FA-VD-116复方醋酸曲安奈德搽剂微生物限度检查方法验证方案解读

复方醋酸曲安奈德搽剂

微生物限度检查方法验证方案

1目的

根据《中国药典》2015版草案中的相关规定，建立复方醋酸曲安奈德搽剂的微生物限度检查方法，并对其进行验证，保证其检验方法的科学性，使检验结果准确可靠。

2范围

本验证方案适用于复方醋酸曲安奈德搽剂的微生物限度检查方法的验证。3人员与职责

质量控制人员负责验证方案与报告的起草，并按照批准的方案实施，完成检验相关数据的采集；质量保证人员负责验证方案和报告的审核；质量管理负责人负责验证方案和报告的批准。

4培训

本方案实施前应对参加验证人员进行培训，并做好培训记录确保进行验证的人员均能熟悉、掌握验证过程。

5验证方案

5.1制剂信息

复方醋酸曲安奈德搽剂为醋酸曲安奈德和盐酸普鲁卡因溶于75%乙醇配制而成，其溶剂75%乙醇为水溶性，常作为消毒剂使用，有很强的抑菌活性。其质量标准中规定应进行微生物限度检查，每1ml样品中细菌数不得超过100cfu，霉菌和酵母菌数不得超过100cfu，并不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

根据以上特点，本方案中按《中国药典》2015版草案《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》（1105）和《非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》（1106）中相关要求，决定采用稀释剂稀释法消除乙醇对结果的影响，制备供试品溶液；采用平皿法中的倾注法对供试品中的需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数进行计数，根据草案对其质量标准中规定的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌进行检查，并对所选用的计数和检查方法进行验证。

pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；胰酪大豆胨液体培养基（TSB）；

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）；

沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）；

沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）；

甘露醇氯化钠琼脂培养基；

溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基；

本方案中所使用的培养基均应为购自中国食品药品检定研究院或由其他单位购买但经过适用性检查合格的脱水培养基，配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

5.3.2仪器设备

100级净化工作台；

BSC-1100-L II A型生物安全柜；

BP-II型药物天平；

HHW21型电热恒温水浴箱；

HY35型隔水式电热恒温培养箱；

LRH-250A型生化培养箱；

三洋MLS-3780型高压灭菌锅。

5.4微生物计数方法验证

5.4.1菌种及菌液制备

5.4.1.1金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕

取金黄色葡萄球菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml 含菌量约为5000cfu的菌悬液。

5.4.1.2铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10 104〕

取铜绿假单胞菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml 含菌量约为5000cfu的菌悬液。

5.4.1.3枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63 501〕

取枯草芽孢杆菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml 含菌量约为5000cfu的菌悬液。

5.4.1.4白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕

取白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖液体培养基上，于20～25℃、培养2～3天，取其新鲜培养物，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。

取黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃、培养5～7天，或直到获得丰富的孢子时，取其新鲜培养物加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，反复吹吸将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的黑曲霉孢子悬液。

5.4.2菌液的保存

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

5.4.3供试液制备

取供试品10ml，加入温度不超过45℃的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，稀释制成1﹕10供试液。按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。供试液从制备至加入检验用培养基不得超过1小时。

（1）试验组取上述制备好的供试液，加入1ml试验菌液，混匀，每1ml供试液中含菌量约为50cfu。

（2）供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液（温度不超过45℃的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）代替菌液同试验组操作。

（3）菌液对照组取稀释液（温度不超过45℃的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。

5.4.4阴性对照

为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

5.4.5供试品中微生物的回收

按照“菌种及菌液制备”项中所列的各试验菌应逐一进行微生物回收试验。取照上述“供试液的制备”、“接种和稀释”制备的供试液1ml，置直径90mm 的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌）或沙氏葡萄糖琼脂培养基（白色念珠菌、黑曲霉），混匀，凝固，倒置培养（胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过3天；沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天）。观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以