发酵法生产谷胱甘肽(GSH)分离纯化工艺优化

发酵法生产谷胱甘肽（GSH）分离纯化工艺优化谷胱甘肽(GSH,L-γ-谷氨酸-L-半胱氨酸甘氨酸)是一种广泛存在于动植物和微生物细胞中具有重要生理功能的活性三肽。目前,国外分离GSH主要应用铜盐法及离子交换法,国产离子交换树脂用于分离纯化GSH虽有报道,但离真正应用还有距离。

在经前人筛选出苯乙烯系硫脲树脂作为分离介质的基础上,我们基本确定了一条包括酵母细胞的破碎、抽提液预处理、杂蛋白去除、浓缩、层析、结晶的工艺路线,并对其中一些步骤进行优化。经过优化,真空浓缩选择65℃浓缩不超过4h为最佳,此时GSH收率可达92%；用100-200目处理好的硫脲树脂填成床层高度为F3.5x35cm的层析柱,采用pH3.00.1mol/L(NH)2HPO4—HCl缓冲液、

pH3.00.2M NH4CI—HCl缓冲液分别处理层析柱后上样洗脱,所得的洗脱收率与采用pH3.00.lmol/1(NH)2HPO4—HCl缓冲液时相当；当上样浓度加倍至2400mg/L,洗脱效果基本保持不变,提高了树脂使用率；最佳洗脱流速为7mL/min;柱高不低于20cm均可以达到分离纯化GSH的目的；当柱高高于31cm时在两个GSH洗脱峰中均可以收集到可以用于结晶的部分,柱高低于31cm时只能收集第二个洗脱峰的部分洗脱液用于结晶；能用于结晶的洗脱液的pH值主要集中在3.5-4.5之间,可简化为用pH检测来收集洗脱液；对结晶工艺流程改进为：在洗脱液浓缩

400-500倍后加入60%-70%异丙醇,调pH值2.82-2.88之间,加入1%～2%的GSH 晶种,室温放置0.5h,降温至10℃放置8h,然后真空干燥。

工艺的总收率约为45%,产品纯度为99%。在进行技术转让验证实验时,发现树脂在使用60次后分离效果明显变差,经再生处理后树脂的吸附能力变弱,洗脱效果不如以前,为此我们对于树脂再生条件进行研究：发现经酸碱处理过的需再

生的树脂对GSH的吸附容量最大,故采用NaOH、HCl溶液来再生树脂；经过

1.0mol/L浓度的NaOH、HCl溶液再生的树脂于室温下在pH3.50-3.75之间吸附GSH后,再用浓度为3%NaOH溶液进行解吸,吸附容量达18mg/g干树脂,解吸得率可达95%左右。

在此基础上我们确定出再生已失效的树脂的具体操作方法。在对现有GSH 分离纯化工艺优化的同时,我们对其吸附GSH作用机理开展研究：发现GSH与苯乙烯系硫脲交换树脂之间存在疏水作用和另外的作用力,且这两种作用之间存在协同作用。

在整个小试工艺趋于成熟、稳定的基础上,我们于2006年7月开始在亦庄中试实验基地进行了中试技术放大,以使该方法可以应用于工业化生产。中试实验对抽提、树脂及层析柱的预处理、树脂吸附量、洗脱条件、用水量等按照小试工艺进行了放大,并对热水抽提、层析洗脱进行了条件优化。

中试抽提得率为80%左右,低于小试的抽提得率90%以上。在层析分离段,由于放大效应等问题,目前得不到适合结晶的洗脱液,没有得到GSH产品。