分离人外周血造血干细胞的实验记录

分离人外周血造血干细胞的实验记录

一、分离方法说明及图例

A.Ⅰ.取新鲜抗凝血液或脐带血与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-

TBD550）按1:1比例混合，

37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；

Ⅱ.取新鲜抗凝骨髓，加入一份细胞洗涤液（Cat#：2010X1118），混匀后以400g（约1500转/分）离心5分钟，弃去上清。沉淀与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）

按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反

应10分钟）；

B.加入为步骤A中所得混合液1/2体积的全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）混匀20℃

-30℃自然沉降20-30分钟，吸取上清备用；

C.向步骤B中所得上清液中加入为其一倍以上体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）混

匀，以500g（约1800转/分）离心15分钟（半径15cm水平转子），弃去上清保留沉淀细胞；

D.向细胞沉淀中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）调整细胞浓度为2×108—

1×109个/ml，小心叠加于细胞分离液（本实验采用的是天津灏洋TBD实验室的分离液）之液面上（混合液：分离液=2:1）；

E.以400g（约1500转/分）离心20分钟（半径15cm水平转子）；

第三层；为透明分离液层。第四层；为极少数红细胞层。收集第二层细胞放入约为其5-

10倍体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）中，充分混匀后以500g（约1800转/分）离心1 5分钟。沉淀经反复洗涤2次既得所需干细胞。

F.为获得纯度更高的干细胞，在步骤E中离心完成后可吸取第二层干细胞层再与羟乙基淀

粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混匀，20℃-30℃自然沉降20-

30分钟，收集上清加入细胞洗涤液500g（约1800转/分）离心15分钟。沉淀经反复洗涤2次既得较高纯度干细胞。（用户可根据实际需要重复此操作步骤）

注：A.

本方法提取率大于80%，所提细胞不分化不转化，对人体无害，可用于生物治疗、细胞培养及分子生物学实验等。

二、注意事项

1、本分离液未启封前是否18℃-

25℃避光保存，是否在两年有效期内。如使用启封后的分离液，需要关注是否需要放置于4℃保存避免微生物污染，有效期为一周。如分离液未启封前置于10℃

以下出现了白色结晶，则会影响分离效果。

2、取新鲜的血液样本，不经过冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在20℃水浴箱中复温20分钟保证分离液和所分离样本温度在20℃±2℃时分离效果最好，且所有操作过程一定要在无菌条件下进行。

3．

因为各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，所以实验室可以调节离心转数，调节离心的时间，摸索最佳的分离条件。

4．最好使用无静电反应的离心管，推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。

5、分离液性能指标：pH为7.0-7.5（人体体液ph范围）、渗透压280-340mOsmol/kg、内毒素≤0.5EU/ml、无菌直接接种培养14天后培养基澄清、澄明度及不溶性颗粒物每50ml溶液中含10μm以上的不溶性微粒20粒以下，含25μm以上的不溶性微粒5粒以下。这些因素影响获得的细胞是否保持完好的生物活性和完整的细胞形态，可作实验结果分析

讨论用。