微生物培养

生物信息科学发表于 2006-3-17 15:42:00

微生物培养法

在本章开始时，我们就提到微生物是“以数取胜”或“以量取胜”的。在了解了它们生长规律的基础上，就应进一步知道，在实验室或在生产实践上，究竟可采取何种科学方法来保证所需微生物的大量繁殖，并进而产生大量有益代谢产物。为此，这里将从历史和现状的角度把较有代表性的微生物培养方法及装置作一简要介绍，以期能获得一个较系统和较全面的认识。

一个良好的培养装置，应在提供丰富而均匀的营养物质的基础上，能保证微生物获得适宜的温度和对绝大多数微生物所必需的良好通气条件(只有少数厌氧菌例外)，此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂菌的污染等。

从历史发展的角度来分析，微生物培养技术的发展主要有这样几个特点：①从少量培养发展到大规模培养；②从浅层培养发展到厚层(固体)或深层(液体)培养；

③从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主；④从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养；⑤从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养；⑥从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团；⑦从单纯利用微生物细胞到大量培养、利用高等动、植物细胞；⑧从单菌发酵发展到混菌发酵；⑨从利用野生菌种发展到利用变异株以及“工程菌”，等等。

概括地说，微生物的培养方法可分为八个大类，即：

现分别简要介绍如下。

一、实验室培养法

(一)固体培养

1．好氧菌的培养主要有试管斜面、培养皿平板及较大型的克氏扁平、茄子瓶等的平板培养方法。

2．厌氧菌的培养培养厌氧菌除了需要特殊的培养装置以外，首先还要配制特殊的培养基。在这种培养基里，除了要满足六种营养要素外，还要加入还原剂和氧化还原势的指示剂(见第五章)。在用固体培养基培养厌氧菌的方法中，主要有：

(1)高层琼脂柱用加有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，以培养相应的厌氧菌。在这种培养基中，越是深层，其氧化还原势越低，因而越有利于厌氧菌的生长。

(2)Hungate滚管技术1950年，美国著名微生物学家R．E．Hungate因分离瘤胃微生物和产甲烷菌等严格厌氧菌的需要，设计了一种具有划时代意义的严格厌氧技术——Hungate滚管技术(Hungateroll-tubetech-nique)。其主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用高纯氮驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下，从而保证了这类严格厌氧菌的存活。用这种方法制备成的培养基称为预还原无氧灭菌培养基(PRAS培养基，pre-reducedanaerobicallysterilizedm edium)。在进行产甲烷菌等严格厌氧菌的分离时，可用Hungate的“无氧操作”把菌液稀释，并接种到融化后的PRAS琼脂培养基中，然后将此试管(图7-13)用丁基橡胶塞严密塞住后平放，置冰浴中均匀滚动，使含菌培养基布满在试管的内表面上，犹如好氧菌在培养皿平板表面一样，最后长出许多单菌落。滚管技术的优点是：①试管口与空气接触面积小；②经滚动后，试管的内表面上有大面积的固体培养基可供长出单菌落。

(3)厌氧培养皿用于厌氧培养的培养皿有几种设计。有的是利用皿盖去创造一个

狭窄空间，加上还原性培养基的使用而达到无氧培养的目的(例如Brewer，皿，见图7-14)；有的则利用皿底有两个相互隔开的空间，其中之一放焦性没食子酸，另一则放NaOH溶液，待在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后，立即密闭之。经摇动，使焦性没食子酸与NaOH溶液接触，发生吸氧反应，从而造成无氧环境(例如SPray皿或Bray皿，见图7-14)。

(4)厌氧罐(anaerobicjar)技术这是一种常规的不很严格的厌氧技术，可用于培养多数厌氧菌。在罐内一般可放10个常用的培养皿(直径9cm)或任何液体培养的试管。厌氧罐的类型很多，但一般都有一个用聚碳酸酯制成的透明罐体，上有一可用螺旋夹紧密夹牢的罐盖，盖内的中央有一不锈钢丝织成的网袋，内放钯催化剂；罐内还放一含美蓝的氧化还原指示剂(图7-15)。使用时，先装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气(N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V)。这样，罐内少量剩余氧在钯催化剂作用下，可被灌入的混合气中的H2还原成水，从而造成很高的无氧状态。这时指示剂美蓝被还原成无色。

目前，国际上盛行方便的“GasPak”产气袋商品，把袋口剪开一角并加适量水后，即会自动放出足够的CO2和H2。这就是内源式的氢气和二氧化碳源。其原理是：

产H2反应：

一般用0.6硼氢化钠与40ml的水起作用即可产生1250ml氢气。

产CO2反应：

(5)厌氧手套箱(anaerobicglovebox) 这是50年代末问世的用于研究严格厌氧菌的重要装置。箱内既可通过塑料手套进行种种操作，又可进行恒温培养。箱体结构严密，箱内一般充以85％N2、5％CO2和10％H2，同时以钯催化剂催化除O2，使箱内始终维持严格无氧状态。物件可通过有密闭装置的交换室进出箱体。

上述的厌氧手套箱技术、Hungate滚管技术和厌氧罐技术已成为现代研究厌氧菌最有效的三项基本技术。

(二)液体培养

1．好氧菌的培养由于大多数微生物都是好氧菌，且微生物只能利用溶于水中的氧，所以，如何保证在培养液中有较高的溶解氧浓度就显得特别重要。

在常压下(20℃)达到平衡时，氧在水中的溶解度仅为6.2ml/L(0.28mmol)。这些氧只能保证氧化8.3mg(即0.046mmol)葡萄糖，仅相当培养基中常用葡萄糖浓度的1‰。除葡萄糖外，培养基中的无机或有机养料一般都可保证微生物使用几小时至几天，因此，对好氧菌来说，生长的限制因子几乎总是氧的供应。只有将培养液装成浅层时，氧才不至于成为限制因子。在进行液体培养时，一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率，具体措施有：①浅层液体培养；②利用往复式或旋转式摇床(shaker)对三角瓶培养物作振荡培养；③在深层液体培养器的底部通入加压空气，并用气体分布器使其以小气泡形式均匀喷出；

④对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上设置阻挡装置。

在实验室进行好氧菌培养的具体方法有以下几类：

(1)试管液体培养装液量可多可少。此法的通气效果一般均不够理想，仅适合培养兼性厌氧菌。

(2)三角瓶浅层培养在静止状态下，三角瓶内的通气状况与其中装液量(表7-9)和棉塞通气程度对微生物的生长速度和生长量有很大的关系。此法一般也仅适宜培养兼性厌氧菌。