电镜显微分析——汇总版

1987年，出现非接触模式AFM。
1991年，研制出微加工针尖。 1993年，出现轻敲模式AFM。 1996年，更小的悬臂，提高了分辨能力，缩短了扫描时间。
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王柯敏学术小组AFM仪器
SPA400 AFM
JPK NanoWizard II BioAFM
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基本原理
AFM基本原理 成像原理
CCD
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计算机控制系统
与反馈系统的控制器进行交流，可以调节操作参数并显示 实验结果（样品高度、成像力曲线等）。
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计算机控制系统
电路线路 ——连接计算机与扫描系统 为压电陶瓷管提供电压、接收位置敏感器件传来的信号 ，并构成控制针尖和样品之间距离的反馈系统。 控制系统主要有两个功能： (1)提供控制压电转换器X-Y方向扫描的驱动电压； (2)在恒力模式下维持来自显微镜检测环路输入模拟信号在一恒定 数值．计算机通过设定值与实际测量值之差, 控制系统不断地输 出相应电压来调节Z方向压电传感器的伸缩，从而维持环路的输 出电压恒定。
Liu Yang etc. /Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 21
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主要内容
一.发展历史及基本原理 二.仪器构成及使用 三.成像环境及样品制备
四.仪器构成
力检测部分 光学检测部分 反馈电子系统 计算机控制系统
压电扫描系统
原子力显微镜
Atomic Force Microscopy
汇报人：堵莎莎、王维、吴斌 资料收集：张丽丽、黄海花、张珏、应乐、万兰、刘文静
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AFM主要内容
一.发展历史及基本原理 二.仪器构成及使用 三.成像环境及样品制备
四.应用及小结
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显微镜发展史
第一代：光学显微镜(1677) 列文·虎克(Avon Leeuwenhoek) 活细胞观察
Z
Y X
• 这里，常常使用PI反馈（proportional-intergeral feedback） 控制成像过程。 P：proportional，比例的意思，在PI中称为P gain(比例增益)。 I：intergeral，积分的意思。在PI中称为I gain(积分增益)。 • 设定点（setpoint）与实际值之间的差值被用来作为改变微悬 臂高度的依据。积分增益控制所用到的时间值和比例增益所用 到的比例值决定了如何更新高度的位置。
AFM head——最重要的部分
主要内容
一.发展历史及基本原理 二.仪器构成及使用 三.成像环境及样品制备
四.应用及小结
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AFM的成像环境
AFM受工作环境限制较少，它可以在超高真空、气相、液相 和电化学的环境下操作。尤其是可在液体中成像，为在近生理条 件下研究生物大分子的结构和相互作用提供了有效的研究手段。 (1)真空环境：真空AFM避免了大气中杂质和水膜的干扰，但其操 作较复杂。 (2)气相环境：在气相环境中，AFM操作比较容易，它是广泛采用 的一种工作环境。它可以在空气中研究任何固体表面，气相环境 中AFM多受样品表面水膜干扰。 (3)液相环境：液相中AFM消除了针尖和样品之间的毛细现象，因 此减少了针尖对样品的总作用力。液相AFM的应用十分广阔，它 包括生物体系、腐蚀或任一液固界面的研究。
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AFM的发展简介
1938年，德国工程师Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一台
透射电子显微镜（TEM）。 1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微
（SEM）
1985年，IBM公司的Binning和斯坦福大学的Quate研发出了原子力显 微镜（AFM）（使用接触模式），弥补了STM的不足。
基底的选择
基底：固定样品的载体。 由于AFM是对固定在表面的样品进行成像，所 以基底对于能否得到理想的结果是至关重要的。
化学稳定性 容易制备 特点 相对便宜 基底
表面平整，吸附力强， 价格便宜，易剥离，可 进行化学修饰
能简便的进行修饰
能长时间保存
云母片 硅片 玻璃片 金膜 （Au-S键） 生物膜 石墨
工作模式-轻敲模式( tapping mode）
优点： 1）分辨率几乎同接触模式一样好；具有与非 接触模式对针尖与样品无损无污染的优点，特别适 合生物大分子和细胞样品的成像。 2）接触非常短暂，因此剪切力引起的对样品 的破坏几乎完全消失； 缺点：由于共振频率可能会受液体环境波动影响， 该模式的液下成像对系统配置要求较高。
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成像原理——两种模式
使用“恒高”模式来获得图像，也就是在水平方向的扫描过程中， 不使用反馈回路，仅保持针尖与样品之间的距离恒定，通过测量微 悬臂Z轴方向的形变量来成像。由于不使用反馈回路，该模式可以 采用更高的扫描速度，由于更大的凸起受到的力更大，对于表面起 伏比较大的样品不适用，因而通常适用于分子级别成像。不常用。 通过将激光束照射到微悬臂上，再反射到超灵敏光电检测器，收 集检测器不同象限激光强度差值，可以对该弹性形变进行定量并将 其反馈到回路，悬臂基座上下移动以适应样品表面的高低起伏，从 而保持针尖与样品之间的作用力恒定，即保持微悬臂的形变量不变， 通过光电探测系统在计算机上便可得到样品表面形貌的信息。这种 工作模式被称为“恒力”模式，是使用最广泛的扫描方式。
适用于表面平整样品的表征。
工作模式-非接触模式（non-contact mode)
van der Waals force curve
相互作用力是范德华吸引力，远小于排斥力. 微悬臂以共振频率振荡，通过控制微悬臂振幅 恒定来获得样品表面信息的。
工作模式-非接触模式（non-contact mode)
压电转换器
——将机械作用和电信号相互转换的物理器件
压电装置在X，Y，Z三个方向上精确控制样品或探针位置。 目前构成扫描器的基质材料主要是钛锆酸铅制成的压电陶 瓷材料．压电陶瓷有压电效应，即在加电压时有收缩特性，并 且收缩的程度与所加电压成比例关系．压电陶瓷能将1mV~1000V 的电压信号转换成十几分之一纳米到几微米的位移。
第二代：电子显微镜(EM)(1933) 德国鲁斯卡(Ruska) 等人
透射电子显微镜（TEM）
EM
扫描电子显微镜（SEM）
第三代：扫描探针显微镜(SPM)(1982） 扫描隧道显微镜（STM） 瑞士科学家葛·宾尼（Gerd Binnig）和SPM 原子力显微镜（AFM） 海·洛雷尔（Heinrich Rohrer）及同事
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成像原理——工作模式
以针尖与样品之间的作用力的形式来分类， 主要有以下三种操作模式： 接触模式（contact mode) 非接触模式（non-contact mode) 轻敲模式( tapping mode）
工作模式-接触模式（contact mode)
van der Waals force curve
• 这两个值控制了系统以多快的速度对样品的高度变化做出反应。 扫图时需自行优化这两个参数。
成像原理——工作模式
F pair
排斥部分 d
吸引部分
原子 原子 排斥力 原子 原子 吸引力
利用原子之间（针尖原子和样品表面原子）的 范德华力（Van Der Waals Force）作用来呈现样品 的表面特性。
三种工作模式的比较
力测定原理
由于AFM具有皮牛顿级的测力灵敏度，利用AFM测定单对 分子间相互作用力的技术被称为单分子力显微术或单分子力 谱(Single Molecular Force Spectroscopy，SMFS)。
F= k·Δ z
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力测定原理
AFM力曲线及其原理示意图
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力测定原理——举例
压电扫描系统 光学检测部分
计算机控制系统
反馈电子系统
力检测部分
光学检测部分 反馈电子系统 压电扫描系统 力检测部分
AFM操作
1.启动系统 （1）打开稳压电源，接通JPK生物原子力显微镜与计算机的 电源； （2）开启计算机控制器，输入密码进入计算机页面； （3）开启显微镜控制器，打开操作软件进入操作界面； 2.根据测量要求选择合适的探针架针，然后将扫描头放 到样品台上； 3.如果探针的未知离样品比较远可以利用步进马达使针 接近样品（注意不能碰到样品，否则针会被压断），通 过光学影像（CCD）确认针的位置，将激光打到悬臂上， 调节激光使SUM值尽量最大最适合（切换液下大气环境测 量时除以上调节外要适当旋转前中按钮使SUM值最大）；
AFM操作
4.进针。接触式模式调好SUM值后按 图标自动进针，间 接接触模式下要手动设定压力和振幅后自动进针； 5.力测定时首先要进行探针弹性系数校正，然后测力； 6.进行图样叠加要进行光学影像校正，先使探针进针然后 抬起一次再进行校正，可以手动也可以自动校正； 7.通过光学图像将探针移动到感兴趣的位置自动下针后开 始测量，测量过程中时刻注意Oseilloscope，调整相应参 数使Oseilloscope中两条曲线重合的最好； 8.测试完毕保存测得的数据，可以手动保存液可以设置为 自动保存； 9.退出操作系统。取出探针，样品（如使用了Biocell应 洗净吹干），依次关闭显微镜控制器，计算机控制器，稳 压电源。
力检测部分
对针尖性能的要求
(1)理想针尖的顶端应该是单个原子，这样的针尖能够灵敏 地感应出它与样品表面之间的相互作用力。 (2)高机械柔软性，针尖扫描时，即使撞击到样品的表面也
不会使针尖损坏。
(3)高弹性形变，可有效地限制针尖在样品表面上的作用力， 从而减小对样品的损害，对柔软的生物样品特别有利。 (4) 稳定的结构。
优点：对样品无损伤 缺点： 1）分辨率要比接触式的低。 2）气体的表面压吸附到样品表面，造成图像 数据不稳定和对样品的破坏。
工作模式-轻敲模式( tapping mode）