完整肽聚糖提取工艺的研究

样酶就可以畅通的进入细胞，有效分解蛋白、核酸等 物质。 实验对酶的种类、浓度、作用温度、作用时间进 行了正交实验L9（34）。 酶的种类为胰酶、胰酶+碱性蛋 白 酶 、 胰 酶 + 核 酶 ； 浓 度 分 别 为 2 000，3 000，4 000 NFU；作用温度为55，60，65 ℃；作用时间为6，12，24 h。 实验结果分析如表2所示。
（1） 磷 质 量 分 数 的 测 定 采 用 国 标 GB/T1515 2002； 游 离 氨 基 氮 的 测 定 采 用 国 标 GB/T12143.2 1989。
（2）磷壁酸的去除。 用质量分数10%为TCA溶液按 10︰1（体 积 与 质 量 比 ）溶 解 菌 泥 ，珠 瓶 摇 匀 后 ，分 为4 组 （4，30，50，70 ℃）；分 别 在1，2，3，4，5，6，7，8 h 取 样 。 每个取样点取样1.5 mL，放入10 mL离心管中，立即离 心 （8 000 g，20 min，4 ℃），将 上 清 液 放 入 另 一 离 心 管 中保存，用于微量磷的测定。 反应结束后，终样用经灭 菌的磷酸盐缓冲液（浓度为0.02 mol/L，pH值为7.4）清
图3 不同温度及时间下对提取肽聚糖的影响 由图3可以看出， 随着时间的增加所释放的磷质 量浓度也随之增加，70 ℃在作用1 h后即进入平台期， 质量浓度较高；50 ℃也在作用1 h后进入平台期，但提 取 磷 质 量 浓 度 较70 ℃低 ；而4 ℃则 相 对 较 晚 ，且 相 对 于其他温度提取磷质量浓度最低 。 因此，确定TCA的 作用温度为70 ℃，作用时间为1 h。 2.4 最佳酶解条件对提取肽聚糖的影响 TCA提取出磷壁酸后， 菌体细胞通透性增加，这
Studies on the optimum extraction process of whole peptidoglycan
FU Yan-ru，JIN Ye
(Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018,China)
Abstract: According to the study on the extraction of whole peptidoglycan , we drawed up a set of optimum extraction process of bifidobacterium infantis whole peptidoglycan. The results show: 10% TCA at 70 ℃ deal with the bacteria 1h,then skim,which can release the high phosphorus content. After trypsin and alkaline of the double-enzyme hydrolyzed ,which enzymatic hydrolysis conditions were at 60 and 12h. Transmission electron microscope images showed that the samples are intact. Key words: bifidobacterium infantis; whole peptidoglycan; optimum extraction process
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510.933 580.533 573.667 582.500
685.533 586.733 597.100 593.267
563.667 592.867 589.367 584.367
174.600 12.334 23.433 10.767
结果 487.5 527.9 517.4 687.4 684.0 685.2 566.7 548.3 576
洗3次，离心（8 000 g，20 min，4 ℃），沉淀称质量。 （3）脱脂方法。 用浓度为0.05 mol/L乙酸调节浓度
为0.02 mol/L乙酸钠溶液pH值至4.6，将上述溶液混合 后再于氯仿、甲醇，三者按体积比4︰5︰10混合。 用混 合液溶解残渣，体 积 比 为20︰1。 室 温 搅 拌24 h，离 心 （8 000 g,20 min ，4℃ ） ， 沉 淀 用 甲 醇 清 洗 2 次 ， 离 心 （8 000 g。 20 min，4℃），收集沉淀。
体70 ℃作用1 h后，脱脂释放出的磷质量分数较高。 再经胰酶和碱性蛋白酶于60 ℃水浴12 h后，经电镜观察其冻干物细胞形态较为完整。
关键词: 婴儿双歧杆菌；完整肽聚糖；最佳提取工艺；
中 图 分 类 号 ：Q813
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：1001-2230 （2009 ）04-0012-04
完整性。
2 结果与分析
2.1 脱脂和TCA顺序对提取肽聚糖的影响 肽聚糖是许多细菌细胞壁的主要成分，如革兰氏
阳性细菌胞壁所含的肽聚糖 占 干 重 的50%~80%，而 膜 磷壁酸和壁磷壁酸穿插于肽聚糖层间，由于磷壁酸与 细胞生长有关且能阻止胞壁通透性。 因此，去除磷壁 酸将会使细胞通透性增加，有利于外界物质更好的作 用细胞。 而TCA是去除脂磷壁酸的有效方法。 因此， 磷质量浓度的测定能有效地反映出磷壁酸的抽提程 度。 图1为脱脂和TCA顺序对提取肽聚糖的影响。
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酶解条件的优化有利于进一步去除壁内蛋白和 核酸。 由表2可以看出，A2B3C2D2组合游离出的氨基氮 最高。 且酶的种类为主要影响因素，其次为温度，而酶 的浓度和酶解时间则对实验影响不大。 因此，确定最 佳酶解条件为胰酶+碱性蛋 白 酶 ，2000U，60 ℃，12 h。 图4为最佳酶解条件对提取肽聚糖的影响。
0引言
双 歧 杆 菌 (Bifidobacterium) 是 人 和 动 物 肠 道 内 数 量最多、 且与人体健康息息相关的生理性益生菌，其 具有生物屏障、调整肠功能紊乱、增强机体免疫力及 抗肿瘤等作 用[1]。 双 歧 杆 菌 完 整 肽 聚 糖(Whole Peptidoglycan, WPG) 是双歧杆菌细胞壁中的重要组分，由 完整双歧杆菌细胞分离得到的、未经物理破碎并保持 细菌细胞壁骨架完整性的细胞壁结构，是由多糖和肽 聚糖聚合而成的“袋形”结构，它保持了全菌的一些重 要Leabharlann Baidu生物学特性[2-6]。 已有报道WPG能 明 显 抑 制 实 验 性 大 肠 癌 生 长 并 诱 导 其 凋 亡 [7]，在 体 内 外 对 S180 荷 瘤 小鼠有明显抑瘤作用[8]，增强小鼠腹腔巨噬细胞的IL-1、 IL-6、IL-12、IL-18、TNF-α的mRNA表 达 ，从 而 被 激 活的巨噬细胞抑瘤活性增强[9-12] 。 此外,2008年聂晶等 人又证明了WPG能刺激脐血来源的树状IL-2的分泌[13]。 WPG的提取现多采用Sekine建立的 提 取 方 法 ，其 因 过 程复杂仅适用于实验室阶段。 本实验所建立的提取
为 了 保 证 TCA 能 有 最 佳 的 作 用 效 果 ， 在 50℃ 下 将 TCA的作用质量分数依次调整为5%，8%，10%，15%，结 果如图2所示。
图2 不同TCA质量分数对提取肽聚糖的影响 由图2可以看出， 随着TCA质量分数的增加磷含 量提取率也逐渐增加。 当TCA质量分数≥8%时，磷质 量浓度提取率变化趋势变缓。 由于TCA水溶液呈强酸 性，显微镜下观察15%的TCA作用菌体30 min后，菌体 已无完整形态；而质量分数为10%的TCA作用24 h后仍 然保持形态完整。 因此，选用TCA的质量分数为10%。 2.3 TCA作用不同温度及时间对提取肽聚糖的影响 将 质 量 分 数 为 10% 的 TCA 分 别 于 4，30，50，70 ℃ 下 作 用1，2，3，4，5，6，7，8 h， 观 察 其 磷 质 量 浓 度 的 变 化。 图3为质量分数10%为TCA在不同温度及时间下对 提取肽聚糖的影响。
C温 度 /℃ 55 60 65
D 时 间 /h 6 12 24
按设计点取样,立即离心（10 000 g，20 min，4 ℃），
将清 液 移 至 另 一 10 mL 离 心 管 中 ， 用 于 游 离 氨 基 氮
的 检 测 。 沉 淀 加 灭 菌 水 5mL,离 心 （10 000 g,20 min，
13 Vol.37，No.4 2009(total 221)
研究报告 Research Papers
因素 实验1 实验2 实验3 实验4 实验5 实验6 实验7 实验8 实验9 均值1 均值2 均值3 极差
表2 酶解条件的筛选
种类 浓度/NFU 温度/℃ 时间/h
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图4 最佳酶解条件对提取肽聚糖的影响
由图4可以看出，胰酶+碱性蛋白酶的作用效果最 好，且明显高于单独胰酶或者胰酶+核酶的混酶作用， 而酶的添加量对本实验的影响不大。 碱性蛋白酶是经 细 菌 原 生 质 体 诱 变 方 法 造 育 的 2709枯 草 杆 微 生 物 通 过深层发酵、 提取及精制而成的一种蛋白水解酶，它 能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强 的分解蛋白质的能力。 在工业上已被较为广泛的应 用。 胰酶+核酶的效果与胰酶单独作用的效果基本相 同，主要是由于肽聚糖中的核酸微量。
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中国乳品工业
dairyINDUSTRY
CHINA
完整肽聚糖提取工艺的研究
付艳茹，靳烨
（内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，呼和浩特 010018）
摘 要： 通过对婴儿双岐杆菌完整肽聚糖提取机理的研究，确定其工艺路线。 结果表明，采用质量分数为10%的TCA对婴儿双歧杆菌菌
（4）最佳酶的筛选。 每组沉淀加磷酸盐缓冲液 充 分 混 匀 后 ， 离 心 （8 000 g，20 min，4℃ ）， 弃 上 清 ， 加 入 相应的含酶缓冲液，具体方法如表1所示。
表1 酶解条件的筛选
水平
A种类
1
胰酶
2 胰酶+碱性蛋白酶
3
胰酶+核酶
B 浓 度 （U ） 2000 3000 4000
收 稿 日 期 ：2008-12-10 基 金 项 目 ：内 蒙 古 自 治 区 乳 业 重 大 科 技 专 项 （20050201 ）。 作者简介：付艳茹（1964-），女，高级工程师，研究方向为畜产品安全生产。 通讯作者：靳烨
12 2009 年第 37 卷第 4 期（总第 221 期）
WPG方法 步 骤 简 单 、周 期 短 ，为 工 业 化 生 产 奠 定 了 一 定的理论基础。
1实验
1.1 材料 婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis 6069)。 三 氯 乙 酸 （TCA）， 磷 酸 二 氢 钾 ， 钼 酸 铵 ， 抗 坏 血
酸，甲醛，无水硫酸钠，硫酸铜，硼酸，硫酸（均为分析 纯）。 胰酶，碱性蛋白酶，DNase。 1.2 设备
分 光 光 度 计 (DU 800) ； 离 心 机 (J2-HS 型 ) ； 透 射 电镜（JEM-1400）。 1.3 方法
4 ℃），清洗3次，分置1.5mL离心管中编号冻存，用于电
镜检测。
1.4 完整肽聚糖提取工艺流程
从生产车间取一定数量的菌泥 ，经TCA方法除去
细胞壁中的磷壁酸；再用氯仿、甲醇等混合液脱去细
胞膜脂类物质； 最后用胰酶+碱性蛋白酶分解细胞内
容物。 将残留物质离心后弃去上清液，沉淀物经多次
清洗后冻干，最后对产物进行形态和成分鉴定确定其
图1 脱脂和TCA顺序对提取肽聚糖的影响
Research Papers 研究报告
由图1可以看出， 先TCA后脱脂的顺序提取效果 较 好 ， 其 磷 壁 酸 的 提 取 率 比 先 脱 脂 后 TCA 的 高 10.5% ， 而且后脱脂所用的有机试剂也较少。 因此，确定顺序 为 先TCA 作 用 后 脱 脂 。 2.2 不同TCA质量分数对提取肽聚糖的影响