十字花科蔬菜黑斑病菌PCR检测方法研究
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琼脂 （ ２ ０ ． ０ ｇ ） ， 蒸馏 水 （ １ Ｌ ） 。 Ｃ Ｓ培 养基 ： 硝 酸钠 ３ ｇ ， 磷 酸氢 二钾 （ １ ｇ ） ， 硫 酸 镁
病 害发 生 ， 西南 、 华 北 地 区 近 年来 为 害呈 上 升 趋 势 ， 南
方秋 季 多雨 季 节发 病 最 为 严 重 ， 一 般 发 病 年份 可 减 产
Ｙ Ｕ Ｎ Ｘ ｉ ａ ｏ ｍｉ ｎ ， Ｓ ＯＮ Ｇ Ｇ ｅ ，Ｌ Ｏ Ｂ ａ ｏ ｃ ｈ ｕ ｎ ， Ｊ Ｉ Ａ Ｎ Ｇ Ｘ ｉ ａ ｏ ｃ ｈ ｕ ｎ
摘 要 ： 为 建 立 十 字花 科 蔬 菜 黑 斑 病 菌 分 子 检 测 鉴 定 技 术 ， 以
视 。Ｂ ａ ｓ ｓ ｉ ｍｂ ａ ， Ｄ ． Ｄ ． Ｍ 首 次 报道 萝 卜中 的黑斑 病 是 由 萝 卜链格 孢菌 引起 ， 并 同 时进 行 了 Ｐ Ｃ Ｒ 鉴 定研 究 ［ １ 。 但 有 关从 种子 （ 苗） 上分 离 和富集 ３种 链格 孢菌 所适 宜 的 培养基 ， 以及 不 同菌 株特 异 Ｐ Ｃ Ｒ检测 方 法还需 要 进
１ ． １ ． ２ 培 养基
果 幼苗 感染 本 菌后 ， 即使 苗期 不产 生 明显 的病 症 ， 但 种
子 带菌 可在 植 株上 增 殖 或 群集 ， 致 生 长 后期 或采 种 株 爆发 严 重 的危 害 。全 国各大 白菜 产 区均有 不 同程度 的
参 照文献 ［ ２ ］ 方法 ， 选择 了以下 ８种培 养基 。 ｍｏ ｄ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ Ｓ Ｄ Ａ 培养 基 ： 葡萄糖 （ ２ ０ ． ０ ｇ ） ， 蛋 白 胨 （ １ ０ ． ０ ｇ ） ， 琼脂（ ２ ０ ． ０ ｇ ） ， 蒸 馏水 （ １ Ｌ ） 。 Ｐ ＤＡ培 养 基 ： 马铃薯（ ２ ０ ０ ． ０ ｇ ） ， 葡萄糖（ ２ ０ ． ０ ｇ ） ，
一
黑 斑 病 茵 ３个种 芸 薹 链 格 孢 （ Ａｌ ｔ ｅ ｒ ｎ ａ ｒ ｉ ａ ． ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ａ ｅ ） ， 甘 蓝 链 格 孢（ Ａ． ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ｉ ｃ ｏ ｌ ａ ） 和萝 链格 孢 （ Ａ． ｒ ａ ｐ ｈ ａ ｎ ｉ ） 为 实验对 象 ， 筛
Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｆ ｏ ｒ ＰＣＲ Ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏｎ Ｍｅ ｔ ｈｏ ｄ ｏ ｆ ｔ ｈｅ Ｐａ ｔ ｈｏ ｇ ｅ ｎｓ Ｃａ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ Ｂｌ ａ ｃ ｋ
Ｌｅ ａ ｆ Ｓ ｐ ｏ ｔ ｏ ｆ Ｃｒ ｕ ｃ ｉ ｆ ｅ ｒ ａ ｅ Ｖｅ ｇ ｅ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｓ
黑 斑病 是 十 字 花 科 蔬 菜 作 物 的 一 种 主要 种 传 病 害， 带 菌种子 发 芽后 会 引发猝 倒病 ， 造 成幼 苗猝 倒 。如
株分 别为 ｃ ｏ ｌ ａ １和 ｃ ｏ ｌ ａ ２ ； 萝 卜 链 格 孢菌 ２个 菌 株 分
别为 ｒ ａ ｐ １ 、 ｒ ａ ｐ ２ 。
问 题 探 讨
云 晓敏 等 ： 十 字 花 科 蔬 菜黑 斑 病 菌 Ｐ Ｃ Ｒ 检 测 方 法 研 究
・
问题探 讨 ・
十字花科蔬 菜黑斑病菌 Ｐ Ｃ Ｒ检 测 方 法 研 究
云晓敏 。 宋 歌， 律 宝春 。 蒋晓 春
（ 北 京市 种子 管 理站 ， 北京 １ Ｏ Ｏ Ｏ ８ ８ ）
Ｐ Ｃ Ｒ检测方 法进行 了初 步研究 ， 探索 建立简便 、 准确、 高
效 的十字花科蔬菜 黑斑病 菌种子 （ 苗） 健康 检测技术 。
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 供 试 材 料
关键词 ： 芸 薹链 格 孢 菌 ；甘 蓝 链 格 孢 菌 ；萝 卜 链格孢菌 ； 培 养 基 ；引 物 ； Ｐ Ｃ Ｒ 检 测 方 法
文 献标 志码 ： Ａ
文章编号 ： １ ０ ０卜４ ７ ０ ５ （ ２ ０ １ ５ ） １ ０ － ０ ０ ６ ５ — ０ ４
农 业 大学种 子健 康 中心 提 供 ， 其 中芸 薹 链 格孢 菌 ３个 菌株 分别 为 ｃ ａ ｅ １ 、 ｃ ａ ｅ ２和 ｃ ａ ｅ ３ ； 甘蓝 链格 孢 菌 ２个 菌
１ Ｏ ～２ Ｏ ， 发病 严重的年份可减产 ３ ０ ９ ／ ６ ～４ ０ ， 所 以在 进行 种子 调运 、 播 种 前 进 行 种 子 健 康 检 测 和 预警
显 得尤 为 重要 。 十字 花科 黑斑 病病 原 菌主要 是 半知 菌亚 门丝 孢纲
（ Ｍｇ Ｓ Ｏ４・ ７ Ｈ ２ ０） （ ０ ． ５ ｇ ） ， 氯化钾 （ ｏ ． ５ ｇ ） ， 硫 酸 亚 铁
的富集 培 养 ； 引物 Ｂ ２和 ｓ １ 可 分 别 对 Ａ． ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ｉ ｃ ｏ ｌ ａ 和 Ａ． ｒ ａ ｐ ｈ ａ ｎ ｉ 菌种 进 行 特 异 性 鉴 定 ， 而 Ａ． ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ａ ｅ特 异 性 鉴 定 还
需 进 一 步研 究确 定 。
选 适宜其生长的 富集培养基 ； 依 据 文 献 报 导 和 ３个 种 Ｄ ＮＡ 的
Ｉ ＴＳ序 列 共 设 计 合 成 ７对 特 异 性 引物 ， 利用 Ｐ ＣＲ检 测 方 法 进 行
百度文库
鉴 定。结果显示 ， Ｐ Ｄ Ａ和 Ｃ ＭＡ 均 适 合 十 字 花 科 蔬 菜 黑斑 病 菌
步研究 。本 试 验 针 对 ３种 链 格 孢 菌 培 养 基 筛 选 及
Ｄ０Ｉ 编码 ： １ ０ ． １ ６ ５ ９ ０ ／ ｊ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． １ ０ ０ １ — ４ ７ ０ ５ ． ２ ０ １ ５ ． １ ０ ． ６ ５
１ ． １ ． １ 供 试 菌株 十字花 科蔬 菜 黑斑 病菌 ３个 种共 ７个 菌株 由 中国
中图分类号 ： Ｓ ４ １ — ３ ０
病 害发 生 ， 西南 、 华 北 地 区 近 年来 为 害呈 上 升 趋 势 ， 南
方秋 季 多雨 季 节发 病 最 为 严 重 ， 一 般 发 病 年份 可 减 产
Ｙ Ｕ Ｎ Ｘ ｉ ａ ｏ ｍｉ ｎ ， Ｓ ＯＮ Ｇ Ｇ ｅ ，Ｌ Ｏ Ｂ ａ ｏ ｃ ｈ ｕ ｎ ， Ｊ Ｉ Ａ Ｎ Ｇ Ｘ ｉ ａ ｏ ｃ ｈ ｕ ｎ
摘 要 ： 为 建 立 十 字花 科 蔬 菜 黑 斑 病 菌 分 子 检 测 鉴 定 技 术 ， 以
视 。Ｂ ａ ｓ ｓ ｉ ｍｂ ａ ， Ｄ ． Ｄ ． Ｍ 首 次 报道 萝 卜中 的黑斑 病 是 由 萝 卜链格 孢菌 引起 ， 并 同 时进 行 了 Ｐ Ｃ Ｒ 鉴 定研 究 ［ １ 。 但 有 关从 种子 （ 苗） 上分 离 和富集 ３种 链格 孢菌 所适 宜 的 培养基 ， 以及 不 同菌 株特 异 Ｐ Ｃ Ｒ检测 方 法还需 要 进
１ ． １ ． ２ 培 养基
果 幼苗 感染 本 菌后 ， 即使 苗期 不产 生 明显 的病 症 ， 但 种
子 带菌 可在 植 株上 增 殖 或 群集 ， 致 生 长 后期 或采 种 株 爆发 严 重 的危 害 。全 国各大 白菜 产 区均有 不 同程度 的
参 照文献 ［ ２ ］ 方法 ， 选择 了以下 ８种培 养基 。 ｍｏ ｄ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ Ｓ Ｄ Ａ 培养 基 ： 葡萄糖 （ ２ ０ ． ０ ｇ ） ， 蛋 白 胨 （ １ ０ ． ０ ｇ ） ， 琼脂（ ２ ０ ． ０ ｇ ） ， 蒸 馏水 （ １ Ｌ ） 。 Ｐ ＤＡ培 养 基 ： 马铃薯（ ２ ０ ０ ． ０ ｇ ） ， 葡萄糖（ ２ ０ ． ０ ｇ ） ，
一
黑 斑 病 茵 ３个种 芸 薹 链 格 孢 （ Ａｌ ｔ ｅ ｒ ｎ ａ ｒ ｉ ａ ． ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ａ ｅ ） ， 甘 蓝 链 格 孢（ Ａ． ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ｉ ｃ ｏ ｌ ａ ） 和萝 链格 孢 （ Ａ． ｒ ａ ｐ ｈ ａ ｎ ｉ ） 为 实验对 象 ， 筛
Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｆ ｏ ｒ ＰＣＲ Ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏｎ Ｍｅ ｔ ｈｏ ｄ ｏ ｆ ｔ ｈｅ Ｐａ ｔ ｈｏ ｇ ｅ ｎｓ Ｃａ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ Ｂｌ ａ ｃ ｋ
Ｌｅ ａ ｆ Ｓ ｐ ｏ ｔ ｏ ｆ Ｃｒ ｕ ｃ ｉ ｆ ｅ ｒ ａ ｅ Ｖｅ ｇ ｅ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｓ
黑 斑病 是 十 字 花 科 蔬 菜 作 物 的 一 种 主要 种 传 病 害， 带 菌种子 发 芽后 会 引发猝 倒病 ， 造 成幼 苗猝 倒 。如
株分 别为 ｃ ｏ ｌ ａ １和 ｃ ｏ ｌ ａ ２ ； 萝 卜 链 格 孢菌 ２个 菌 株 分
别为 ｒ ａ ｐ １ 、 ｒ ａ ｐ ２ 。
问 题 探 讨
云 晓敏 等 ： 十 字 花 科 蔬 菜黑 斑 病 菌 Ｐ Ｃ Ｒ 检 测 方 法 研 究
・
问题探 讨 ・
十字花科蔬 菜黑斑病菌 Ｐ Ｃ Ｒ检 测 方 法 研 究
云晓敏 。 宋 歌， 律 宝春 。 蒋晓 春
（ 北 京市 种子 管 理站 ， 北京 １ Ｏ Ｏ Ｏ ８ ８ ）
Ｐ Ｃ Ｒ检测方 法进行 了初 步研究 ， 探索 建立简便 、 准确、 高
效 的十字花科蔬菜 黑斑病 菌种子 （ 苗） 健康 检测技术 。
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 供 试 材 料
关键词 ： 芸 薹链 格 孢 菌 ；甘 蓝 链 格 孢 菌 ；萝 卜 链格孢菌 ； 培 养 基 ；引 物 ； Ｐ Ｃ Ｒ 检 测 方 法
文 献标 志码 ： Ａ
文章编号 ： １ ０ ０卜４ ７ ０ ５ （ ２ ０ １ ５ ） １ ０ － ０ ０ ６ ５ — ０ ４
农 业 大学种 子健 康 中心 提 供 ， 其 中芸 薹 链 格孢 菌 ３个 菌株 分别 为 ｃ ａ ｅ １ 、 ｃ ａ ｅ ２和 ｃ ａ ｅ ３ ； 甘蓝 链格 孢 菌 ２个 菌
１ Ｏ ～２ Ｏ ， 发病 严重的年份可减产 ３ ０ ９ ／ ６ ～４ ０ ， 所 以在 进行 种子 调运 、 播 种 前 进 行 种 子 健 康 检 测 和 预警
显 得尤 为 重要 。 十字 花科 黑斑 病病 原 菌主要 是 半知 菌亚 门丝 孢纲
（ Ｍｇ Ｓ Ｏ４・ ７ Ｈ ２ ０） （ ０ ． ５ ｇ ） ， 氯化钾 （ ｏ ． ５ ｇ ） ， 硫 酸 亚 铁
的富集 培 养 ； 引物 Ｂ ２和 ｓ １ 可 分 别 对 Ａ． ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ｉ ｃ ｏ ｌ ａ 和 Ａ． ｒ ａ ｐ ｈ ａ ｎ ｉ 菌种 进 行 特 异 性 鉴 定 ， 而 Ａ． ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ａ ｅ特 异 性 鉴 定 还
需 进 一 步研 究确 定 。
选 适宜其生长的 富集培养基 ； 依 据 文 献 报 导 和 ３个 种 Ｄ ＮＡ 的
Ｉ ＴＳ序 列 共 设 计 合 成 ７对 特 异 性 引物 ， 利用 Ｐ ＣＲ检 测 方 法 进 行
百度文库
鉴 定。结果显示 ， Ｐ Ｄ Ａ和 Ｃ ＭＡ 均 适 合 十 字 花 科 蔬 菜 黑斑 病 菌
步研究 。本 试 验 针 对 ３种 链 格 孢 菌 培 养 基 筛 选 及
Ｄ０Ｉ 编码 ： １ ０ ． １ ６ ５ ９ ０ ／ ｊ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． １ ０ ０ １ — ４ ７ ０ ５ ． ２ ０ １ ５ ． １ ０ ． ６ ５
１ ． １ ． １ 供 试 菌株 十字花 科蔬 菜 黑斑 病菌 ３个 种共 ７个 菌株 由 中国
中图分类号 ： Ｓ ４ １ — ３ ０