利用GmNH23基因过表达转基因植物对其广谱抗病毒特性的研究

利用GmNH23基因过表达转基因植物对其广谱抗病毒特性的研究植物中克隆得到的抗病（resistance,R）基因大多数编码NBS-LRR类蛋白。本实验室在前期研究中从大豆中克隆得到了一个NBS-LRR家族抗病毒蛋白编码基因GmNH23,对TMV（tobacco mosaic virus,烟草花叶病毒）和 SMV（soybean mosaic virus,大豆花叶病毒）具有抗性。

前期研究中我们只做了GmNH23基因的瞬时表达及抗性研究,而未进行稳定表达及其功能验证。为了验证GmNH23稳定表达后的抗性,并验证其是否具有广谱抗病毒活性,本论文以马铃薯敏感品种夏波蒂为材料,得到了过表达GmNH23转基因马铃薯,对其抗病毒活性进行了研究。

建立了高效的马铃薯再生及遗传转化体系。转化体系如下:马铃薯叶片预培养、共培养培养基为MS+1.6%葡萄糖+5 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA;愈伤组织芽诱导培养基为MS+1.6%葡萄糖+0.02 mg/L NAA+0.02 mg/L GA₃+2.0 mg/L ZTR;农杆菌菌液侵染浓度OD₆₀₀=0.7,侵染时间为15 min,共培养2 d;特美汀和头孢曲松钠作为脱菌剂,浓度分别为200 mg/L和500 mg/L;由于遗传转化所用的两种重组载体骨架上分别具有潮霉素（Hyg）和卡那霉素（Kan）标记基因,故采用两者进行抗性筛选,在芽诱导及生根阶段的浓度分别为4 mg/L和50 mg/L。

经愈伤组织再分化与抗生素筛选后获得多株马铃薯转化幼苗,经基因组PCR 技术鉴定到了21个阳性植株,经RT-PCR进一步检测发现16株转基因株系成功表达了GmNH23基因,Western blot实验也证明了GmNH23蛋白的表达。PVY（potato virus Y,马铃薯Y病毒）是一种马铃薯的严重病害,且与SMV同属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）。

利用PVY对GmNH23过表达马铃薯幼苗进行侵染发现与野生型植株相比,转基因植株的症状明显减轻;同时对前期实验室获得的过表达本氏烟草幼苗进行PVX、PVY侵染发现与野生型植株相比,转基因植株的症状明显减轻,在野生型本氏烟

草中瞬时表达GmNH23后侵染两种病毒,也均出现超敏反应,说明GmNH23对PVX、PVY均具有抗性。本研究同时获得了GmNH23基因过表达的转基因烟草,对其T3

代经基因组PCR检测发现阳性检出率为100%,经RT-PCR进一步检测,阳性检出率为80%。

利用TMV-GFP对GmNH23基因过表达的转基因烟草进行侵染,发现与野生型植株相比,转基因烟草的病毒扩散率降低了约5倍,说明GmNH23在烟草中的稳定表达也表现对TMV的抗性。综上所述,本论文的结果表明从大豆中克隆得到的GmNH23基因不仅对SMV具有抗性,同时还对PVX、PVY和TMV具有抗性,说明其具有广谱抗病毒特征。

本论文的研究成果为利用GmNH23改良作物对病毒的抗性打下了理论基础。