实验二 银耳多糖含量的测定

• 2. 样品的准备
• 称取适量样品，先加少量的水溶解，最后定 容于50 ml，至溶液浓度约为0.5 mg/ml.
• 3. 样品中多糖含量的测定
• 分别吸取0.1、0.3 和0.5 ml样品液，用蒸馏水 补足1.00 ml。加入蒽酮试剂，同标准曲线制 作之操作，比色测定。根据标准曲线和样品 浓度计算含量。
• 3. 胃膜素分离
• 上清液在搅拌下（同一方向，否则胃膜素会散开）缓缓加入 预冷至5℃以下的丙酮（γ=0.708）至比重约0.97，捞出胃膜 素，以适量的75%乙醇洗两次，真空干燥。
• 4.胃酶的沉淀 胃酶的沉淀
• 母液再加丙酮至比重约0.91，有黄色沉淀产生，离心（4℃, 7000 rpm, 10 min)取沉淀，70℃以下真空干燥。
实验四 胃蛋白酶活力的测定
一、实验目的
• 学习和掌握以牛血红蛋白为底物的胃蛋白 酶活力测定的原理和方法，掌握紫外分光 光度计的使用。
二、实验原理
• 胃蛋白酶能催化水解芳香环氨基酸连接的 肽键。在一定条件下，可定量催化水解牛 血红蛋白产生不被三氯醋酸（TCA）所沉 淀的酚基氨基酸（如酪氨酸）。酪氨酸在 275nm波长处有最大吸收，以酪氨酸为对照， 可以求出胃蛋白酶活力。
•
（1）糖经浓无机酸处理后，脱水生成糠 醛或糠醛衍生物；
• （2）糠醛和糖醛衍生物在浓无机酸的作用 下，能与蒽酮化合物反应生成有色物质。
• （3）反应液颜色的深浅，反映出糖浓度的 高低。
四、仪器、试剂与药品
• 试剂：0.1mg/ml的葡萄糖标准品、蒽酮试剂、 蒸馏水 • 样品液：0.5 mg/ml 0.5 • 试管、电炉、可见光分光度计、容量瓶 etc.
三、实验原理
• 胃粘膜一般指胃底粘膜，分泌胃液的主细 胞集中在胃底粘膜，呈暗红色，直径约1012厘米圆块，约100 g。 • 胃膜素是从猪胃粘膜经胃蛋白酶和盐酸消 化后的上层液中，60%左右的乙醇所沉淀的 部分。蛋白质、酶等极性物质的水溶液加 入与水混溶的有机溶剂，可沉淀析出。
四、仪器、试剂与药品
六、思考题
• 1、根据样品液多糖含量，计算实验一中多 糖的提取率。
• 2、根据蒽酮测糖原理，设计测定化合物中 淀粉量的方案。
• 注意事项：
• 加样要求准确。
猪胃粘膜中提取胃膜素、 实验三 猪胃粘膜中提取胃膜素、 胃酶
一、实验目的
• 学习从猪胃粘膜中提取胃膜素、胃酶的原理 和方法，了解有机溶剂分级沉淀法的应用。
二、简介
• 胃膜素 ： • 功效：一种以黏蛋白为主要成分的生物活性药物，有极强 功效：
的黏附作用，可直接作用于消化道内壁，在胃及十二指肠溃 疡面形成一层保护膜，减少胃酸对它的刺激，利于溃疡面的 愈合；另一方面有润滑作用，使进入消化道的食物易于在消 化道内移行，有利于减少某些物质对溃疡面的刺激。胃膜素 临床上用于胃及十二指肠溃疡。
• 水浴锅，搅拌器，冰箱，真空干燥，盐酸， 氯仿，丙酮，乙醇，离心机等。
四、实验操作
• 1.激活提取 激活提取 • 猪胃粘膜0.55 Kg（5只猪肚）+水约220 ml升（胃粘膜的 40%），用1：1盐酸调pH 2.5-3.0，45-50 ℃搅拌提取3 h (在搅拌的过程中需注意不停的调节pH)。 • 2.脱脂分层 脱脂分层 • 双层纱布过滤，冷却至室温，缓慢加入约55 ml氯仿（胃 粘膜的10 %），搅拌2 h，室温静置24 h后，放掉底层的氯 仿和杂质，上清液预冷至5℃以下
•
• • • • •
3、测定方法：取试管6 支，其中3 支各精密加入对照品溶液1ml ，另3 支各精密加入供 试品溶液1ml ，置37±0.5 ℃水浴中，保温5 分钟，精密加入预热至37±0.5 ℃的牛血红 蛋白试液5ml ，摇匀 摇匀，并准确计时，在37±0.5 ℃水浴中反应10分钟。立即精密加入5% 摇匀 三氯醋酸溶液5ml ，摇匀 摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。另取试管2 支，各精密 摇匀 加入血红蛋白试液5ml ，置37±0.5 ℃水浴中保温10分钟，再精密加入 5％三氯醋酸溶 液5ml ，其中1 支加供试品溶液1ml ，另1 支加对照样品盐酸溶液1ml ，摇匀，过滤， 弃初滤液，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，按照分光光度法在275nm 的波长处测定吸收度，算出平均值ＡS 和Ａ，按下式计算。 Ａ×Ｗｓ×ｎ 每g含蛋白酶活力单位数＝ ─────────── Ａs×Ｗ×10×181.19 式中：ＡS 为对照品的平均吸收度；Ａ为供试品的平均吸收度；Ｗs ＝1 ml 对照品溶液 中含酪氨酸的量，µg ；W＝供试品取样量，g ；n＝供试品的稀释倍数。 在上述条件下，每分钟能催化水解血红蛋白生成1 µmol 酪氨酸的酶量，为一个蛋白酶 活力单位。
五、实验操作
• 1、标准曲线的制作 、 • (1) 加样：
葡萄糖溶液(ml) 0.00 蒸馏水(ml) 蒽酮(ml) 1.00 3.00 0.10 0.90 3.00 0.20 0.80 3.00 0.40 0.60 3.00 0.60 0.40 3.00 0.80 0.20 3.00
• (2) 将加好的样品混匀，沸水浴10 min，室温冷却，于620 nm处比色。 • (3) 以第一管为空白，进行比色。以光密度（OD值)为纵坐 标，糖的含量(µg)数为横坐标，得标准曲线。
• 性质描述: 淡黄色或淡灰色粉末，或微小颗粒。着水胀为
粘浆。显微溶状态，略带类蛋白胨臭。具有很强的粘附力。
• 胃蛋白酶： 胃蛋白酶：
• 存在于动物胃液中，以无活性的胃蛋白酶原形式，存在于 胃底的主细胞中，在酸性条件下，胃蛋白酶原变化成有消 化蛋白质能力的胃蛋白酶。 • 在医学上主要用于治疗消化不良、食欲不振、慢性胃炎等， 工业上可作水解蛋白用。 • 干燥的胃蛋白酶为白色或淡黄色粉末，引湿性强，易溶于 水；对热较稳定，100 ℃ 10 min不破坏。水溶液中，70 ℃ 以上破坏。
实验二 银耳多糖含量的测定
一、实验目的
• 学习和掌握多糖含量测定的原理和方法。
三、实验原理
• 多糖在浓硫酸中水解，进一步脱水生成糖醛及其衍 生物，与蒽酮（10-酮-9,19-二氢酮）反应生成蓝绿 色复合物，在620nm处有最大吸收值。以标准葡萄 糖溶液作标准，在620 nm波长处进行比色，可计算 出总糖的含，酪氨基，盐酸， 三氯醋酸，牛血红蛋白等。
四、实验操作
• 1、对照品溶液的制备：精密称取经 105 ℃干燥至恒重的 酪氨酸适量，加盐酸溶液〔取1 mol/l盐酸溶液65 ml，加水至 1,000 ml 〕制成每1 ml 中含0.5 mg 的溶液，摇匀，备用。 • 2、供试品溶液的制备：精密称取实验三提取的胃酶干粉 40-60 mg，用上述盐酸溶液制成每1ml 中约含 0.2 ～0.4U 的溶 液。（称本品（一般3500U/g以上）40-60mg，用上述盐酸溶 液定容至100 ml，再取5 ml用上述盐酸溶液定容至50 ml，即 0.04-0.06 mg/ ml）。