室进行哪项检查可提示患者的免疫功能状态是否低下

4. 22~25℃温度下孵育1h；
5. 荧光染色液染色并终止反应。
结果观察
结果应在染色后10分钟内观察，以防荧光猝灭。特
殊情况不能立即观察时，应将反应板用避光纸包紧，置 于4℃冰箱中，尽早观察结果。死亡细胞由于荧光染料进 入而呈红色（染料中的EB与DNA结合），体积略为增大。 活细胞因为细胞膜完整而呈明亮的绿色（染料中的CFDA 与细胞膜蛋白结合），具有强折光性。
实验器材和材料
器械
微量淋巴细胞毒反应板（泰萨奇板）、倒置荧光显微 镜、 微量移液器、吸管、温箱、离心机、磁架等 。
试剂
淋巴细胞分离液(Ficoll, γ＝1.077)、T/B淋巴细胞分离 磁珠及洗涤液、冻干补体、荧光染色液、供者全血 2~3ml （ EDTA 或 ACD 抗凝）、受者血清 2ml 、阴性对照血清 （可用1640培养液或PBS替代）、阳性对照血清（抗全淋 巴细胞抗体ALG/ATG）。
实验方法
试剂准备
1. 在第一次使用时，至少提前20min取出冻干对照血清以2ml去离子水轻 轻摇震使其彻底溶解。将溶解后的对照血清溶液分装，每管 100μl， 储存在-20℃冰箱中，每次实验前取出，恢复至室温后使用；
2. 将洗液用去离子水(sterile deionized water)按1：9稀释，可根据工作频 率一次性配制一定量的工作液，4℃冰箱贮存备用； 3. 将待测标本用抗体稀释液（antibody diluent)按1：2稀释，约60μl/test； 4. 酶标二抗（alkaline phosphatase-conjugated anti-human IgG)在第一次 洗涤之前用抗体稀释液按1：100稀释，50μl/test；
实验原理
将涵盖不同地域、不同人种的HLA-I类和II类纯化IgG 抗原预先包被于泰萨奇微孔板中，与待测、血清反应，再加 入碱性磷酸酶标记的二抗，孵育后加入酶作用底物，待显色 反应完成后终止反应。如果待测血清中存在HLA-I类抗体， 则相应的HLA-I类混合抗原孔中会发生特异性的抗原抗体反 应，反应孔呈现蓝色的阳性反应结果；若无相应抗体，则反 应孔中为无色阴性结果。
1. 将供者全血用PBS(pH7.4)缓冲液 按1:1稀释，混匀备用；
淋巴细胞毒反应（一步法）
1. 于泰萨奇板每孔中加入5μl石蜡油，以防反应物挥发； 2. 建立反应格局，每位待测标本均应设立阴性对照、阳性 对照； 3. 分别于各相应孔中加入1μl淋巴细胞（混合淋巴细胞、T 淋巴细胞、淋巴细胞）、1μl待测血清以及2μl补体；
实验方法

淋巴细胞的分离（Ficoll法）：
2. 取15ml离心管一支，加入一定体积的Ficoll液，用吸取稀释 后的供者全血，沿试管壁缓慢加入，使全血置于 Ficoll上层。 Ficoll液与稀释后的全血体积之比为1:2； 3. 1500~2000rpm/min（半径15cm水平转子）离心10min； 4. 取出离心管，吸取中间白膜层，置于另一干净离心管中； 5. 加入PBS，洗涤； 6. 2000rpm/min离心5min，倾出上清液； 7. 重复步骤5、6； 8. PBS液调整细胞浓度为2×109/L。
意义
阴性 阴性可疑 阳性可疑 阳性 强阳性
注意事项
1. 每份标本都必须设立阴、阳性对照； 2. 温度过低有可能产生假阴性结果； 3. 只有当阴性和阳性对照结果准确时，该实验的 阳性和阴性结果方能成立。
实验讨论
淋巴细胞毒试验是测定患者机体内是否含有特异性针对供
者的淋巴细胞毒抗体，检测的是 HLA 特异性的 IgG 和 IgM 抗体，包括 HLA-I 类抗体和 II 类抗体。由于混合淋巴细胞 中主要为 T淋巴细胞， B 淋巴细胞数量较少，而 HLA-II 类 抗体在 T 淋巴细胞表面不表达，仅在 B 淋巴细胞表面表达， 因而，利用混合淋巴细胞进行 CDC试验时，对HLA-I类抗 体阴性、II类抗体阳性的患者，易产生漏检，而造成这种 结果的原因是由于混合淋巴细胞中 B淋巴细胞占全部细胞 的比例较少所致。 为了更加真实、全面地反应患者的免疫状态，我们应该如 何改善上述局限性对实验结 果造成的影响？
结果判断
根据死亡细胞占全部细胞的百分比来计分，
目前普遍采用国际通用的NIH计分方法，如下表。
判断死细胞的百分比需要操作者具备一定的工作
经验，大致原则为：可疑2分，30为4，过半记6， 强阳写8。
淋巴细胞毒试验记分标准
死细胞（%）
0～10 11～20 21～40 41～80 >80
记分
0 2 4 6 8
第十二单元
移植免疫学检测
实验一 HLA微量淋巴细胞毒试验
微量淋巴细胞毒试验概念
微量淋巴细胞毒试验（Microcytotoxicity assay）是 在经典的补体依赖的淋巴细胞毒试验（complement dependent cytotoxicity，CDC）基础上发展而来的一项 实验技术，目前已经广泛应用于器官移植供、受者间的 交叉配型、复发性流产的封闭抗体检测等多个领域。在 器官移植的文献中提及的CDC法多指微量淋巴细胞毒法。

南方医科大学 裘宇容
实验二 群体反应性抗体检测
群体反应性抗体的概念
群体反应抗体（Pannel reactive antibody）是指存 在于某些人体内的抗人类白细胞(HLA)抗体，可通过输 血、输血小板、妊娠以及器官移植等免疫途径获得。 PRA 测定即是检测患者体内是否存在 HLA 抗体、抗体 的水平高低以及抗体特异性如何。 PRA 对于患者是否 发生排斥、移植物的存活状态以及器官功能的实现都有 着不可忽视的作用。
实验器材和材料
器械：
各种移液器、吸头、温箱、离心机 、微量酶标仪等。
试剂：
抗原微孔板（以LAT mix tray为例） 对照血清（10×serum control） 去离子水(sterile deionized water) 酶标二抗（100×alkaline phosphatase-conjugated antihuman IgG) 抗体稀释液（1×antibody diluent） 洗液（10Leabharlann Baiduwash buffer） 底物A和B（1×colorimetric enzyme substrate A&B） 反应终止液（1×stop reagent）