点,因此B t成为转基因技术的首选材料.1993年,Fuji m ot o等用原生质体电激法将经修饰的C ryl A b基因导入粳稻,首次获得高表达的B t水稻植株[2],其后一些研究者又选择不同的启动子,利用基因枪法分别将C ryl A b或C ryl A c基因导入一系列籼稻和粳稻品种中,获得高表达且对靶标害虫幼虫致死率高达90%以上的转基因植株[3,4].在国内转单价抗虫水稻也取得突破性进展,1998年,浙江大学与渥太华大学合作,利用农杆菌介导法将经修饰的C ryl A b基因导入粳稻品种“秀水11”,获得遗传性高度稳定的克螟稻及其一系列衍生品种,目前该品种已经农业部审批在浙江省进入生产性试验阶段[10].除B t外,某些植物源基因如蛋白酶抑制剂基因和植物源凝集素基因也具有较好的抗虫效果.蛋白酶抑制剂广泛分布于植物组织和器官中,能够削弱或阻断蛋白酶对食物中蛋白质的消化,导致昆虫非正常死亡.转马铃薯蛋白酶抑制剂基因(Pin Ⅱ)水稻和转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)水稻,均对大螟具有较好的抗性[5,6].植物凝集素(lectin)是一类能特异识别并可逆结合糖类复合物的非免疫性球蛋白.当被昆虫吞食至消化道时,与昆虫肠道周围细胞壁膜糖蛋白结合,影响营养物质的吸收,并在消化道内诱发病变,使昆虫致病而死亡.目前在转基因工程方面应用最多的有雪花莲凝集素(G NA)、豌豆凝集素(P2lec)和半夏凝集素(PT A)等.转雪花莲凝集素基因水稻对小褐飞虱(L aodelphax striatellus)和褐飞虱(N ilaparvata lu2 gens)表现出明显的抗性,既能降低其存活率又能降低其产卵能力并延迟发育[7,8].由于害虫极易对单个抗虫基因产生抗性,因此将两种或两种以上具有不同杀虫机制的基因导入同一植物中可有效延缓抗性的产生.Cheng等以U bi基因为启动子,利用农杆菌介导法获得转C ryl A b/C ryl A c双价抗虫基因水稻[9].卫剑文等用基因枪法获得转C ry1A b/SKTI(大豆胰蛋白酶抑制剂基因)基因籼稻[11].中科院遗传所采用农杆菌介导法将C ry1A c和经修饰的CpT I基因共同转入水稻“明恢86”,获得对靶标害虫具有较强抗性的双价抗虫水稻[12],目前该品种已批准在北京和福建进入环境释放,且产业化形式良好.J iang等将C ryl A b、C ryl A c和抗白叶枯基因Xa21共同转入籼稻“明辉63”中,表现出既能抗虫又能抗病的双重性能[13].2 转基因抗虫水稻生态安全性评价2.1 靶标害虫对其抗性的风险评价2.1.1 抗虫蛋白的表达及其抗虫性 B t水稻中杀虫蛋白的表达呈一定的时空性,即水稻主茎叶片中的B t杀虫蛋白含量在孕穗期最高,抽穗期最低;空间上茎、叶、叶鞘中表达量较高,根中表达量相对较低[15].转C ry1A c/CpT I的双价抗虫水稻中Cry1Ac杀虫蛋白的表达量一般以生育前期较高,生育后期较低.时间上,主茎叶片中杀虫蛋白的含量在拔节期最高,孕穗期开始下降,扬花期和灌浆期最低,到成熟期略有回升.主茎中杀虫蛋白的含量在苗期、拔节期和扬花期较高,种子中含量最低.灌浆前对二化螟初孵幼虫的致死率为90%;灌浆后抗虫性有所下降,致死率约为60%[16].2.1.2 靶标害虫对转基因水稻的抗性水平及其抗性治理策略不同地理种群的二化螟对B t杀虫蛋白的敏感性存在显著差异,相差倍数达10倍以上.如湖南长沙种群对Cry1Ac和Cry1Ab两种杀虫蛋白均表现不敏感;山西安康种群对Cry1Ac 表现高度敏感,北京海淀种群对Cry1Ab表现高度敏感[17].连续3年的田间调查表明,转C ry1A b基因水稻K MD1和K MD2对稻纵卷叶螟幼虫均表现高抗水平[18].Bentur等采用F2代遗传浓缩法从450个三化螟单雌系中未检测到高抗基因的存在,估计田间种群的抗性初始基因频率<3.6×10-3,说明三化螟种群对转C ry1A b基因水稻还处在敏感水平[19].虽然目前靶标害虫还未对转基因水稻产生抗性,但对其他转基因植物的研究表明,B t杀虫蛋白几乎在转基因植物整个生育期的各个部位表达,对靶标害虫的多个世代具有选择压力,容易产生抗性.虽然目前的报道小菜蛾是唯一在田间对B t 植物产生抗性的害虫[20,21],但在室内却已筛选出多种对B t杀虫蛋白产生高抗的种群[22～24].因此有学者预测,靶标害虫对B t植物的潜在风险,将成为制约其推广和应用的关键因素[25].毋庸置疑,转基因水稻也将面临同样的命运,因此开展靶标害虫对转基因抗虫水稻的抗性风险评价和抗性治理已成为当前亟待解决的问题.庇护所策略是目前害虫抗性治理的主要方法[26].其原理为在B t作物周围种植一些非B t作物,作为敏感害虫的庇护所,使敏感个体与B t植株上的抗性个体随机交配,产生的杂合子后代在B t植株上不能存活,从而达到治理害虫的目的.庇护所的方式有两种:一种是B t作物与常规作物的种子混合种植,呈随机分布,常规作物作为敏感虫源的庇护带.另一种在B t作物周围设置特定的区域种植非B t作物.非B t作物何种分布形式的选择要根据害虫的取食和运动特性决定.对于幼虫单食性、运动性差和成虫扩散能力弱的害虫,可选用随机分布形式;而对于幼虫多食性、运动性强且成虫能远距离迁飞的害虫如棉铃虫,适宜选择分区种植方式.但大多数研究认为,分区种植能更好地保护敏感个体[27,28].对二化螟和三化螟的研究表明,幼虫在B t和非B t稻田的迁移,削弱或限制了庇护所的作用[27,28],抗性治理的最好办法是分区种植,保护区与B t稻田的距离在l k m内较适宜[29].庇护所面积的大小、远近也影响该策略的成功与否,对成虫迁移扩散能力强的害虫来说,庇护所的面积可小一些,与B t田的距离可远一些;反之庇护所面积要大,与B t作物间隔的距离也要近.另外,如果B t作物能够高表达,只需较小的庇护所即可,反之庇护所面积就要扩大.目前“高剂量”与“庇护所”策略相结合被认为是B t作物抗性治理的最佳方式.因高剂量能杀死大多数的抗性杂合子,且庇护所的代价较小,易被农民接受.在国外,就棉铃虫的抗性治理,已形成了特定的种植模式.在美国:80%B t棉花+20%普通棉花或95%B t棉花+5%普通棉花(不防治棉铃虫);在澳大利亚:30%B t棉花+70%普通棉花[30].我国虽然还没有这种种植模式,但在华北B t棉种植区已形成了其独特的抗性治理方式,即棉花、玉米、大豆、花生等多种棉铃虫寄主作物小规模交叉混合种植,为棉铃虫提供了天然庇护所.春播玉米、花生和大豆为第2代棉铃虫提供庇护所,早播和晚播夏玉米的穗期可分别为第3、4代棉铃虫提供庇护所[31].同样,水稻害虫的抗性治理可借鉴转基因棉的成功经验.除水稻外,茭白、荸荠也是二化螟的寄主;大螟除了危害水稻外,还危害糯玉米;禾本科和莎草科杂草也是稻纵卷叶螟完成世代发育的寄主.因此在栽培制度上,可考虑B t水稻与茭白和荸荠间作或隔离种植.另外,还可考虑水旱田间作或相邻种植,如在稻田周围种植糯玉米,田埂或地头适当保留一些杂草,这些措施均可为水稻害虫的抗性治理提供帮助.除庇护所策略外,多基因策略也是延缓害虫抗性的有力措234 应用与环境生物学报 C h in J A ppl Environ B iol 12卷施.Lee等研究认为,C ry1A a或C ry1A c与C ry1C或C ry2A间的组合是治理二化螟和三化螟的有效措施,最近研究发现, C ry1A b与C ry1C或C ry2A间的组合也是非常有效的[32].M aq2 bool等将C ry1A c和C ry2A杀虫蛋白基因转入水稻中,发现两种杀虫蛋白的表达量均较高,且抗性治理只需较小面积的庇护所即可[33].2.2 对非靶标生物及稻田节肢动物群落的影响水稻是稻田生态系统的基础,转基因水稻的介入无疑会影响以水稻为基础的整个稻田生态系统.首先,转基因水稻通过食物链对第二营养层植食类昆虫的生长发育和繁殖产生直接影响;其次对以植食类昆虫为食的寄生或捕食性天敌产生间接影响;最后转基因水稻本身的物理性状、农艺性状、营养物质、挥发性和非挥发性次生物质等都可能产生非预期的变化,进而对各个营养层的节肢动物种类组成、数量和发生动态产生非预期的影响,从而引起稻田群落结构的变化.2.2.1 对非靶标害虫的影响 目前研究表明,在高强度B t 杀虫蛋白选择压力下,靶标害虫种群密度可能下降到相当低的水平,非靶标害虫稻蓟马、飞虱和叶蝉等因生存竞争压力减小,引起种群数量上升[34,35].并不是B t水稻都能促进非靶标害虫种群数量的上升,Bernal等研究认为,B t水稻对褐飞虱及其天敌黑间绿盲蝽(Cyrtorrhinus lividipennis)的取食、生长发育和存活均无显著影响[36].褐飞虱在取食和产卵时对转C ry1A c/CpTI 抗虫水稻无明显选择性,但白背飞虱若虫和成虫均明显趋向转基因水稻[37].在晚稻生长后期,转C ry1A c/CpTI稻田的褐飞虱种群数量明显上升[38].转C ryl A b/C ryl A c杂合基因籼稻在移栽后的早中期和中后期能促进白背飞虱和黑尾叶蝉的若虫发生,但在其它时期,均无显著影响[39].可见转基因抗虫水稻对非靶标害虫的控制作用不明显,在一定程度上还因施药量的减少促进其种群数量的上升.2.2.2 对天敌昆虫的影响 二化螟绒茧蜂寄生取食B t水稻(C ryl A b)的二化螟后,其结茧率和寄生率均显著低于对照,且对蜂的大小也有影响,即茧长和前翅长均小于对照[40].陈茂等研究发现,稻飞虱和叶蝉的卵寄生蜂———稻虱缨小蜂(A nagrus s p.)和叶蝉柄翅小蜂(L ynaenon longicrus)多从B t籼稻区向对照区扩散,因而推测B t水稻可能影响寄生蜂的搜索行为[35].在克螟稻和转C ryl A b/C ryl A c杂合基因籼稻田中,靶标害虫寄生蜂———茧蜂或姬蜂的数量一般低于或显著低于对照,而非靶标害虫寄生蜂和捕食性天敌与对照没有显著差异.克螟稻和转C ryl A b/C ryl A c杂合基因籼稻对捕食性天敌无明显负作用,有时甚至呈现一定的正效应[39].值得注意的是,B t稻田内靶标害虫种群数量的下降,直接影响了寄生性天敌的生长发育和种群增长,但并不代表转基因抗虫水稻本身对寄生性天敌产生负面效应.B t水稻对寄生性天敌的影响比较复杂,需要从多方面进行深入研究.2.2.3 花粉漂移的风险评价 家蚕是我国重要的经济昆虫,有研究表明,家蚕取食了用B t水稻花粉处理的桑叶后,对其致死率没有太大影响,但对其体重和中肠细胞亚显微结构有一定影响[41,42].但上述试验均是室内处理剂量,实际稻桑共作环境下家蚕接触花粉的量远远小于室内处理剂量,可能不会造成太大影响.2.2.4 对稻田节肢动物群落多样性的影响 大多数情况下,转C ryl A b/C ryl A c籼稻对稻田节肢动物群落功能团组成及结构无明显的负面影响[39].在生长发育的前中期,转C ry1A c/ CpTI水稻对稻田节肢动物群落产生一些负面作用,但在其它时期对群落没有明显影响[38].转B t汕优63稻田对节肢动物群落不但没有显著影响,而且还较对照田稳定[43],因此就目前研究可知,转基因抗虫水稻并未对稻田节肢动物群落的稳定性产生影响.2.3 杀虫蛋白在土壤中残留的风险评价B t水稻的长期种植可能会使B t杀虫蛋白在土壤中残留、富集.而土壤生态系统是生物循环和能量转化的重要场所,B t 杀虫蛋白在土壤中的富集可能影响土壤中的特异生物功能类群及土壤生物多样性.因此,近年来B t杀虫蛋白在土壤中的残留及其对土壤生态系统的影响逐渐受到国内外研究者的关注.2.3.1 B t杀虫蛋白在土壤中的残留及降解 B t杀虫蛋白在土壤中残留的主要原因有:(1)B t作物在生长期间通过根部可持续向土壤中分泌B t杀虫蛋白[44];(2)植株伤口流出物、木质部流体、花粉及B t作物收获后残留在田间的植株残体都可造成大量B t毒蛋白的残留和累积[45].B t杀虫蛋白在土壤中能否长期存在取决于B t蛋白浓度的增加速率、微生物降解速率和非生物的钝化速率等[46,47].当B t作物向土壤中释放的B t蛋白的量超出了靶标生物的消耗、微生物的降解和非生物因素的钝化时,额外的毒蛋白就会与具有表面活性的土壤微粒结合,抑制了土壤微生物的降解,造成B t杀虫蛋白在土壤中长期存在并富集.不同土壤环境中Cryl A b杀虫蛋白的降解速度是不同的,但均以前期较快,中后期较慢,其中青紫泥田的降解最快,其次为黄筋泥田,黄松泥田中降解最慢,且淹水可显著加快水稻组织残体的腐解,从而促进毒蛋白的降解.淹水和非淹水条件下,埋入土壤中的华池B6水稻叶片中Cry1Ab毒素降解的半消减期大约分别为3d和7d.土壤微生物、含水量、pH 和温度均与Cryl A b杀虫蛋白的降解速率呈显著的正相关关系[48].2.3.2 B t杀虫蛋白在土壤中的杀虫活性 转基因作物释放的杀虫蛋白进入土壤后是否仍保持活性是评价其对土壤生态系统影响的重要指标.研究表明,B t杀虫蛋白与土壤中具有表面活性的微粒结合后,可降低土壤微生物对其的敏感程度并抑制微生物的降解,但并没有改变B t杀虫蛋白的结构,所以仍保持并甚至增强了其杀虫活性[46,49],如结合到土壤矿物质和粘粒的B tk和B tt毒素仍保持对烟草天蛾幼虫(M enduca sexta)和科罗拉多马铃薯甲虫幼虫(L eptinotarsa dece m lineata)的较高毒性[49].2.3.3 B t杀虫蛋白对土壤微生物的影响 有研究表明,淹水条件下,克螟稻秸秆的添加有时可显著提高土壤可培养微生物如需氧性细菌、放线菌、真菌的数量及一些脱氢酶的活性,但对土壤微生物群没有明显的毒害作用[50].值得注意的是,土壤中微生物种类繁多,B t水稻对土壤微生物群落的影响并不是单靠培养几种微生物而能得出结论,更重要的是进行长期监控,综合评价.2.4 转基因水稻的基因漂流基因漂流是转基因植物生态风险评价的重点内容之一.所334 3期韩兰芝等:转基因抗虫水稻生态安全性研究进展 谓基因漂流(gene fl ow/dis persal),就是将基因从一个群体的基因库转移到另一个群体的基因库.其漂流途径主要有两条[51]:一是通过转基因植物的种子或组织扩散到新的生境中,并生存下来;二是通过花粉向同种或近缘种的非转基因植物转移.其可能产生的风险有:(1)通过基因流将外源基因转入杂草稻中,使其含有了外源基因而成为超级杂草;(2)野生稻的基因库可能被污染或毁灭,给生物多样性造成危害;(3)转基因水稻向栽培稻不育系高频率的基因漂流可能导致非转基因稻米的污染.2.4.1 栽培稻 尽管水稻为自花授粉植物,但栽培稻之间仍存在低水平的天然杂交.普通栽培稻(O ryza sativa)与非洲栽培稻(O.glaberri m a)共同存在时,天然居群的杂交率为0.8%～1.6%,并产生可育的后代[52],且基因流一般是单向的,即从普通栽培稻到非洲栽培稻.转基因水稻与栽培稻之间发生漂流主要是向杂交稻不育系进行漂流,漂流频率一般在50%以上,而转基因水稻与恢复系之间的漂流频率相对低得多,一般为1.8%～4%.这是因为育种家为了提高制种效率,长期选育柱头外露率和异交率远高于普通水稻和杂交稻品种的不育系,可见转基因水稻向杂交稻不育系的漂流是基因漂流研究的重点.2.4.2 杂草稻 “杂草稻”是指在栽培稻田里变成杂草的野生稻,主要包括“红稻”和7种其他的野生稻,其遗传关系与栽培稻非常接近.杂草稻的分布范围特别广,拉丁美洲95%的水稻生长地、越南63%的水稻生产地和东南亚等地区都存在大量杂草稻[53].在直播田中,栽培稻很容易和红稻进行杂交并产生可育的后代,并且其杂交范围非常广,杂交率也比较高(某些品种的杂交率>50%)[54,55],因此稻田中可滋生许多新的生态型杂草稻.就目前研究可知,抗虫、抗病基因的转入可能增加杂草稻的竞争优势,产生入侵和破坏能力更强的杂草[56].但在我国的主要水稻产区,迄今未见有关杂草稻的报道,转基因水稻中外源基因向相关杂草的漂移主要考虑向稗草漂流的可能性.2.4.3 野生稻 水稻野生近缘种分布于除美国之外的所有水稻种植区,是宝贵的水稻育种资源.栽培稻、普通野生稻(O. rufipogon)和一年生野生稻(O.nivara)都属于AA型基因组,所以能在田间发生基因流,并对野生稻造成破坏.如我国和印度的许多野生稻分布于栽培稻种植区内,两者之间已发生了不同程度的基因渐渗.亚洲野生稻与普通栽培稻之间的生殖隔离相对较小,二者之间杂交后代的平均花粉可育度大约为80%[57],但天然生境下最大基因流频率约为3%[58].在湖南茶陵自然条件下检测“明恢63”向普通野生稻的最大基因漂流频率为2.94%,最大漂流距离为43.2m[59].可见,栽培稻与野生稻之间较高频率的基因流,加速了野生稻资源的破坏,如台湾野生稻的灭绝就是一个非常典型的例子[60].虽然目前还不太清楚B t或CpT I等抗虫基因对野生稻种群的影响,但不可否认,大面积商品化种植转基因水稻后,二者之间的基因流可能加快我国野生稻资源的破坏.以上可知,转基因水稻到相关物种存在基因流的前提条件[58]:(1)相容居群间的空间重叠;(2)必须存在花期相遇;(3)居群之间必须存在杂交的可能性,并产生可育的杂交后代.在我国,转基因水稻花粉的漂流主要是对野生稻和杂交稻不育系造成污染,目前最可行的办法就是对转基因水稻种植区与野生稻分布区、杂交稻育种区进行空间隔离,阻断花粉的漂流;其次就是将三者的生育期错开,阻断其花期相遇.3 转基因抗虫水稻安全性研究的对策与展望转基因抗虫水稻具有广阔的应用前景,它不但可提高水稻产量,降低农业生产成本,还可减轻化学农药造成的环境污染,实现农业可持续发展.当然,在肯定转基因抗虫水稻对人类巨大贡献的同时,并不能否认其潜在的生态风险.虽然目前国内外对转基因抗虫水稻生态安全性的研究已取得一些进展,但仍存在许多未知领域.针对目前转基因抗虫水稻的研究现状,应对其大规模商品化种植后,可能出现的生态风险进行长期的系统监测,同时加强转基因植物生物安全的试验技能研究,发展快速准确检测转基因植物生态风险的新方法、新技术,建立完善的转基因抗虫水稻生态安全评价体系.只有这样,才能充分发挥其在农业生产上的巨大潜力,同时将生态风险降低到最低水平.References1 Pathak MD,Khan ZR.I nsect Pests of R ice.Manila,The Phili pp ines:I nternati onal R ice Research I nstitute,19942 Fuji m ot o H,It oh K,Ya mamot o M,Kyozuka J,Shi m a mot o K.I nsect resistant rice generated by intr oducti on of a modified delta2endot oxin gene of B acillus thuringiensis.B iotechnology,1993,11:1151～1155 3 Nayak P,Basu D,Das S,Basu A,Ghosh D,Ramakrishnan NA, Ghosh M,Sen SK.Transgenic elite indica rice p lants exp ressing C ryl A c delta2endot oxin of B acillus thuringiensis are resistant against yell ow ste m borer.P roc N atl Acad Sci USA,1997,94:2111～21164 Datta K,Vasquez A,Tu J,Torriz o L,A lam MF,O liva N,Abrigo E, Khush GS,Datta 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抗虫转基因水稻研究概况及其安全性
抗虫转基因水稻研究概况及其安全性作者：宋子叶林秀峰严一字来源：《农业与技术》2020年第08期摘要：抗虫转基因水稻作为新时代基因工程的产物，为解决水稻虫害、滥用杀虫剂提高水稻产量等问题做出了重大贡献。
Bt杀虫蛋白对害虫具有高度特异性，因此抗虫转基因水稻不会对人类造成危害。
大量研究数据表明，与普通水稻相比，抗虫转基因水稻在水稻固有性狀、非靶标害虫及其天敌影响、基因漂移风险、土壤酶活性等多方面均无显著影响。
关键词：抗虫水稻;转基因;安全性中图分类号：S511 ; ; ; 文献标识码：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200430004水稻是世界上最主要的粮食作物之一，为全世界近1/2人口提供了主食[1]。
水稻结的果实叫做稻谷，稻谷脱去颖壳后是糙米，糙米碾去米糠层就是人们日常食用的大米。
糙米富含淀粉，并含有8%的蛋白质和少量脂肪以及核黄素、铁和钙等营养元素，碾去外壳的大米营养价值大大降低，故而现代社会健康生活提倡大家平时多吃糙米粗粮。
日前国家统计局发布数据称，我国人口已经突破14亿大关[2]，这意味着粮食问题仍然严峻，如何更高效地提高水稻的产量，这是相关科研人员及育种家重点研究的方向。
事实上，影响水稻产量的因素有很多，但虫害是影响水稻产量及稻米品质的一大要素，人类很久之前就发现了这一影响因素，于是化学杀虫剂应运而生。
杀虫剂在刚发明时，人们觉得杀虫剂在防治害虫等方面的效果远大于其产生的弊端，但是人们没有想到，1939年米勒发明化学杀虫剂之后，短短20a，施用量就需要提高1倍才能有效地防治害虫。
使用化学杀虫剂防治害虫，不仅能够带来农药残留、污染环境等问题，更可能出现“超级害虫”等极端现象，故而科学家们从问题的源头出发，研究能抵抗害虫侵袭的水稻品种。
但水稻自身抗虫基因匮乏、且利用传统育种方法培育抗虫水稻品种需要时间长，且效率低，还要依靠育种家的经验以及符合条件的优良亲本等一系列条件，致使直到现在，都没有依靠传统育种方式成功培育出抗虫水稻。
抗虫转基因水稻检测技术研究综述
抗虫转基因水稻检测技术研究综述本文主要综述抗虫转基因水稻检测技术的研究进展、方法和存在的问题。
随着人们对粮食安全的关注越来越高，转基因水稻的研究也日益受到重视。
一、抗虫转基因水稻的研究进展抗虫转基因水稻是指通过基因工程技术向水稻中导入具有抗虫性状的基因，使其获得抗虫能力。
自上世纪90年代开始，人们开始对基因工程水稻进行抗虫研究。
最早的抗虫转基因水稻是由细菌土壤杆菌(Bacillus thuringiensis)基因bap导入的，该基因编码了一个芽孢杆菌δ-内毒素(Cry1Ab)。
该转基因水稻具有对稻飞虱、褐稻虱等昆虫的抗性。
现在，随着对抗虫转基因水稻研究的深入，出现了更多的转基因水稻品种，其抗虫性状来源于不同的基因。
例如，植物DNA会产生RNA干涉和抗病蛋白(harpin)，它们都可以使水稻表现出抗性。
另外还有一些基因，如mir1和mir2，可以导致水稻产生蛋白质类似物，并且具有对稻飞虱、褐稻虱等昆虫的毒杀活性。
1. PCR检测法PCR是一种通过扩增靶DNA序列来进行检测的技术。
PCR技术通常用于检测从转基因水稻中导入的外源基因。
PCR检测法可靠而且快速，并且对小样品具有高度灵敏度。
目前，PCR检测法有两种类型：定量PCR和定性PCR。
定量PCR可以定量检测目标DNA序列的数量，而定性PCR则可以只确认样品中是否存在目标DNA序列。
2. 蛋白质检测法蛋白质检测法是通过检测转基因水稻中的外源蛋白质来进行检测的一种技术。
例如，如果转基因水稻中导入了Bt基因，则可以使用ELISA检测试剂盒检测水稻中是否含有Bt蛋白质。
3. 质谱法质谱法是一种通过检测转基因水稻中外源蛋白质的氨基酸序列来进行检测的技术。
利用质谱技术可以直接检测抗虫蛋白质的存在和数量，并且具有高度的灵敏度和准确性。
三、存在的问题和未来发展方向转基因水稻的检测方法虽然已经相当完善，但也存在一些挑战和问题。
首先，质量控制问题。
转基因水稻品种非常多，而且针对不同品种设计的检测方法也不同，所以需要对检测方法进行不断改进，以确保其灵敏度和准确性。
2014浙江湖州高中生物教研活动资料：转基因抗虫水稻
基因工程的那些事儿
一、 cDNA法获取目的基因
1.cDNA第一链的合成
mRNA
G
5„ppp‟G 5
AAAAAAAAAAAAAAOH
引物
3’
G
5„ppp‟G
5 逆转录酶
dNTPs
AAAAAAAAAAAAAAOH3’ TTTTTTTTTTTTTTp5’ AAAAAAAAAAAAAAOH
G
5„ppp‟G 5
商品化的转基因大米
谁吃谁知道！
老弟，味道 如何?
“华恢1号”和“Bt汕优63”转基因水稻的毒 蛋白基因在整个生育期的各个部位都表达。 早期表达量高于晚期。种子中表达量低。 对水稻主要害虫二化螟、三化螟和稻纵卷 叶螟等螟蛾科害虫均具有较好防效，控制 效率均在 90% 以上，但对大螟的防效较低， 晚稻上的控制效率仅为44%—64%。 CrylAb毒蛋白能在“转基因水稻—褐飞 虱—黑肩绿盲蝽”食物链中的传递和富集
TTTTTTTTTTTTTTp5’ 3’
cDNA第一链
基因工程的那些事儿
2.cDNA第二链的合成 5„ppp‟G
NaOH 煮沸
G
AAAAAAAAAAAAAAOH TTTTTTTTTTTTTT p 3’ TTTTTTTTTTTTTTp
OH
Klenow
dNTPs
TTTTTTTTTTTTTTp AAAAAAAAAAAAAAOH
S1
TTTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAAAA
基因工程的那些事儿
筛选目的基因原理一
表达目的基因细胞
不表达目的 基因的细胞
mRMA
cDNA
mRMA cDNA
基因工程的那些事儿
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【转基因水稻讲义】转基因抗虫水稻前言：水稻是三大粮食作物之一，世界上近一半人口，都以水稻为主食，它是人类营养和能量摄入最重要的谷物，提供全世界五分之一以上热量消耗。
概况：早在上世纪八十年代早期国际水稻生物技术的研发就在洛克斐勒基金的资助下开展。
至今在水稻生物技术方面的专利超过三百项，涉及四百多个组织和机构。
从1993年起，在美洲、欧洲、亚洲和澳洲的许多国家陆续开始了转基因水稻的田间试验。
目前，已有6个转基因水稻品种获得了不同的批准认可，涉及种植、食用、饲用、进口和加工等方面。
全球已培育出近50个转基因抗虫水稻品系，大部分均已进入田间试验阶段，鉴于其环境安全性及食品安全性，还未进行商业化种植，除了2004年伊朗批准抗虫转基因水稻的商业化种植。
国内转基因水稻主要是华中农业大学张启发院士课题组在研究，其研发的抗虫转基因水稻“华恢1号”和“Bt 汕优63”于2009年8月获得农业部转基因生物安全证书，但是目前并没有获批进行商业化种植。
除抗虫水稻外，一些药用或耐除草剂水稻陆续被批准进口或商业化应用。
1998年起，美国批准Ventra Bioscience公司研发的转溶菌酶，乳铁蛋白、人血清白蛋白基因的3个药用转基因水稻的商业化种植。
美国批准安万特公司的转bar基因耐除草剂水稻及先正达公司的黄金大米等。
我们组通过上网查找资料、借阅图书馆书籍以及询问老师的方式对转基因水稻有了进一步的了解，现在和大家一起来揭开转基因水稻的神秘面纱。
首先要介绍的是目前人类对转基因水稻研发所能达到的技术水平。
技术比较成熟的有以下四种水稻：1、抗虫转基因水稻2、抗除草剂转基因水稻3、抗花粉过敏转基因水稻4、金稻技术还在研发中的水稻主要有抗逆性转基因水稻、高产和优质性状转基因水稻这两种。
表格接下来介绍转基因水稻的工艺流程。
我们知道，基因工程包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术主要是对外源基因的重组设计，分为以下几步：1、切（获取目的基因）2、接（构建基因表达载体）3、转（将目的基因导入受体细胞）4、增（扩增DNA重组分子）5、检（目的基因的检测与表达产物的测定）每一步具体的操作方法会根据供体、受体细胞的不同而改变，越具体到可以直接指导我们的实际操作的资料信息就越高精尖，目前我们的能力无法理清这些，所以只总结了一般可以选择的几种方法。
第一步获取目的基因主要有三种方法，分别是鸟枪法（即直接分离目的基因）、人工合成法和从文库中获取。
鸟枪法：cDNA法：将供体生物细胞的mRNA分离出来，利用反转录酶在体外合成cDNA，并将之克隆在受体细胞内，通过筛选获得含有目的基因编码序列的重组克隆，这就是cDNA法克隆蛋白质编码基因的基本原理。
化学合成人工合成法：聚合酶链式反应（PCR）化学合成：如果目的基因的全序列是已知的，则可以利用化学合成法直接合成。
目前已能利用DNA合成仪自动合成不超过50bp任何特定序列的寡聚核苷酸单链。
目的基因的化学合成实质上是双链DNA的合成，可以分别直接合成其两条互补链，然后退火即可。
对于大片段目的基因的合成，一次合成收率很低，故通常采用单链小片段DNA模板拼接的方法。
聚合酶链式反应（PCR）：PCR扩增技术的本质是根据生物体DNA的复制原理在体外合成DNA。
包括三步程序：1、将待扩增双链DNA加热变性，形成单链模板；（94℃）2、加入两种不同的单链DNA引物，并分别与两条单链DNA模板退火；（50℃）3、DNA聚合酶从两个引物的3’羟基端按照模板要求合成新生DNA链，构成一轮复制反应。
（72℃）重复上次操作n次，理论上即可从1分子的双链DNA扩增到2的n次方个分子。
（实际操作中不止一分子）从文库中获取：基因文库是指某一特定生物体全基因组的克隆集合。
基因文库的构建就是将生物体的全基因组分成若干DNA片段，分别与载体DNA在体外拼接成重组分子，然后导入受体细胞中，形成一整套含有该生物体全基因组DNA片段的克隆，并将各克隆中的DNA片段按照其在细胞内染色体上的天然序列进行排序和整理，因此某一生物体的基因文库实质上就是一个基因银行。
人们既可以通过基因文库的构建储存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，同时又能够在必须时从基因文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因。
第二步中，在转基因水稻工艺流程中主要选用农杆菌Ti质粒作为载体。
选定载体后要对其进行改造和构建，一般都要删除不必要区域，缩小它的相对分子量，同时采取措施避免它的扩散（对载体进行修饰），并且还要删除重复的酶切位点，加入标记基因等。
在外源DNA片段与载体分子剪接前，还需要对连接位点做特殊的技术处理，以提高连接效率，所有这些操作均由一系列功能各异的工具酶来完成，其中一些常用的工具酶本身也已使用基因工程方法产生，如部分的限制性核酸内切酶、T4-DNA连接酶以及Klewnow DNA聚合酶等。
最终的重组质粒的T-DNA区（即目的片段）包括T-DNA边界序列、复制原点、突变启动子片段、GUS报告基因、抗性基因。
第三步中，以经过改造的农杆菌Ti质粒为载体，通过寄主感染受体植物的途径将外源基因转入受体细胞。
Ps:利用农杆菌感染植物细胞主要是依据它在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位的性质（受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物，从而使农杆菌移向这些细胞），然而起初这种方法只被用于双子叶植物中，这是因为单子叶植物如水稻，对农杆菌并不敏感，因此，利用它感染水稻时，我们要人为添加乙酰丁香酮，驱使农杆菌移向受伤细胞。
通常选用叶盘法进行转化。
第四步就是短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子使其整合到受体细胞的基因组中。
第五步，是筛选和鉴定经转化处理的细胞，跟踪目的基因在转基因植物中的行为。
主要是对报告基因、外源DNA及其在转录水平上的表达、外源表达蛋白的检测。
报告基因由于其表达产物易于检测，在这里不赘述。
对外源DNA的检测：点杂交、Southern杂交和PCR鉴定法点杂交是将提取DNA或RNA不经酶切,直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜上与探针进行杂交的技术。
利用点杂交,可以初步鉴定转化体中是否有整和的外源基因。
罗云波用DNA、RNA的点杂交技术对转基因植株进行鉴定,取得与田间表现一致的结果。
但点杂交的特异性差,阳性植株还需进一步作Southern杂交验证。
Southern杂交是将经酶切DNA转移到杂交膜上与探针杂交的技术。
利用Southern 杂交,可以确定外源基因在植物中的组织结构、外源DNA整和的位置及拷贝数、转基因植株F1世代外源基因的稳定性。
研究发现,整合到植物基因组中的外源基因多以单拷贝形式存在,也有的是多拷贝的。
Kitisvi的研究表明,整合到番茄基因组中的外源基因以1～4个拷贝出现,且整合到单一位点上,未发现转基因番茄表型的显著差异。
在其它的研究中也发现外源基因以多拷贝的形式存在,一般在1～5拷贝之间变动,偶尔也有20～50拷贝。
然而,多拷贝的转基因对植物来讲是不利的,它们可能通过异源配对,引起染色体构的变化,从而导致转基因的失活,也可能通过转录调控而引起转基因的失活。
一般来讲,直接转基因法往往采用大量的DNA拷贝,容易获得较高比例的多拷贝转基因植株,而农杆菌介导的T—DNA转移出现多拷贝转基因植株的比例相对较低。
Southern杂交可清除操作过程中的污染(如DNA分离及植物DNA分离过程中的交叉污染),以及转化愈伤胞间质粒残留所引起的假阳性信号,准确度高。
但Southern 杂交程序复杂,成本高,且对实验技术条件要求较高。
PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段的有效方法。
能在几小时内使pg （皮克）水平的起始物达到ng（纳克）乃至μg（微克）水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。
这项技术可用于转化后外源基因的鉴定和植物基因组的分析。
武长剑等用PCR技术检测出转基因水稻中B.T基因和抗除草剂基因的存在。
应用PCR法检测易出现假阳性,可用PCR-Southern杂交进一步验证。
有时Northern杂交的信号弱,可用RT-PCR,将RNA反转录成cDNA,再与探针杂交,从而检测外源基因的表达[7]。
利用RAPD-PCR技术,可以检测出对照植株与转化植株带型差异,还可用该技术检测不同代植株间基因组的稳定性及后代的分离。
与Southern分析相比,PCR检测DNA用量少,操作简单,成本低,不需同位素即可完成。
另外,PCR还能检测目的基因的完整性。
但PCR检测也存在缺点,DNA插入植物基因组后易发生重排,即使载体上的抗性基因能表达,目的基因也未必完整地存在于转化体中,从而造成检测结果的误差。
检测基因在转录水平上的表达：Northern杂交：是将试材RNA与探针杂交的技术,用于检测基因在转录水平上的表达。
Northern杂交的主要原理是把变性RNA转移和固定在特定的薄膜上,用特定的DNA探针来检测RNA。
Northern杂交与Southern杂交相比,更接近于性状表现,更有现实意义,被广泛用于转基因植株的检测。
但RNA提取条件严格,在材料内含量不如DNA高,不适于大批量样品的检测。
对外源表达蛋白的检测：Western杂交技术：是将蛋白质从SDS—PAGE胶中电转移至固相支持体上,然后对固定化蛋白质进行免疫学测定的方法。
Western杂交灵敏度极高,能达到标准的固定相放射免疫水平。
可以测出粗蛋白提取物中小于50ng抗原,在较纯的制剂中,可测出1～5ng抗原。
Western杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果,能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现。
一般来讲,Western 杂交的结果与性状表现有直接关系。
Southern、Northern、Western杂交分别从整合、转录、翻译水平检测外源基因的行为,说服力强。
这些技术需要转膜、杂交,操作繁琐,费用高,不适合大批量样品的检测,可对转基因植株随机取样检测。
Southern杂交特异性强,目前,对转基因植株中基因的存在、整合及稳定性一般都要通过Southern杂交来确定,是检测外源基因的最可靠的方法。
Westhern杂交灵敏度高,能检测出蛋白质表达量,最具有现实意义。
在实际工作中,研究者多把几种方法结合运用,以获得外源基因不同表达水平的信息。
下游技术中，首先要对水稻愈伤组织进行诱导。
方法如下：（一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。