CRISPRCas9系统工作原理

二、作用过程
• CRIPSR基因座的表达与crRNA 的成熟
• CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPR
RNA，然后在Cas9和核酸酶的作用下被剪
切成成熟的crRNA
ห้องสมุดไป่ตู้
基因座结构
CRISPR/Cas的基因座结构相对简单
以产脓链球菌的典型TypeIICRISPR/Cas为例
5'端
• tracrRNA基因
二、作用过程
①获得CRISPR的间隔区
②CRIPSR基因座的表达 与crRNA 的成熟
③CRISPR/Cas系统对 外源遗传物质的切割
二、作用过程
• 获得CRISPR的间隔区
• 细菌通过将入侵的噬菌体或质粒的一小段
DNA序列整合到自身基因组的重复序列之
间，即CRISPR 5'端的两个重复序列之间， 从而获得高度可变的间隔区域
三、应用与前景
• CRISPR/Cas系统作为一种新型的基因组定点修饰技术， 它的出现大大推动了对基因功能的研究。但作为一种新兴 的技术，它的基础理论研究还远远不够，很多分子机制尚
不明确，技术也不够成熟。尽管现在还存在诸如如何将构
建的系统成功导入人体内、脱靶现象以及切割特异性略低 于TALEN等问题，但是相信在不久的将来一定可以找出解 决的方案。总之，CRISPR-Cas系统研究时间虽短，但发 展迅猛，以后一定会有更广泛的应用。
CRISPR/Cas9系统
第三小组 找资料：李瑶 王辰尹 郑小云 整理资料：王桂玉 段林菲 刘成凤 PPT制作：张龙 勉惠 龙欢 汇报：辛国琴
目录
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简介 作用过程
应用与前景
一、简介
• 1、引入：
• 基因定点修饰是研究基因功能的重要手段之一 也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技 术成为现代分子生物学的研究热点。早期仅基于 同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到限 制。直到人工核酸内切酶出现，将这一现状彻底 改变。
三、应用与前景
•
医疗上：还可以用在细胞水平建立疾病模型，治疗遗传
疾病以及进行细胞替代治疗。HIV-1病毒有时能以休眠状 态存在于人类宿主细胞中，如果将LTR-targeting CRISPR/Cas9复合物导入HIV病毒或者已经诱导的T细胞 中，可以使HIV失去致病性。更重要的是，该复合物甚至
能够剪切己经插入宿主染色体上的病毒基因。
虽然CRISPR/Cas的研究还处于初始阶段，
但是其已经被应用在工业、学术和医疗领域。
工业上：利用该系统构建出具有噬菌体抗性的菌株以提高
奶制品发酵的产量。也能把它的这种特性用于菌株分类， 以及防止某些特殊质粒的扩散，防止基因污染，以保存菌 株。 研究上：CRISPR/Cas系统不仅可以用来进行基因敲除， 还可以敲入基因。可以在CRISPR/Cas系统切割目的基因的 同时，通过同源重组修复断点的原理引入特定突变或者插 入目的基因片段。该技术已经成功应用于细菌、斑马 鱼、 果蝇、线虫、酵母、小鼠、人类细胞以及水稻等。
三、应用与前景
CRISPR/Cas9作为第三代人工核酸酶成为目前研究的热点， 相对于ZFN和TALEN有其独特的优势： a．构建简单方便快捷，适用于任何分子生物实验室； b．用于基因组的点突变编辑优于ZFN或TALEN； c．CRISPR/Cas9精确的切口酶活性用于基因治疗安全性高 于ZFN或TZLEN。
一、简介
• 2、简介：
• 人工核酸酶的原理是一样的，都是由DNA结合蛋白与核 酸内切酶融合而成。
• 2013年初，一种全新的人工核酸内切酶 CRISPR/Cas9
• 它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其
特点是制作简单、成本低、作用高效。
一、简介
• CRISPR • 全名：clustered regularly interspaced short palindromic repeats 即成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短 重复序列的位点，这种位点在细菌和古细菌胞内起到了一种获得性免 疫（acquired immunity）的作用。
• CRISPR系统主要依赖crRNA和tracrRNA来对外源DNA进行序列特
异性降解。 • 目前已经发现了3种 CRISPR/Cas系统， TypeI，TypeII，
TypeⅢ3 ，其中TypeII系统是目前改造最为成功的人工核酸酶，因为
其只需一个Cas9蛋白就能够发挥CRISPR系统的免疫作用
• 因此，CRISPR基因座中的间隔序列从5'到3'的
排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。 • 噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称 为protospacer，通常protospacer的5'或是3'端延 伸几个碱基序列很保守，被称为PAM，它的长度 一般为2～5碱基，一般与protospacer相隔1～4碱 基。
• 一系列Cas蛋 白 编 码 基因 • CRISPR基因座
中间
3'端
二、作用过程
• CRISPR/Cas系统对外源遗传物质的切割
• 成熟的tracrRNA、crRNA和Cas9形成核糖
核蛋白复合物，crRNA识别外源匹配的
DNA序列并与之结合，从而介导核糖核蛋 白复合物对外源遗传物质的切割.
三、应用与前景
一、简介
3、该系统的工作原理：
crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过
碱基配对与 tracrRNA （trans-activating
RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物
此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA
配对的序列靶位点剪切双链 DNA。
一、简介