蛋白质分离纯化方法概况

蛋白质分离纯化方法概况
摘要：分别概述了根据蛋白质分子大小不同、溶解度不同、所带电荷不同这三个方面性质来分离纯化蛋白质的各种技术的原理和特点，并对分离纯化蛋白质的其它方法作了简单介绍。

关键词：蛋白质；分离纯化；方法
蛋白质在生物体内催化代谢反应、物质运转、运动协调、兴奋传导、生长于发育的控制等过程中都起着重要作用。

随着生物化学技术的飞速发展，对蛋白质进行分离纯化的各种方法也在不断发展和完善。

蛋白质的分离纯化就是利用不同蛋白间内在的相似性与差异，将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来的过程[1]。

目前蛋白质的分离纯化方法主要是根据蛋白质分子大小不同、溶解度不同、所带电荷不同及吸附亲和性不同等性质来进行的。

1基于分子大小不同的分离纯化方法
1.1透析
透析是利用小分子能通过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。

常用的半透膜是玻璃纸、火棉纸和其他改型纤维素材料。

透析常和盐析、盐溶等方法联合使用。

医疗上用于治疗肾功能衰弱者，工业上用于从人选毛或合成丝厂的纤维废液中回收NAOH[2]。

1.2超滤
超滤技术是利用加压膜分离的一种技术，其膜孔径范围在0.002～0.02μm，介于微滤和纳滤之间。

在一定压力差推动下，溶剂和小分子溶质能透过一定孔径的膜，大分子溶质（蛋白质等）则被超滤膜截留而作为浓缩液被回收。

根据不同规格的超滤膜，可以分离出相对分子质量不同的蛋白质。

超滤技术具有高效节能、无污染、操作方便、实验条件温和、不需加热等特点，与蒸发、冰冻干燥相比没有相变化，可以防止生物活性物质的变性、失活和自溶[3]。

1.3密度梯度离心
离心是一种经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。

蛋白质颗粒
的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。

使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度（区带）离心。

常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。

根据所需密度和渗透压的范围来选择合适的密度梯度。

使用密度梯度离心的方法分离纯化蛋白质，可以消除因对流和机械振动引起区带界面的扰乱。

1.4凝胶层析
凝胶层析即过滤层析，也称分子排阻层析或凝胶渗透层析，是利用凝胶的网状结构，根据分子大小差异分离蛋白质混合物的有效方法之一。

其过程原理为：当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。

这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。

由于该法上样量有限，常在纯化的最后一步与其他分离方法（如离子交换）组合使用[3]。

目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。

2基于溶解度差异的分离纯化方法
2.1等电点沉淀法
等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低且各种蛋白质等电点不同的特点进行分离的方法。

蛋白质分子的电荷性质和数量因pH的不同而变化，当pH被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点pH时，这种蛋白质的大部分或者全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。

通过等电点沉淀的方法分离出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。

此法具有操作简单，提取效率高等优点。

2.2盐溶法及盐析法
盐溶指蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低时，稍加一些无机盐则溶解度增加的现象；而当盐浓度继续增加时，蛋白质又会自动析出，这叫盐析现象。

盐溶和盐析主要是通过影响蛋白质分子表面的电荷而分离、纯化蛋白质。

盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一，常用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐。

硫酸钠具有化学性质稳定、溶解度大等优点，现在所指的盐析法实际上多为硫酸
铵盐析法。

该法受蛋白质浓度、离子强度、盐的性质、pH及温度等因素影响。

2.3 有机溶剂分离法
与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，且在一定温度、pH值和离子强度下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同。

所以，控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。

例如，在-50C的25%乙醇中卵清蛋白可以沉淀析出，而与卵清中的其他蛋白质分开。

由于在室温下，有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀，而且伴随着变性。

因此，通常要将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高，这样就可以很大程度上避免蛋白质变性。

对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质，可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取，它们是具有一定亲水性和较强的亲脂性的理想提取液。

2.4 双水相萃取法
双水相萃取技术是一种新型的分离技术。

它把两种聚合物与一种盐的水溶液混合在一起，由于聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间的不溶性形成两相，从而实现分离。

与传统的分离技术相比，具有操作条件温和、处理量大、易连续操作等优点，同时克服了常规萃取有机溶剂对生物物质的变性作用，在粗提过程中保持了生物物质的活性及构象等优势，该技术被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工领域的产品分离和提取。

采用双水相系统浓缩目的蛋白，受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响[4]。

3基于电荷不同的分离方法
3.1 电泳
电泳方法是在外电场存在下，利用分子携带的净电荷的不同以分离混合物的一种实验技术，可用于氨基酸、肽、蛋白质和核苷酸等生物分子的分析分离和制备。

无论是单向凝胶电泳还是双向凝胶电泳，都是分离度极高的分离方法，电泳技术可分为变性电泳、常规电泳、等电聚焦电泳和毛细管电泳。

其中，聚丙酰胺凝胶电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳，常用于分离蛋白质，具有设备简单、操作方便、样品用量少等优点。

3.2 离子交换层析
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂
上的平衡离子进行可逆交换换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

目前已经成为蛋白质分离纯化最常用的手段。

离子交换层析中，基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。

带有正电荷的为阴离子交换树脂；反之为阳离子交换树脂。

离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。

当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。

阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析
柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

4 其它分离方法
4.1 根据选择性吸附差异的分离方法
疏水层析是根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。

它利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合的特性进行分离。

在疏水层析过程中，不是暴露的疏水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而是连接在支持介质（如琼脂糖）上的疏水基团与蛋白质表面上的暴露疏水基团相结合。

蛋白质与疏水配基相结合，其他的杂质蛋白则无此种性质，从而使蛋白质初步分离。

市面上出售的疏水吸附剂有苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等。

该方法具有使蛋白质变性，仅适合部分蛋白质等缺点。

4.2利用对配体的特异亲和力进行分离纯化的方法
亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力建立起来的一种有效的纯化方法。

它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。

亲和层析纯化分离蛋白质的基本原理：把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面功能基上，当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时，待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上而其他蛋白质则因对该配体无特异的结合部位而不被吸附，它们通过洗涤即可除去，被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶剂把它从柱上洗脱下来。

近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力[5]。

5结语
目前蛋白质的分离纯化方法多种多样，在实际工作中很难用单一的方法来实现蛋白质的分离纯化，往往要结合几种方法才能分离纯化出一种蛋白质。

所以，在要提纯某种蛋白质时,首先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质，根据目标产物的理化和生物特性，再选择合适的分离纯化工艺路线，保证得到高纯度和高产率的目标蛋白质。

参考文献
[1]张彩乔,耿风延.现代蛋白质分离纯化技术[J].科技视界,2014,14:316.
[2]李有科.膜分离技术的研究现状与进展[J].甘肃冶金,2010,32(6):84-86.
[3]吴少辉,刘光明.蛋白质分离纯化方法研究进展[J].中国药业,2012,21(1):1-2.
[4]王子佳,李红梅,弓爱君,等.蛋白质分离纯化方法研究进展[J].化工与生物工程,2009,26(8):8-11.
[5]李杨,韩梅.亲和层析技术在生物学中的应用及发展[J].生命科学研究,2006,10(1):12-16.。