蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量

蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量 一. 实验原理 糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮(C14H10O)脱水缩合，形成糠醛的衍生物呈蓝绿色。该物质在620 nm处有最大吸收，在150 μg/mL范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。该法有很高的灵敏度，糖含量在30 μg左右就能进行测定。 二. 试剂器材 蒽酮试剂：精密称取0.1g蒽酮，加80%浓H2SO4100 mL使溶解，摇匀。当日配制使用； 葡萄糖标准液：将无水葡萄糖置于五氧化二磷干燥器中，12hr后精密称取100mg，用蒸馏水定容至100ml； 其他器材：分析天平、分光光度计、容量瓶(100ml、50ml、10ml)、烧杯、具塞试管、移液器、移液器吸头、涡旋振荡器和废液缸等。 三. 操作步骤 葡萄糖标准曲线的制作
取7支具塞试管，按下表数据精密配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液，每个浓度做2-3个重复： 管号 0 1 2 3 4 5 6 标准葡萄糖溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水/mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 在每支试管中立即加入蒽酮试剂6mL，振荡混匀，各管加完后一起置于沸水浴中加热15min。取出，迅速浸于冰水浴中冷却15min。 在625nm波长下以第1管为空白，迅速测定其余各管吸光值。 以标准葡萄糖含量(g)为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 样品的测定 将样品溶液糖浓度调整到测定范围，精确吸取2mL置于干燥洁净试管中，在每支试管中立即加入蒽酮试剂6mL，振荡混匀，各管加完后一起置于沸水浴中加热15min。取出，迅速浸于冰水浴中冷却15min，每个浓度做2-3个重复。 在625nm波长下迅速测定各管吸光值。根据葡萄糖含量的标准曲线，由样品溶液吸光值计算各样品溶液中糖的浓度，并计算其糖含量。 四. 注意事项 该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合物，不但可测定戊糖与已糖，且可
测所有寡糖类和多糖类，包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。 在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，否则会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。 不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时则可避免此种误差。
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