活细胞观察与相差显微镜的使用
实验二 特殊显微镜的使用 相差显微镜
实验二特殊显微镜的使用相差显微镜实验二特殊显微镜的使用-相差显微镜实验二特殊显微镜的使用实验2.1差距显微镜一、实验目的掌控差距显微镜的原理、结构及其采用方法。
二、实验原理相差显微镜（phase-contrastmicroscope）是由p.zernike于1932年发明的，p.zernike于1953年获诺贝尔物理奖。
相差显微镜最大的特点就是可以用于观察未经染色的标本和活细胞。
人们在光学显微镜下观测被检标本时，只有在反射光的波长（颜色）和振幅（亮度）与周围介质存有变化时，方能够看见被检样品的结构。
活细胞近似于无色透明化，光波通过时，借由或反射光的波长和振幅都不出现发生改变，所以用普通光学显微镜难以分清活体的结构。
通常对于浓淡对照不大的样品，多借助紧固和染色等化学方法，并使样品和背景的散射或反射光在波长和振幅上发生变化，即为在颜色和亮度上有所差异，就可以辨识。
但有些样品一经染色就可以引发变形，染色也可以并使存有生命的样品丧生。
我们可以利用差距显微镜去展开观测。
差距显微镜利用衍射的干涉现象，将人眼不容辨别的相位差变成可以辨别的振幅高，因此它就是一种应用领域在染色困难或无法染色的新鲜标本上赢得低对照图像的新型显微镜。
相差方法应用于生物学上的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。
染色给活体以有害的影响，甚至失真。
由此，才使相差法显得异常重要。
差距就是指同一光线经过折射率相同的介质其增益发生变化并产生的差异。
增益就是所指在某一时间上，光的波动所达至的边线。
差距同意于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等同于折射率与厚度的乘积之差（即为光程之差），介质越薄或折射率越大，光波失速也越大。
为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板（phaseplate）。
在圆形相扳平面上，有一圈与周围（里外）相扳厚度不同的或凸或凹的圆环。
相板分两部分：图1-10差距显微镜光路图共轭面（conjugatearea）：通常为环状，是通过直射光的部分。
显微镜的操作
(3)合轴调整 拔出目镜，插入合轴望远镜，一边从望远镜内观察，并用
左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其下降，当对准焦点就 能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将望远镜固定住。再升降 集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后左右前后调节 环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合，如亮环比黑环小而位于 内侧时，应降低集光器使亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩 小。如若升到最高限度仍不能完全重合，则可能是载玻片过厚之故，应 更换。合轴调整完毕，抽出望远镜，换回目镜，按常规进行观察。
使用方法：
1、打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。 2、透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤 片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在 光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片 的插块。 3、用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光 源中心，使其位于整个照明光斑的中央。 4、放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：末装滤光片不 要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须 用无荧光的特殊油镜；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5 分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。
使用方法：
a. 把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上.
b.选用强的光源，但又要防止直射光线进入物镜，所以一般用显微 镜灯照明。
c.在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油，目的是不使照明光线于 聚光镜上面进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明.
实验二 特殊显微镜的使用 相差显微镜
实验二特殊显微镜的使用相差显微镜实验二特殊显微镜的使用-相差显微镜实验二特殊显微镜的使用实验2.1相差显微镜一、实验目的掌握相差显微镜的原理、构造及其使用方法。
二、实验原理相衬显微镜是P.Zernike在1932年发明的。
泽尼克于1953年获得诺贝尔物理学奖。
相衬显微镜最大的特点是可以用来观察未染色的标本和活细胞。
人们在光学显微镜下观察被检标本时，只有在反射光的波长（颜色）和振幅（亮度）与周围介质有变化时，方能看到被检样品的结构。
活细胞近于无色透明，光波通过时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体的结构。
一般对于明暗对比很小的样品，多借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化，即在颜色和亮度上有所差异，才能识别。
但有些样品一经染色就会引起变形，染色也可使有生命的样品死亡。
我们可以利用相差显微镜来进行观察。
相差显微镜利用了光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，因此它是一种应用在染色困难或不能染色的新鲜标本上获得高对比图像的新型显微镜。
相位差法在生物学中的主要价值在于，它可以直接观察透明的活体，而不需要杀死细胞的固定和染色方法。
染色对活体有有害影响，甚至会造成变形。
因此，相位差法非常重要。
相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。
相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。
相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（即光程之差），介质越厚或折射率越大，光波减速也越大。
为了获得相位差效果，在相位差显微镜的物镜中安装了一块由光学玻璃制成的相位板。
在圆形相位板的平面上，有一圈凸面或凹面环，其厚度与周围（内、外）相位板的厚度不同。
相位板分为两部分：图1-10相差显微镜光路图共轭面积：通常为环形，即通过直射光的部分。
环是凸的或凹的。
振幅改变，从而达到不同的目的与观察效果。
利用相板把光波相位推迟，振幅改变。
细胞的观察与实验技巧
细胞的观察与实验技巧细胞是构成所有生命的基本单位，对于科学家来说，准确观察和掌握细胞的结构与功能是非常重要的。
本文将介绍一些细胞的观察与实验技巧，帮助读者更好地进行细胞研究。
一、细胞的观察1.亮场显微镜：亮场显微镜是最常用的观察细胞的工具。
首先，将待观察的细胞标本放置在载玻片上，并加入一滴显微镜液，在载玻片上覆盖一个玻片盖片。
接下来，调整显微镜的光源和镜头，通过调焦轮将样本调至清晰可见的位置。
2.荧光显微镜：荧光显微镜可以观察细胞中的荧光标记物。
首先，将待观察的细胞与荧光染料共同培养，等待染料进入细胞内。
然后，将样本制备好后放在载玻片上，调整显微镜的荧光滤光片，然后通过调焦轮观察样本。
3.相差显微镜：相差显微镜适用于观察不透明的细胞、活细胞或厚度较大的标本。
通过调整望远镜和目镜之间的相差装置，可以增强细胞的对比度，使其更容易观察到细胞内的结构。
二、细胞实验技巧1.细胞培养：细胞培养是研究生物学和医学的重要手段之一。
首先，将细胞样本或组织分散到含有培养基的培养皿中，然后放置在恒温箱中，提供适宜的氧气和营养物质。
定期观察细胞的生长情况，并根据需要进行细胞传代或其他实验。
2.细胞染色：细胞染色可以通过染料与细胞特定部分的亲和性来观察和研究细胞内的结构和功能。
例如，荧光染料可以用于标记特定的细胞器或蛋白质。
常用的细胞染色方法包括荧光标记、免疫组化和核染色等。
3.细胞融合：细胞融合是将两个或多个不同类型的细胞合并为一个细胞的过程。
这种实验技术可以用于研究不同细胞类型的互作关系、基因表达以及信号传导等。
常用的细胞融合方法包括电融合、溶液融合和病毒介导的融合等。
4.原代细胞培养：原代细胞培养是指从活体组织中得到的第一代细胞培养，有助于研究细胞在原始状态下的特性和行为。
在进行原代细胞培养时，需要注意选择适当的培养基、细胞分离酶和其他培养条件，以确保细胞的正常生长和功能。
结论：通过运用适当的技巧和仪器，科学家们能够准确观察和研究细胞的结构和功能。
不同类型显微镜的使用方法有何区别
不同类型显微镜的使用方法有何区别显微镜是一种非常重要的科学工具，它帮助我们观察到肉眼无法直接看到的微小物体和细胞结构。
随着科学技术的不断发展，显微镜的种类也越来越多，每种类型的显微镜都有其独特的特点和使用方法。
接下来，让我们一起了解一下不同类型显微镜的使用方法有何区别。
首先，我们来谈谈光学显微镜。
这是最常见和基础的一种显微镜类型。
使用光学显微镜时，第一步是将待观察的样本制作成切片或涂片。
如果是切片，需要经过一系列的处理步骤，如固定、脱水、包埋、切片等，以确保样本的结构完整性和清晰度。
涂片则相对简单，直接将样本涂抹在载玻片上即可。
在放置样本时，要小心地将载玻片放在显微镜的载物台上，用夹子固定好，确保样本位于通光孔的正中央。
接下来，调节光源的亮度和对比度，以获得最佳的观察效果。
通过粗调焦旋钮，将物镜靠近样本，然后慢慢转动细调焦旋钮，直到图像清晰为止。
光学显微镜通常有多个物镜可供选择，如4×、10×、40×和100×等。
在观察时，应根据样本的大小和需要观察的细节程度选择合适的物镜。
低倍物镜用于初步观察样本的整体结构，高倍物镜则用于观察更细微的结构。
与光学显微镜不同，电子显微镜的使用方法则复杂得多。
电子显微镜主要包括透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。
使用透射电子显微镜时，样本的制备要求极其严格。
首先，样本需要被切成非常薄的切片，通常在几十纳米的厚度。
这是因为电子束需要能够穿透样本才能形成图像。
样本制备过程中还需要进行染色和固定等处理，以增强对比度和保持样本的结构。
在操作透射电子显微镜时，需要先将制备好的样本放入样品室中，并确保其位置准确。
然后，通过调节电子枪的电压和电流来控制电子束的强度和聚焦。
图像的获取和处理通常由计算机系统完成，可以对图像进行放大、测量和分析。
扫描电子显微镜的样本制备相对简单一些，但也需要进行干燥、镀膜等处理，以增加样本表面的导电性。
细胞各种染色方法
细胞各种染色方法细胞培养后，需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行连续地观察。
由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段，则难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。
目前，已有多种研究细胞的技术，从光镜到电子显微镜，从一般细胞化学法到免疫化学法，本章将重点介绍一些常用的观察和检测方法。
第一节培养细胞的常规检查和观察方法细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。
细胞常规检查观察的内容为：一、肉眼观察一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。
正常情况下，培养液pH介于7.2～7.4之间，呈桃红色清亮透明。
加入细胞在培养瓶中置一般温箱培养时，随着细胞生长时间的延长，细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。
在超越缓冲范围后培养液酸化变黄，如不及时调节pH，会影响细胞的生长，甚至造成细胞退变死亡。
所以，一旦发现培养液变黄，应及时换液传代。
一般更换培养液的时间，依营养物的消耗而定，正常情况生长稳定的细胞2～3天换液一次，生长缓慢的细胞3～4天换液一次。
培养液中加Hepes或用5%CO2温箱培养可使pH维持稳定，利于细胞生长。
用含磷酸盐缓冲系统培养时，可因瓶及塞子漏气，CO2溢出，也可能由于培养瓶塞洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，只致使细胞难以生长，甚至死亡。
细胞换液传代后，若发现培养液很快变黄，要注意是否有细菌污染或培养器皿没有洗干净。
贴壁细胞培养时若出现混浊，多为污染。
悬浮培养的细胞，应将瓶竖起静置1小时，若培养基混浊示为污染，也可在显微镜下仔细观察有无污染现象出现。
二、显微镜观察生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。
相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。
若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。
相差显微镜的原理
相差显微镜的原理、结构和应用曾晓飞相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的，用于观察未染色标本的显微镜。
活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化(振幅差)，这种振幅差人眼无法观察。
而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。
相差显微镜和普通显微镜的区别是:用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜1相差显微镜的基本原理当一束平行光通过被检测标本,遇到一种物点时,由于各物点对光的吸收程度不同,在显微镜视场中可见到灰度(即明暗度)不同的各物点图像,这是由于光的振幅不同所致。
如果标本中的物体近乎透明,视场中就看不出明显的灰度差别。
但由于各种物点对光波产生了衍射和折射,使得通过的光波因延迟而发生了偏离,其光程就有了一定的差别,即产生了所谓“位相差”。
人眼不能分辨这种位相差,但可以设法将这种位相差转换成振幅差。
相差显微镜就是利用光的干涉原理,将位相差转换成振幅差(即明暗差)的显微镜装置.2相差显微镜的基本构成1）与聚光镜装在一起的可转换的环状光栏它是一套在黑色的玻璃片中,有一个无色透光圈的装置,分别适配低、中、高倍接物镜和油镜。
由光源进入的光,只能通过透光环进入光路中。
2）带位相板的物镜是在物镜透镜聚焦平面上加了一圈灰黑色涂层“板”的接物镜(肉眼可以看到黑色的圈)。
3)调焦(对光)目镜原理类似一种望远镜,用于在显微镜中对上述两种装置的焦点调节,其长度可以通过手工改变。
4)一种绿(或青)色的滤光片。
以上4部分均由厂家配套供应,通常在使用前临时装于与之匹配的显微镜上,见图2。
目前,国内外销售的高档显微镜,一般都备有相差装置。
3相差显微镜的使用1）安装相差装置将普通显微镜的聚光镜卸下,将带环状光栏的聚光镜装到相匹配的显微镜上;将显微镜的普通物镜卸下,换上带位相板的物镜;将目镜换成相差显微镜专用的调焦目镜;在光源进光处放置专用的绿色滤光片(有时可以不用)。
细胞生物学实验相差显微镜及超活染色
线相位推迟1/4波长。 两种膜有不同的镀法，从而制造出不同类型的相差物镜。
负相差物镜（Negative contrast）
吸收膜和相位膜都镀在共轭面上，通过共 轭面的直射光不但振幅减弱，而且相位也 被推迟1/4λ，衍射光因通过物体时相位也被 推迟1/4λ，这样就使得直射光与衍射光维持 在同一个相位上。两波相加、增强。通过 被检物体的合成光就比背景明亮。
两类活体染色
通常把活体染色分为体内活体染色与体外 活体染色两类。
体外活体染色又称超活染色，它是由活的 动、植物分离出部分细胞或组织小块，以 染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞 的某种结构上而显色。
实验目的
观察动物活细胞内线粒体、液泡系的形态、 数量与分布；
学习一些细胞器的超活染色技术。
试剂
3. 1%詹纳斯绿B贮存液 ：称取50mg詹纳斯 绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微热 (30~40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即 为1%原液。
1/5000詹纳斯绿B工作液：取1%原液l ml加 入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液。装 入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的 充分状光阑像与相板共轭面吻合。
绿色滤光片
用于调整光源的波长使成波长范围比较窄 单色光。Olympus厂家生产的相差显微镜在 镜检时要使用该厂规定的IF550绿色滤光片 作为配套器件。
使用范围
相差显微镜能观察到透明样品的细节，适 用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、 增殖情况及细微结构的观察。
（液泡系：在动物细胞内，凡是由膜所包 围的小泡和液泡除线粒体外都属于液泡 系。）
健那绿（Tanus green）：用于染线粒体。线 粒体内细胞色素氧化酶使染料保持氧化状 态而呈蓝绿色。
某理工大学生物工程学院《细胞生物学》考试试卷(1624)
某理工大学生物工程学院《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（20分，每题5分）1. 酵母细胞分裂时，同其他细胞一样，其纺锤体也位于细胞质中。
（）答案：错误解析：与其他细胞不同，酵母细胞分裂时，其纺锤体位于细胞核中会。
2. 弹性蛋白与胶原极为相似，其氨基酸组成中都含有GlyXY重复序列。
（）答案：错误解析：磷脂弹性蛋白的氨基酸组成似胶原蛋白，也富有甘氨酸及脯氨酸，但很少含苏氨酸，不含羟赖氨酸，没有胶原特有的GlyXY序列，故不形成规则的三股螺旋结构。
弹性蛋白分子间的交联原子比胶原更复杂。
通过残基参与的交联形成富于弹性的网状结构。
3. 荧光显微镜技术只能静态观察细胞组分的分布位置和量的多少。
（）答案：错误解析：荧光显微镜技术也可用于动态观察。
例如，将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微注射入培养细胞其后后中，可以看到肌动蛋白分子装配成肌动蛋白纤维等。
4. 组成生物膜的磷脂都有一个极性的头和两个非极性的尾。
（）答案：错误解析：线粒体膜中的心磷脂有4个非极性的尾。
2、名词解释题（20分，每题5分）1. Wntβcatenin信号通路[浙江大学2019研]答案：Wntβcatenin调控信号通路是第三种由细胞表面受体所介导的调控细胞基因表达的信号通路。
Wnt是一组富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白，可作为局域性信号分子；βcatenin是节肢动物中与果蝇Arm蛋白同源的转录微调蛋白，它在胞质中的稳定及其在核内累积是Wnt 信号通路的关键。
Wnt信号通路又称Wntβcatenin信号通路，当缺乏Wnt信号时，βcatenin与Axin介导的胞质蛋白蛋白结合→βcatenin被GSK3磷酸化→磷酸化的βcatenin泛素化后被丝氨酸识别和降解→转录因子TCF与抑制因子结合在核内作为阻遏物抑制靶基因转录；当有Wnt信号时，Wnt结合受体Fz→辅助受体LRP被磷酸化→支架蛋白Axin与LRP的胞质域结合→含有GSK3和βcatenin的胞质蛋白复合物解离→避免βcatenin被GSK3磷酸化，在细胞质中所维持稳定→βcatenin转位到核内与TCF相结合激活靶基因转录。
怎样正确操作倒置显微镜
怎样正确操作倒置显微镜？1.倒置显微镜中最常用的观察方法就是相差。
由于这种方法不要求染色，是观察活细胞和微生物的理想方法。
在此提供各种聚光器来满足需要，这种方法提供带有自然背景色的、高对比度的、高清晰度的图像。
2.开机。
接连电源。
打开镜体下端的电控开关。
3.使用（1）准备：将待观察对象置于载物台上。
旋转三孔转换器，选择较小的物镜。
观察，并调节铰链式双目目镜，舒适为宜。
（2）调节光源：推拉调节镜体下端的亮度调节器至适宜。
通过调节聚光镜下面的光栅来调节光源的大小。
（3）调节像距：转三孔转换器，选择合适倍数的物镜；更换并选择合适的目镜；同时调节升降，以消除或减小图像周围的光晕，提高了图像的衬度。
（4）观察：通过目镜进行观察结果；调整载物台，选择观察视野。
4.关机取下观察对象，推拉光源亮度调节器至最暗。
关闭镜体下端的开关，并断开电源。
旋转三孔转换器，使物镜镜片置于载物台下侧，防止灰尘的沉降。
日常维护及注意事项1.所有镜头表面必须保持清洁，落在镜头表面的灰尘，可用吸耳球吹去，也可用软毛刷轻轻的掸去掉。
2.当镜头表面沾有油污或指纹时，可用脱脂棉蘸少许无水乙醇和乙醚的混合液（3:7）轻轻擦拭。
3.不能用有机溶液清擦其它部件表面，特别是塑料零件，可用软布蘸少量中性洗涤剂清擦。
4.在任何情况下操作人员不能用棉团、干布块或干镜头纸擦试镜头表面，否则会刮伤镜头表面，严重损坏镜头，也不要用水擦试镜头，这样会在镜头表面残留一些水迹，因而可能滋生霉菌，严重损坏显微镜。
5.仪器工作的间歇期间，为了防止灰尘进入镜筒或透镜表面，可将目镜留在镜筒上，或盖上防尘塞，或用防尘罩将仪器罩住。
6.微镜尽可能不移动，若需移动应轻拿轻放，避免碰撞。
7.不允许随意拆卸仪器，特别是中间光学系统或重要的机械部件，以免降低仪器的使用性能。
显微镜的使用和细胞形态的观察
显微镜的使用和细胞形态的观察
实验程序Ⅲ
细菌运动性的观察（示范）： 一般采用水浸片法、悬滴法、 半固体培养法，常用水浸法 和悬滴法来观察细菌的运动 性。 1. 水浸片法
2. 悬滴法
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显微镜的使用和细胞形态的观察
欧林巴斯（OLYMPUS）生物显微镜Ⅰ
OLYMPUS生物显微镜是由日本进口 的一种双筒光学显微镜，它使用方便， 分辨率高，并且有立体感。是目前研 究微生物的良好工具。
u 主要是油镜的使用
1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2.调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光 镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏
油中，细调至看清物象为止。 6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去 镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残
臂、镜筒、物镜转换器、 载物台、载物台转移器、 粗调节器、细调节器等部 件.它起着支持 调节 固定 等作用.
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显微镜的使用和细胞形态的观察
普通光学显微镜Ⅱ
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数=接物镜放大倍数× 接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微 镜辨析物体（两端）两点之间距 离的能力，可用公式表示为：
显微镜的使用和细胞形态的观察
欧林巴斯（OLYMPUS）相差显微镜Ⅰ
相差显微镜的工作原理 相差显微镜具有一个特殊的 由环状光圈与聚光镜组合的 转盘聚光镜，通过这个特殊 的装置，就可把光波的相位 差异变为振幅差异，从而使 人们肉眼即能观察到活细胞 的细微结构，并有立体感。 常用来观察活细胞结构，鞭 毛的运动等。
细胞观察倒置相差显微镜观察ppt培训课件
实时观察
倒置相差显微镜不仅可以用于观察细胞，还可以进行样品制备、培养、操作等实验操作，具有很高的多功能性。
多功能性
02
细胞观察倒置相差显微镜的操作流程
贴壁细胞
将细胞接种至培养皿或培养板中，待细胞生长至汇合度约70%-80%时进行观察。
悬浮细胞
将细胞接种至适当的培养基中，轻轻摇动培养基以避免细胞沉淀，待细胞生长至汇合度约70%-80%时进行观察。
应用拓展与未来展望
环境监测领域
02
倒置相差显微镜可以用于观察和监测水体、土壤等环境中的微生物生态，为环境保护和治理提供有力支持。
科研领域
03
随着科研工作的不断深入，倒置相差显微镜将成为科研人员的重要工具，例如在化学反应机理研究、材料科学研究等领域的应用将进一步扩大。
06
细胞观察倒置相差显微镜的相关问题及解决方案
细胞活性检测不准确
采用多种检测方法相互验证，如MTT法和CCK-8法等，提高检测准确性。
倒置相差显微镜操作不熟练
加强培训和实践操作，熟悉显微镜的各项功能和操作流程。
技术难题及解决方案
THANKS
感谢观看
干涉图中的明暗区域代表了样品的不同特征，如细胞的边界和内部结构。
倒置相差显微镜的特点
倒置相差显微镜具有高分辨率，能够清晰地观察细胞的细节和结构。
高分辨率
由于倒置相差显微镜采用倒置设计，可以方便地观察活细胞和组织，无需进行样品制备和染色等步骤。
观察活细胞
倒置相差显微镜可以实时观察细胞的变化和运动，为科学研究提供重要的实验数据。
增强自动化
自动化技术将在倒置相差显微镜中发挥越来越重要的作用，包括自动聚焦、自动调整亮度和对比度等功能，从而提高观察的效率和准确性。
4 相差显微镜的调试与使用
• 2 绘图表示相差显微镜下观察到的口腔上皮细胞的结构。 3. 分成3个大组，参观电子显微镜室，了解电子显微镜 的大致结构。（光源，成像系统，样品室，观察记录 系统，真空系统，供电系统） • 作业： • 1 相差显微镜有哪些特殊的结构？ • 2 如何进行生物绘图？
培养细胞
生物绘图要求
• (1）科学性和准确性 。 • （2）点、线要清晰流畅 线条要一笔画出，粗细均匀， 光滑清晰，接头处无分叉和重线条痕迹，切忌重复描 绘。植物图一般用圆点衬阴，表示明暗和颜色的深浅， 给予立体感。点要圆而整齐，大小均匀，根据需要灵 活掌握疏密变化，不能用涂抹阴影的方法代替圆点。 • （3）比例要正确 。 • （4）准确的标注 图注一律用正楷书写，应尽量详细， 并要求用水平的直线引出，最好在图的右侧，必须整 齐一致。作为实验报告，图及图注一律要求用铅笔， 通常用2H或3H铅笔，不要用钢笔、有色水笔或圆珠笔。 图题写在图的下方。
标本的制备
1. 制作口腔上皮细胞涂片 用牙签轻轻刮取口腔黏膜上皮细胞，涂 在载玻片上，滴一滴PBS或生理盐水( 磷 酸盐缓冲液），盖上盖玻片，用滤纸吸 去多余的液体，置于相差显微镜下观察。 （10倍或20倍物镜下）
观察
• 1放置活细胞标本进行观察。注意物像与背景的明暗反 差，以及细胞内的细微结构。 • 2 换上40倍的相差物镜和40倍的环状光阑，重复调试 步骤的5－9。再放上标本进行观察。
相差显微镜的工作原理
• 光的衍射
光的干涉 相长干涉与相消干涉 明反差与暗反差
调试方法
• 1 将显微镜的 2 个普通物镜分别换成相应倍数的的相差物镜（ 10 倍或40倍）。 • 2 旋松固定聚光镜的螺杆， 将普通聚光器换成具有环状光阑的 聚光器；旋松调节柄的小螺杆，使0对着操作者。 • 3 在底座的光源上方安装滤光片。 ( 如果没有，则可以省去此步 骤） • 4 将光源亮度开关调至最小，插上电源，打开开关，慢慢将亮度 调至合适。 • 5 在载物台上放置一标本（永久装片 - 人血液涂片），使用 10 倍 的相差物镜，聚焦使物像清晰，然后移去标本。 • 6 将聚光器下转盘的10对着操作者。这时10倍的相差物镜正好与 10倍所需的环状光栏匹配。 • 7 应用起子或 6 角内扳手旋松固定目镜的螺杆，取下一目镜，装 上合轴望远镜， • 旋松合轴望远镜的固定螺杆，调节合轴望远镜的镜筒长度， 使相差物镜的相板黑环成的像清晰，然后固定合轴望远镜的长度。 缓慢调节聚光器的高度，使环状光阑亮环的像清晰。 • 8 边观察视野内的暗环和亮环，边前后推动聚光器下圆盘两侧的 拉杆（先旋松才能推动），移动环状光阑，使黑环和亮环重合 , 然后旋紧拉杆。 • 9 移去合轴望远镜，将目镜重新安上，并固定好目镜。 • 10 放上标本观察。
如何利用显微镜进行细胞结构观察
如何利用显微镜进行细胞结构观察在生物学和医学等领域，观察细胞结构是一项至关重要的任务。
显微镜作为我们探索微观世界的有力工具，为我们打开了了解细胞奥秘的大门。
下面就让我们一起来了解如何利用显微镜进行细胞结构的观察。
首先，我们需要选择合适的显微镜。
常见的显微镜有光学显微镜和电子显微镜。
光学显微镜在一般的实验和教学中较为常用，它包括普通光学显微镜、相差显微镜和荧光显微镜等。
电子显微镜则具有更高的分辨率，能观察到更细微的结构，但使用成本较高，操作也相对复杂。
对于大多数细胞结构的观察，普通光学显微镜就能够满足需求。
在进行观察之前，要准备好待观察的样本。
样本可以是细胞涂片、组织切片或者细胞培养物等。
以细胞涂片为例，通常需要经过细胞收集、固定和染色等步骤。
固定可以使细胞的结构保持稳定，常用的固定剂有甲醛、乙醇等。
染色则能增强细胞结构的对比度，便于观察。
例如，用苏木精伊红（HE）染色可以区分细胞核和细胞质。
接下来就是显微镜的使用了。
将显微镜放置在平稳的台面上，避免震动影响观察效果。
接通电源，打开光源调节旋钮，使光线亮度适中。
然后将制备好的样本放在载物台上，用玻片夹固定好。
调整粗调旋钮，使物镜接近样本，但不要碰到样本。
通过目镜观察，同时缓慢转动粗调旋钮，直到能看到模糊的物象。
此时再转换到微调旋钮，直至物象清晰。
在调节过程中，要注意双眼同时睁开，一只眼睛观察目镜，另一只眼睛用于绘图或记录。
在观察过程中，还需要注意不同物镜的使用。
低倍物镜（如 4×或10×）视野较大，适合用来寻找目标区域。
找到目标后，再切换到高倍物镜（如 40×或 100×）进行更细致的观察。
切换物镜时，要注意避免物镜与玻片碰撞。
此外，显微镜的一些特殊功能也能帮助我们更好地观察细胞结构。
比如相差显微镜可以用于观察未经染色的活细胞，它利用光的相位差来增强对比度。
荧光显微镜则可以观察经过荧光标记的细胞成分，使特定的结构发出明亮的荧光。
相差显微镜和荧光显微镜使用教程
4．高压汞灯关闭后不能立即重新打开， 需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定， 影响汞灯寿命。
五、用途 1 观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或 标记的细胞和结构 2 标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜 色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内 的分布。组织中的自发性荧光物质如神经细胞和 心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细 胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A呈绿色荧 光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类 物质（儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺等）在甲醛 作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、 四环素等药物也呈现一定的荧光。
二、荧光显微镜的种类： 透射式 落射式
三、荧光显微镜主要部件
透射式
落射式
汞灯光源 激发滤色镜 吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜
透射荧光显微镜光路图
落射荧光显微镜光路图
双重染色标本的单色和双色观察
WU WIB DUAL BAND
DAPI+FITC
相差附件
2.3使用方法 （1）相差装置的调换安装 卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装 在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸 收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照 明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。 再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。 （2）调焦 打开光源，旋转集光器转盘，将“0”对准标示孔， 使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜， 按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。 旋转环状 光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相 适应，如相差物镜为40X时应用40X标示孔的光阑。
四、使用方法． 1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达 到最亮点。 2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装 上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应 的阻断滤片。 落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所 要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的 插块。 3．放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应 注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引 起眼的损伤；
德国 Zeiss 全自动活细胞 工作站 快速操作指南
德国Zeiss全自动活细胞工作站快速操作指南制作：蔡司光学仪器（上海）国际贸易有限公司王丹2010年4月一：本显微镜主要观察方法简介明场：适合常规镜检、病理、染色样品的观察方法。
此观察方法优点是视野亮度高、均匀，应用范围广，操作简单。
缺点是：透明标本对比度低，标本没有立体感相差：利用被检物体的光程（折射率x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差。
鉴定活体细胞最实用、最经济的方法荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
荧光显微镜利用荧光光源激发样品中的荧光物质，检测激发光的情况以上各种观察方法配合活细胞孵育装置，即可完成对活细胞的各种观察要求。
活细胞孵育装置通过软件或TFT触摸屏中Incubation模块进行精细的调节。
二：显微镜各主要部件缩略图部件名称1 电源开关2 左侧照相端口3 左侧粗/微调焦旋钮4 调焦限位器5 物镜转盘6 聚光镜垂直调节器7 聚光镜对中螺丝8 聚光镜(手动/电动)9 显微镜载物台10 3孔滤片拉板(直径25 mm)11 反射光孔径光阑或FL衰减器12 反射光视场光阑13 光源管理器14 载物台XY轴调节器15 反射光转盘(电动或编码显示)16 右侧粗/微调焦旋钮17 右手控制按钮18 透射光照明器开关控制器19 反射光照明shutter开关控制器20 TFT显示器21 卤素灯电压控制器22 双目观察筒23 双目观察筒的双目筒24 目镜25 目镜调节环26 起偏器D 2个滤片支架或者3个滤片支架27 透射光视场光阑三：系统开关机：4．打开电脑及软件先关软件，然后是荧光光源、显微镜开关、电源开关！！1.打开显微镜电源总开关2.打开显微镜开关3．拍荧光时打开荧光光源三：明场观察成像操作流程1.开总电源,显微镜开关(“ON/OFF”) 孵育装置及电脑2.打开卤素灯的光闸“TL”使光线透过聚光镜穿透样品3.调节光强，光路100%转到眼睛4.聚光镜打到H 位5.反射镜转轮打到BF明场位置6.低倍（如10X倍）下观察样品，通过X/Y拉杆移动载物台至目标位置，并通过粗细调焦旋钮聚焦，然后再调至高倍7.准备拍照了，首先光路切换至相机8.打开软件，点开Live 按钮9.先曝光Exposure——对照Live结果进一步精细聚焦——调节曝光时间——如果彩色模式拍照需要做自动或互动式白平衡（White balance，Interactive）——再次曝光后——Snap成像——保存Save10.拍照完毕，先关软件，再关显微镜，孵育装置及电脑四：相差观察成像操作流程1. 开总电源,显微镜开关(“ON/OFF”) 孵育装置及电脑2. 打开卤素灯的光闸“TL”使光线透过聚光镜穿透样品3.调节光强，光路100%转到眼睛4.聚光镜根据物镜后面的Ph标注打到Ph 1/ Ph 2 或Ph3位5.反射镜转轮打到BF位6.低倍（如10X倍）下观察样品，通过X/Y拉杆移动载物台至目标位置，并通过粗细调焦旋钮聚焦，进而转到高倍，根据个人不同需求7.准备拍照了，首先光路切换至相机8.打开软件，点开Live 按钮9.先曝光Exposure——对照Live结果进一步精细聚焦——调节曝光时间——彩色模式下做白平衡——再次曝光后——Snap 成像——保存Save10.拍照完毕，先关软件，再关显微镜，孵育装置及电脑六：荧光观察成像操作流程1.开总电源,显微镜开关(“ON/OFF”)，荧光光源，孵育装置及电脑2.先按明场或相差观察方法找到阳性信号3.关闭卤素灯光闸”TL”，打开荧光灯光闸“RL”4.反射镜转轮根据标记探针的颜色打到GFP，Rhod 或DAPI5.准备拍照了，首先光路切换至相机6.打开软件，点开Live 按钮7.先曝光Exposure——对照Live结果进一步精细聚焦——调节曝光时间——Snap成像——保存Save8.拍照完毕，先关软件，再关显微镜，孵育装置及电脑七：Axiovision 软件说明7．1使用AxioVision 软件拍摄图像的时候,为了其他同学能够拍摄到比较好的图像,请严格按照以下的设定默认参数进行.不要对软件的某些关键参数进行调节.下列的图例中,红色标记的参数为推荐参数图像的分辨率拍摄区域的大小7．2活细胞时序连拍流程时序模块可用于获取一定时间内的一系列图像，如活细胞长时间的观察和拍摄，生成的图像就是一个时间序列，可用于分析随时间变化的过程。
培养物的观察和检测方法
培养物的观察检测方法
2.普通染色观察
苏木精—伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色和Giemsa染色 是观察培养细胞一般形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保 存的主要方法。
对于贴壁培养的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于 操作。固定、染色、封片三个步骤。
对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀(1000 r/min, 10 min), 弃上清液后（留少量液体），将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，冷 风吹干。
培养物的观察检测方法
3.细胞化学技术
细胞化学技术（cytochemistry）可特异性地显示细胞内的 细胞器和化学成分，其技术成熟，效果稳定，费用较低，即使 在免疫细胞化学畅行的今天，也仍不失为有效的研究技术。
几种最常用的研究指标和方法： 3.1 酸性磷酸酶 3.2 葡萄糖—6—磷酸酶 3.3 琥珀酸脱氢酶
Pale Squamous Cells (scrapings from the inside of mouth)
1600x – Bright Field
Pale Squamous Cells (scrapings from the inside of mouth)
1600x - Phase Contrast
4.2.2 碱性磷酸酶 用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）代替HRP作
标记物进行免疫酶染色，主要用于内源性过氧化物酶含量高的 细胞，以避免非特异性染色。
培养物的观察检测方法
4.免疫细胞化学技术
4.2 常用的显色标记物
4.2.3 荧光素 用荧光素（(luorescein)作标记物的ICC常称为免疫荧光技术。异硫
SPA法