十字花科蔬菜黑斑病菌PCR检测方法研究
十字花科植物中黑芥子酶的研究进展
十字花科植物中黑芥子酶的研究进展孙艳伟;张泽生;王田心;李雨蒙;秦程广【摘要】Myrosinase exists in cruciferous plants extensively and it catalyses the hydrolysis of glucosinolates. The myrosinase-mediated breakdown products of glucosinolates have been considered as promising compounds for fighting cancer, which has attracted much attention. In this review, myrosinase was firstly overviewed, in-cluding its distribution, structure, activity and so on. Then an introduction was made on the methods of myrosi-nase extraction and myrosinase activity array, followed by outlooks of its application and future direction in the research.%黑芥子酶是一种存在于十字花科植物中用以水解硫代葡萄糖苷的酶,且水解产物因具有抗癌作用而受到广泛关注.对黑芥子酶的分布、结构及活性等方面进行了概述,着重介绍了十字花科植物中黑芥子酶的提取及活性测定方法,并简述了黑芥子酶的应用.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)011【总页数】5页(P216-220)【关键词】十字花科植物;黑芥子酶;硫代葡萄糖苷;研究进展【作者】孙艳伟;张泽生;王田心;李雨蒙;秦程广【作者单位】天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全教育部重点实验室,天津 300457;天津食品安全低碳制造协同创新中心,天津 300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全教育部重点实验室,天津 300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457【正文语种】中文随着人们生活水平的提高，居民膳食结构中高糖、高脂食品摄入逐渐增多，过多的能量摄入可能导致癌症、动脉硬化等慢性病的发生，因此近年来防癌抗癌及慢性病防治一直是医学界及营养界的研究热点。
PCR技术在植物检疫性病害鉴定中的应用
1、样品采集：选择具有典型症状的病害样本进行采集，并做好记录。
2、DNA提取：将采集的病害样本进行处理，去除蛋白质等杂质，提取出其中 的DNA。
3、引物设计：根据已知的病害基因序列，设计出特异性的引物。
4、PCR扩增：将DNA模板、引物、dNTP等反应液加入PCR反应管中，进行PCR 扩增。
5、产物检测：对PCR扩增后的产物进行电泳分析或荧光检测，观察是否有特 异性条带或荧光信号。
3、植物生物安全监测：qPCR技术可以用于植物生物安全监测，如监测外来 入侵植物的扩散情况和评估植物种质资源的遗传多样性。
然而，qPCR技术在植物检疫中的应用也存在一些不足，如对设备要求较高、 对实验条件和操作技能的要求严格，以及可能出现的假阳性和假阴性结果等问题。 因此，需要进一步改进和完善qPCR技术，以提高其准确性和可靠性。
PCR技术在植物检疫性病害鉴定中 的应用
目录
01
一、PCR技术在植物 检疫性病害鉴定中的 应用前沿研究
03 四、PCR技术在植物 检疫性病害鉴定中的 应用案例及评价
二、PCR技术在植物
02 检疫性病害鉴定中的 原理和流程
04 参考内容
植物检疫性病害是指对农业生产和植物生态环境造成严重危害的植物病害， 其鉴定与防治对保障农业生产和生态安全具有重要意义。近年来，随着分子生物 学技术的迅速发展，聚合酶链式反应（PCR）技术在植物检疫性病害鉴定中得到 了广泛应用。本次演示将从PCR技术在植物检疫性病害鉴定中的应用前沿研究、 原理和流程、实验方法和结果分析以及应用案例及评价等方面进物检疫中的应用实践
1、植物病原物检测：qPCR技术可以快速、准确地检测植物病原物，如病毒、 细菌、真菌等。例如，针对水稻矮缩病毒的qPCR检测方法，可以实现对病毒的特 异性识别和定量检测。
黑龙江省大白菜黑腐病病原菌的分离与鉴定
中国瓜菜2021，34（7）：20-24收稿日期：2020-08-07；修回日期：2020-12-09基金项目：黑龙江省博士后资助经费（LBH-Z18266）；黑龙江省农业科学院院级项目（2017JS11）；黑龙江省“百千万”工程科技重大专项（2019ZX16B02-4）；黑龙江省农业科学院引进博士人员科研启动金项目作者简介：孟雪娇，女，助理研究员，研究方向为蔬菜抗性育种与栽培。
E-mail ：xuejiao0116@ 通信作者：陈立新，男，研究员，研究方向为设施园艺。
E-mail ：983861845@黑腐病主要危害十字花科蔬菜叶片、叶球和球茎，十字花科蔬菜黑腐病是由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种[Xanthomonas campestris pv.campestris （Pam.）Dowson]引起的世界性的重要病害之一[1]。
黑腐病的寄主范围相当广泛，主要危害甘蓝[2-4]、结球白菜[3，5]、不结球白菜[3，5]等。
大白菜幼苗期即可发病，但以成株发病为主。
由于气候条件变化、多茬栽培和国外春大白菜品种的引进，黑腐病对蔬菜生产的威胁日趋扩大。
20世纪80年代全国各地已经普遍流行，北起黑龙江、南至海南岛均有分布，大白菜的产量受到很大损失，且品质受到很大影响[6-8]。
因此，黑腐病不仅是世界、也是我国大白菜的主要病害之一[9]。
国内对黑腐病菌的研究主要有：芦燕[8]对陕西省大白菜黑腐病病原菌及抗病性进行鉴定；解永梅等[10-11]对山东省大白菜黑腐病的研究，分别在细胞和分子水平上完成了山东省地区的病原菌鉴定，完善了相对应的抗病性鉴定方法研究，证明了存在致黑龙江省大白菜黑腐病病原菌的分离与鉴定孟雪娇1,2，史庆馨2，许春梅2，冯一新2，高永利2，沙春艳2，陈立新2（1．黑龙江省农业科学院博士后科研工作站哈尔滨150086；2．黑龙江省农业科学院园艺分院哈尔滨150069）摘要：十字花科蔬菜黑腐病是由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种引起的世界性的重要病害之一。
白菜类、甘蓝类黑斑病的发生与防治
白菜类、甘蓝类黑斑病的发生与防治十字花科蔬菜黑斑病在国内发生普遍，自20世纪70年代以来呈发展趋势。
大白菜黑斑病在一些年份曾在云南、贵州、东北及华北造成减产。
该病仅为害十字花科蔬菜，以白菜、甘蓝及花椰菜发生较多。
除病害严重时造成减产外，叶球、花球外观受污损后品质降低，种株染病不仅影响种子产量，并可使种子带菌，而白菜受害则叶片变苦，影响食用。
1症状识别白菜类蔬菜黑斑病主要为害叶片，多发生在外叶或外层叶球上，子叶、叶柄、花梗和种荚也可被害。
子叶发病初生褐色小斑点，逐渐褪绿，扩展整片子叶后干枯，严重时造成死苗。
叶片染病初为近圆形褪绿斑，后为直径2～10mm、具明显同心轮纹的灰褐至暗褐色近圆形的病斑，有或无黄色晕环。
干燥时病斑变薄，有时破裂或穿孔，潮湿时生微细的褐色、暗褐色或黑色霉层。
发病严重时病斑连成不规则的大斑块，致半叶或整叶枯死，甚至叶片由外向内干枯，造成叶球裸露。
叶柄上病斑长梭形或纵条状，暗褐色凹陷，病重时叶柄腐烂、脱帮。
留种株叶片上病斑有时微紫色，其他症状同上述。
花梗和种荚上病斑椭圆形，暗褐色至黑色，与霜霉病的病状相似，而在湿度大时生黑褐色霉层，有别于霜霉病。
留种株发病严重时叶片枯死，茎上密布病斑，种荚瘦小，种子干瘪。
病菌亦可随大白菜入窖继续为害，引起叶帮腐烂。
甘蓝类蔬菜上的症状，基本上与白菜类相似，但病斑较大、略凹陷，直径5～30mm，有黄色晕环，同心轮纹不明显，病斑上产生轮纹状分布的黑褐色霉，霉比白菜上的多且明显。
2病原菌白菜类黑斑病主要由芸薹链格孢侵染引起，甘蓝类黑斑病主要由甘蓝链格孢，异名A.oleracea侵染引起。
病部着生的微细的褐色至黑色霉层即病原菌的分生孢子梗和分生孢子。
有报道称，在白菜上虽两种病菌都能引起发病，但并非同时为害。
在全国不同地区、不同季节，出现的病原种类不同。
北京7～8月以甘蓝链格孢为主，到9月芸薹链格孢逐渐多起来。
陕西关中9月中旬前也以甘蓝链格孢为主，以后芸薹链格孢才多起来。
十字花科黑腐病菌一个致病相关基因的鉴定
第34卷增刊广西大学学报：自然科学版V01．34，Sup．2009年7月Journal of G u a n g x i U n iv er s it y：Na t Sci E d July 2009文章编号：1001—7445(2009)增一0358-07十字花科黑腐病菌一个致病相关基因的鉴定何勇强1，赵露金1，陈博雯1，孙伟1，张穗生2，刘丹1，王兵1，唐纪良1(1．广西大学生命科学与技术学院，广西南宁53000412．广西科学院，广西南宁530003) 摘要：十字花科黑腐病菌(Xanthomo nas c a m pe s t ri s pv．c ampestris，简称Xcc)8004菌株的一个转座子插入突变体186807，其Tn59usA5插入位点位于一个推测的双组分调控系统的感受蛋白基因XC2229中。
该突变体对寄主植物满身红萝卜的致病力显著降低。
为了进一步证实XC2229基因与该菌致病力之间的相关性，本工作构建了该基因的缺失突变体DM2229。
DM2229与186807在寄主上的致病力基本一致，均显著低于野生型Xcc 8004。
生化及表型检测结果表明，DM2229的胞外多糖(exopolysac charides，EPS)产量降低t细胞运动能力减弱。
用带有完整XC2229基因的pLALR6互丰bDM2229，互补菌株CDM2229在EPS合成、细胞运动能力以及致病力方面与野生型X c c8004基本一致。
这些实验结果表明．XC2229是一个与EPS合成、细菌运动相关的基因．推测该基因通过调控EPS的生成和运动能力而影响Xcc的致病力。
关键词：十字花科黑腐病菌；突变体；致病力；感受蛋白基因；胞外多糖；运动能力中围分类号：Q754 文献标识码：AIden tif ica tio n of a virulence gene of X an t h o m o n a s campe strispv．c am pe str isH E Yong—qian91，ZHAO Lu—jinl，CHEN Bo—wenl，SUN Weil，Z H A N G Sui—shen92，LIU Danl，WANG Bin91，TANG Ji—li an91(1．C o l le g e of Life S ci e n ce and Te ch no log y，G ua ngx i U ni ve rs ity，Na nni ng530004，Chi na2．G u an g xi A c a d e m y of S ci en ce s，Na nn in g 530003，C hin a)Abstrac t：A t r a n s p o s o n mut an t186807of X an t h om o n as c a m p es t H s pv．campestris(here after，Xcc)h as a Tn59us A5i n s er t e d in the c od in g seque nce(C DS)of XC2229，w hi c h showed a s i g n if i c a n t r e d u c t i o n in v i r u l e n ce o n the hos t pl an t C hi ne s e r ad is h Manshenhong．The ded uc ed pr od uct of XC2229is a putative s e n s o r of a two c om po ne nt re gu la to ry system．To conf irm the in vo lv e me nt of X C2229in v i r ul e n c e of Xc c，t h e d e l e t i o n mutant of X C2229gene，DM2229，was ge ne ra te d b y u sin g the pK l8mo b v e c t o r system．Th e r e su l t s of plant a s s a y 。
白菜黑斑病防治和治疗手法
白菜黑斑病防治和治疗手法1. 概述白菜黑斑病（Alternaria brassicicola）是一种常见的真菌病害，主要发生在十字花科蔬菜中的白菜上。
在高湿度和高温的环境条件下，该病害易于发生并扩散，导致白菜的叶片上出现大面积的黑色斑点。
严重感染的白菜叶片会黄化、干枯，严重影响品质和产量。
因此，防治和治疗白菜黑斑病对于保障蔬菜生产是非常重要的。
本文将介绍白菜黑斑病的防治和治疗手法，帮助农民和种植者有效应对该病害。
2. 防治手法2.1 增强白菜的抗病能力要防治白菜黑斑病，首先应增强白菜本身的抗病能力。
以下几个方法可用于提高白菜的整体健康状况：•选择抗病品种：选择抗白菜黑斑病的品种进行种植。
抗病品种相对较为抗性，可以减少患病的风险。
•均衡施肥：合理施肥，提供足够的营养物质，使白菜生长壮实，增强其抵抗病害的能力。
•适宜的生长环境：维持适宜的生长环境温度和湿度，避免过度湿润和高温的条件，减少病菌生长的机会。
2.2 预防病害的传播白菜黑斑病的传播主要通过病原菌的种子传播、土壤传播和空气传播。
以下是预防病害传播的几种方法：•健康种子：使用健康的种子，避免使用感染了病原菌的种子，可以减少病害的传播。
•病害轮作：采用病害轮作的种植方式，将白菜与其他作物轮作，减少病菌在土壤中的积累。
•留茬处理：及时处理感染了黑斑病的茬口，避免病菌通过残留物传播到下一季作物。
2.3 生物防治生物防治是一种环保、无公害的防治方法，通过引入天敌来控制病害的发生和传播。
以下是几种常用的生物防治方法：•灰飞虱：灰飞虱是一种吸食白菜黑斑病菌的昆虫，可以有效控制病害的发生。
可以通过引入灰飞虱来进行生物防治。
•茵虎：茵虎是一种对黑斑病菌具有天敌效应的土壤线虫，可以用来控制黑斑病的发生。
2.4 化学防治化学防治是一种快速有效的防治方法，但也需要谨慎使用。
以下是几种常用的化学防治方法：•选择合适的杀菌剂：选择对白菜黑斑病有效的杀菌剂，且使用前要确保杀菌剂对细菌的抑制作用，并严格按照使用说明进行施用。
白菜黑斑病病斑潜育显症及扩展的初步定量研究
北方园艺２ （ ） ： ０ １ ３ ０ ５ １ ２ ３ １ ２ ５ ～
·植物保护·
白菜黑斑病病斑潜育显症及扩展的初步定量研究
２ ３ ４ ，屈 直１，刘 影２， ，李 丹２，高 东 梅２，杨 信 东２， 马 海 霞１，
（ ； ； 中国热带农业科学院 热带生物技术研究所 ， 海南 海口 ５ 吉林农业大学 农学院 ， 吉林 长春 １ １ ． ７ １ １ ０ １ ２ ． ３ ０ １ １ ８ ； ） 吉林省农业科学院 植保所 ， 吉林 公主岭 １ 吉林农业大学 发展学院 ， 吉林 长春 １ ３ ． ３ ６ １ ０ ０ ４ ． ３ ０ ６ ０ ０
］ － １ ２ ５ 。 在北方， 株残体等途径传播危害十字花科 试验材料 ； 供试白菜品种为长春地区的“ 掰帮菜” 供试菌为芸 ） 。 薹链格孢（ Ａ ｌ ｔ ｅ ｒ ｎ ａ ｒ ｉ ａ ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ａ ｅ １ ． ２ 试验方法 室内试验均在吉林农业大学农学院植物病理实验 室进行。 在室内， 盆栽 １ ． ２ ． １ 黑斑病的潜育显症 潜育期观察： 每天检查接种 ５ １ ０株 感病白菜苗用孢子悬液接种后， ～ 部位是否发病， 直到典型病斑出现为止。 从接种日开始 到显症的日数， 即为潜育期。 逐日显症率和累计显症率 观察： 在室内， 盆栽白菜苗典型病斑出现后， 每天记载白 菜苗上的病斑总数， 直到病斑总数不再增加为止， 计算 逐日显症率、 累计显症率。 逐日显症率 ＝ 调查日病斑增 ／最终病斑总数， ／最 长数 累计显症率 ＝ 调查日病斑总数 终病斑总数。温度对潜育期的影响： 在室内， 盆 栽 ５～ 、 、 分别放入 １ １ ０株感病白菜苗用孢子悬液接种后， ５ ２ ０ 、 、 每天检查接种部位是否发病， 直 ２ ５ ３ ０ ３ ５ ℃的培养箱中， 到典型病斑出现为止。从接种日开始到显症的日数 ， 即 为潜育期。 ０ ０ 个病斑， １ ． ２ ． ２ 病斑扩展 在田间标记不同长度的１ 标记后逐日测量记录病斑长度， 直至这些病斑不再扩展 为止。分析这些病斑扩展与日龄的关系。
白菜黑斑病菌生物学特性研究及黑斑病菌培养基的筛选
白菜黑斑病菌生物学特性研究及黑斑病菌培养基的筛选甘彩霞;袁伟玲;王晴芳;崔磊;梅时勇【摘要】[目的]探究白菜黑斑病菌的生物学特性.[方法]研究了不同温度、不同光源照射对白菜黑斑病菌孢子萌发的影响,测量了黑斑病菌孢子生长的菌落直径,对适合白菜黑斑病菌孢子萌发的培养基进行了筛选.[结果]通过同一种培养基PSA进行培养,8株白菜黑斑病菌株中火烧坪BHB1的产孢量最好；最适宜黑斑病菌孢子萌发的培养基是PSA培养基,PDA培养基、豆芽培养基和玉米培养基也较适合黑斑病菌孢子的萌发.白菜黑斑病菌孢子在0～35℃能够萌发,最适宜的温度是15℃.该菌在日光灯照射下产孢量显著高于紫外照射,且日光灯不宜长时间照射,紫外灯照射不利于孢子萌发.黑斑病菌菌落在第4～7天生长最快.[结论]为白菜黑斑病的抗病育种研究和防控技术提供了理论依据.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(041)019【总页数】3页(P8185-8187)【关键词】白菜;黑斑病;温度;光照;培养基【作者】甘彩霞;袁伟玲;王晴芳;崔磊;梅时勇【作者单位】湖北省农业科学院经济作物研究所,湖北武汉430070;湖北省农业科学院经济作物研究所,湖北武汉430070;湖北省农业科学院经济作物研究所,湖北武汉430070;湖北省农业科学院经济作物研究所,湖北武汉430070;湖北省农业科学院经济作物研究所,湖北武汉430070【正文语种】中文【中图分类】S634.3黑斑病(Alternaria)是十字花科蔬菜生产的世界性真菌病害，在我国局部地区为害严重，造成较大的经济损失［1－3］。
为了解白菜黑斑病菌的生物学特性，笔者研究了温度、光照及培养基等对白菜黑斑病菌的影响，以期为白菜黑斑病的抗病育种研究和防控技术提供理论依据。
1.1.1 供试菌株。
大白菜黑斑病菌株采集于湖北省农业科学院蔬菜基地和湖北省宜昌长阳火烧坪蔬菜基地，试管斜面保存于4℃冰箱中备用，共分离保存菌株8份:BHB1、BHB3、BHB4、BHB5、BHB9、BHB10、火烧坪 BHB1、火烧坪BHB3。
大白菜黑斑病室内苗期抗性鉴定方法的研究
大白菜黑斑病室内苗期抗性鉴定方法的研究摘要：为了选育大白菜（Brassica campestris L. ssp pekinensis（Lour.）Olsson）抗黑斑病（Alternaria brassicae）新品种和种质创新，在室内利用6个品种的大白菜研究了接种物浓度、苗龄和温度对大白菜黑斑病发病的影响，结果表明，在（25±1）℃光照培养室内，选择浓度为1.0×104个孢子/mL或1.0×105个孢子/mL 的黑斑病病菌孢子悬浮液喷雾接种于苗龄为3～4片真叶的大白菜幼苗，保湿24～48 h，10 d后进行病情调查，可对大白菜种质资源抗黑斑病的抗性进行正确评价。
关键词：大白菜（Brassica campestris L. ssp pekinensis （Lour.）Olsson）；黑斑病（Alternaria brassicae）；苗期；抗性鉴定Study on Resistance Identification Method for Black Spot of Chinese Cabbage at Seedling Stage in LaboratoryAbstract：In order to provide technical support for breeding new varieties and germplasm innovation of Chinese cabbage（Brassica campestris L. ssp pekinensis （Lour.）Olsson）with resistance to black spot（Alternaria brassicae），the influence of inoculation spore concentration，seedling stage and temperature on black spot occurrence was studied with six varieties. It was showed that by spraying 1.0×104 pfu/mL or 1.0×105 pfu/mL spore suspension on seedling at 3～4 leaf stage and then moisturizing for 24～48 h at （25±1）℃in door，the resistance of radish varieties on the black spot could be accurately evaluated 10 d after inoculation.Key words：Chinese cabbage（Brassica campestris L. ssp pekinensis（Lour.）Olsson）；black spot（Alternaria brassicae）；seedling stage；resistance identification 大白菜黑斑病是由链格孢属真菌所致的一种常发性病害，病原菌包括芸薹链格孢（Alternaria brassicae （Berk.）Sacc.），甘蓝链格孢（A. brassicicola）和萝卜链格孢（A. japonica）3个种，其中秋冬白菜黑斑病一般由芸薹链格孢引起，而春夏白菜黑斑病则主要由甘蓝链格孢引起，是一种世界性的重要病害，最早于1836年在甘蓝上发现，1934年开始有为害大白菜的记录[1]。
甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(４):９４７￣９５５ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ刘志刚ꎬ余方伟ꎬ张㊀伟ꎬ等.甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(４):９４７￣９５５.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０４.００４甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性刘志刚１ꎬ㊀余方伟２ꎬ㊀张㊀伟２ꎬ㊀于㊀利２ꎬ㊀李建斌２ꎬ㊀王神云２ꎬ㊀宋江华１(１.安徽农业大学园艺学院ꎬ安徽合肥２３００３６ꎻ２.江苏省农业科学院蔬菜研究所ꎬ江苏南京２１００１４)收稿日期:２０２２￣０８￣１６基金项目:江苏省重点研发计划(现代农业)项目(ＢＥ２０２１３７６)ꎻ国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目(ＣＡＲＳ￣２３￣Ｇ４２)ꎻ国家自然科学基金项目(３２２７２７２８)作者简介:刘志刚(１９９８－)ꎬ男ꎬ安徽合肥人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事甘蓝病害鉴定及种质资源筛选利用研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｌｚｇａｎｇ＠ｓｔｕ.ａｈａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ通讯作者:宋江华ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｊｈｓｏｎｇ＠ａｈａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻ王神云ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗａｎｇｓｈｅｎｙｕｎ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀对江苏省甘蓝(Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａｖａｒ.ｃａｐｉｔａｔａＬ.)叶片上发生的黑斑病进行病原菌鉴定ꎬ并测试病原菌对杀菌剂的敏感性ꎮ经形态学观察ꎬ初步明确分离得到的病原菌(ＨＢ０㊁ＨＢ１㊁ＨＢ２㊁ＨＢ３㊁ＨＢ５㊁ＨＢ６)为链格孢属真菌ꎮ基于科赫氏法则测定病原菌致病性ꎬ发现ＨＢ１㊁ＨＢ３㊁ＨＢ６能在甘蓝叶片上致病ꎮ扩增上述３个致病菌株的核糖体ＤＮＡ内转录间隔区(ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ)㊁过敏原基因(Ａｌｔａ１)㊁３￣磷酸甘油醛脱氢酶基因(ＧＡＰＤＨ)ꎬ得到大小为５１１~５９６ｂｐ目的片段ꎮ多基因联合聚类分析结果显示ꎬ引起江苏省甘蓝黑斑病的病原菌为芸薹生链格孢(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ)ꎮ室内毒力试验发现ꎬ在测试的８种杀菌剂中ꎬ苯醚甲环唑㊁咯菌腈㊁己唑醇㊁氟硅唑㊁戊唑醇㊁丙环唑㊁异菌脲对病原菌菌丝生长的抑制效果较好ꎬ代森锰锌对病原菌菌丝生长的抑制作用较弱ꎮ关键词:㊀甘蓝ꎻ黑斑病ꎻ芸薹生链格孢菌ꎻ杀菌剂中图分类号:㊀Ｓ４３６.３５㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０４￣０９４７￣０９ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｃａｕｓｉｎｇｂｌａｃｋｓｐｏｔｏｎＢｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａｖａｒ.ｃａｐｉｔａｔａＬ.ＬＩＵＺｈｉ￣ｇａｎｇ１ꎬ㊀ＹＵＦａｎｇ￣ｗｅｉ２ꎬ㊀ＺＨＡＮＧＷｅｉ２ꎬ㊀ＹＵＬｉ２ꎬ㊀ＬＩＪｉａｎ￣ｂｉｎ２ꎬ㊀ＷＡＮＧＳｈｅｎ￣ｙｕｎ２ꎬ㊀ＳＯＮＧＪｉａｎｇ￣ｈｕａ１(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨｅｆｅｉ２３００３６ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅＣｒｏｐｓꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｃａｂｂａｇｅ(Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａｖａｒ.ｃａｐｉｔａｔａＬ.)ｌｅａｖｅｓｓｈｏｗｉｎｇｂｌａｃｋｓｐｏｔｓｙｍｐｔｏｍｉｎＪｉａｎｇｓｕｐｒｏｖｉｎｃｅꎬａｎｄｉｔｓｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｗａｓｔｅｓｔｅｄ.Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｕｎ￣ｇｉ(ＨＢ０ꎬＨＢ１ꎬＨＢ２ꎬＨＢ３ꎬＨＢ６ꎬＨＢ６)ｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏＡｌｔｅｒｎａｒｉａｓｐｐ.Ｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｐａｔｈｏｇｅｎｓｗａｓｄｅｔｅｒ￣ｍｉｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＫｏｃｈ ｓｐｏｓｔｕｌａｔｅｓ.ＨＢ１ꎬＨＢ３ａｎｄＨＢ６ｗｅｒｅａｂｌｅｔｏｃａｕｓｅｄｉｓｅａｓｅｏｎｃａｂｂａｇｅｌｅａｖｅｓ.ＴｈｅｎｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒｏｆｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ(ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ)ꎬａｌｌｅｒｇｅｎｇｅｎｅ(Ａｌｔａ１)ａｎｄｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ￣３￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｇｅｎｅ(ＧＡＰＤＨ)ｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍＨＢ１ꎬＨＢ３ａｎｄＨＢ６ꎬａｎｄｔｈｅｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｉｔｈａｌｅｎｇｔｈｏｆ５１１－５９６ｂｐｗｅｒｅｏｂ￣ｔａｉｎｅｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｍｕｌｔｉ￣ｇｅｎｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｃａｕｓｉｎｇｂｌａｃｋｓｐｏｔｏｎｃａｂｂａｇｅｉｎＪｉａｎｇｓｕｐｒｏｖｉｎｃｅｗａｓＡｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ.Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬａｍｏｎｇｅｉｇｈｔｔｅｓｔｅｄｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓꎬｄｉｆｅｎｏｃｏｎａｚｏｌｅꎬｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌꎬｈｅｘａｃｏｎａｚｏｌｅꎬｆｌｕｓｉｌａｚｏｌｅꎬｔｅｂｕｃｏｎａｚｏｌｅꎬｐｒｏｐｉｃｏｎａｚｏｌｅａｎｄｉｐｒｏｄｉｏｎｅｈａｄｓｔｒｏｎｇｅｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｔｈｅｍｙｃｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｏｆｐａｔｈｏｇｅｎꎬｗｈｉｌｅｍａｎｃｏｚｅｂｈａｄｗｅａｋｅｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａｖａｒ.ｃａｐｉｔａｔａＬ.ꎻｂｌａｃｋｓｐｏｔꎻＡｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａꎻｆｕｎｇｉｃｉｄｅ㊀㊀十字花科芸薹属植物(Ｂｒａｓｓｉｃａｓｐｐ.)包含甘蓝(Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａｖａｒ.ｃａｐｉｔａｔａＬ.)㊁白菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ)和油菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ)等多种蔬菜油料作物ꎬ在全球种植的农作物中占有重要地位ꎮ２０１９年ꎬ甘蓝及其他芸薹属作物的栽培面积位列中国蔬菜种植面积前十ꎬ７４９同时该类作物的出口量达９ ８５３ˑ１０４ｔꎬ在中国蔬菜主要出口种类中位列第２[１]ꎮ江苏省是甘蓝的重要种植区之一[２]ꎬ近年来ꎬ随着甘蓝栽培面积逐渐扩大ꎬ黑斑病频频发生ꎬ成为影响甘蓝可持续生产的重要病害ꎮ十字花科作物黑斑病由链格孢属真菌(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｐｐ.)引起ꎬ可危害植物的叶片㊁茎㊁叶柄㊁角果等组织ꎮ叶面发病时ꎬ侵染部位产生水渍状小点ꎬ并逐渐形成许多肉眼可见的小黑点ꎬ后期发展成同心轮纹病斑ꎬ病斑有时穿孔[３]ꎮ世界范围内ꎬ黑斑病导致印度十字花科油料作物产量损失１５％~７１％ꎬ在加拿大ꎬ因黑斑病导致的十字花科油料作物产量损失达２０％~３０％[４]ꎮ除了导致作物减产外ꎬ链格孢属真菌还会产生７０多种真菌毒素ꎬ其中交链孢酚单甲醚(Ａｌｔｅｒｎａｒｉｏｌ９￣ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｅ￣ｔｈｅｒ)具有基因毒性㊁交链孢毒素(Ａｌｔｅｒｔｏｘｉｎ)具有致突变性ꎬ是人类健康的潜在威胁[５￣６]ꎮ链格孢属真菌种类多且分类复杂ꎬ目前已有记录的就有３００多种[７]ꎮ为了明确甘蓝黑斑病病原菌的分类地位ꎬ王超等[８]通过核糖体ＤＮＡ内转录间隔区(ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ)序列分析发现ꎬ芸薹生链格孢(Ａｌｔｅｒ￣ｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ)是引起东北农业大学实习基地内甘蓝黑斑病的病原菌ꎮ另有研究结果表明ꎬ芸薹生链格孢㊁芸薹链格孢(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃａｅ)㊁萝卜链格孢(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｒａｐｈａｎｉ)㊁链格孢(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａｔａ)均能侵染甘蓝[３]ꎮ为了揭示江苏省甘蓝黑斑病的病原菌种类ꎬ从江苏省南京市和宜兴市采集疑似黑斑病的甘蓝病株ꎬ在明确分离菌株形态学特征和致病性的基础上ꎬ结合多基因分子系统学研究ꎬ鉴定甘蓝黑斑病致病菌ꎬ同时测试不同杀菌剂对病原菌的室内毒力ꎬ以期为甘蓝黑斑病病原菌的鉴别和防治提供科学依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀病样采集与病原菌分离在南京市江宁区和宜兴市周铁镇甘蓝种植区ꎬ选取具有黑斑病发病典型症状的甘蓝植株ꎬ拍照并采集病叶备用ꎮ按照方中达[９]的常规组织分离方法进行甘蓝黑斑病病原菌分离ꎬ从病变叶片边缘切下５ｍｍˑ５ｍｍ大小的叶片组织ꎬ７５％乙醇表面消毒９０ｓꎬ无菌水洗净后用灭菌滤纸吸干水分ꎬ接种于ＰＤＡ培养基(货号ＣＭ０１３９ꎬＯｘｏｉｄ公司产品)ꎬ置于２５ħ条件下培养ꎮ长出的菌落经过单孢纯化ꎬ保存于４ħ冰箱中备用ꎮ１.２㊀形态特征观察用打孔器在菌落边缘取直径为０ ５ｃｍ的菌丝块ꎬ接种到ＰＤＡ平板中央ꎬ置于２５ħ培养７ｄꎬ然后观察菌落形态ꎮ用无菌水洗脱分生孢子ꎬ在光学显微镜(货号ＯｌｙｍｐｕｓＣＸ３３ꎬＯｌｙｍｐｕｓ公司产品)下观察分生孢子形态特征ꎮ１.３㊀致病性测定用于病原菌致病性测试的甘蓝品种ＨＢＪＤ２８３由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供ꎮ将甘蓝种子播种在含基质的５０穴育苗盘中ꎬ于温室中培养约３０ｄ后备用ꎮ菌丝块接种法:供试菌株在２５ħ培养７ｄꎬ然后用打孔器在菌落边缘取直径为０ ５ｃｍ的菌丝块ꎬ将菌丝块接种于离体甘蓝叶片表面ꎬ以接种琼脂块的叶片作为对照ꎮ接种后的叶片置于托盘内ꎬ覆盖保鲜膜保湿ꎬ在２５ħ条件下培养３ｄꎬ然后观察发病情况ꎮ孢子喷雾法:将供试菌株接种至ＰＤＡ培养基中ꎬ置于２５ħ条件下培养７~１０ｄꎬ收集分生孢子ꎬ使用无菌水调整分生孢子悬浮液中分子孢子含量为１ｍｌ１ˑ１０５个ꎮ通过喷雾法将孢子悬浮液喷洒在离体甘蓝叶片上ꎬ以喷洒无菌水的叶片作为对照ꎮ接种后的叶片置于托盘内ꎬ覆盖保鲜膜保湿ꎬ在２５ħ条件下培养３ｄꎬ然后观察发病情况ꎮ１.４㊀分子生物学鉴定用灭菌牙签从２５ħ培养１０ｄ左右的ＰＤＡ平板上刮取菌丝ꎬ根据Ｃｅｎｉｓ[１０]报道的方法提取菌株基因组ＤＮＡꎮ利用目的基因引物对供试菌株的ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ㊁过敏原基因(Ａｌｔａ１)㊁３￣磷酸甘油醛脱氢酶基因(ＧＡＰＤＨ)进行ＰＣＲ扩增(表１)ꎮＰＣＲ扩增体系(５０μｌ):２５μｌ２ˑＱｕｉｃｋＴａｑ ＨＳＤｙｅＭｉｘ(ＤＴＭ￣１０１ꎬＴｏｙｏｂｏ)ꎬ１μｌ基因组ＤＮＡꎬ上下游引物各２μｌꎬ２０μｌｄｄＨ２Ｏꎮ扩增程序ꎬｒＤＮＡ￣ＩＴＳ:９５ħ预变性３ｍｉｎꎻ９４ħ３０ｓꎬ５４ħ３０ｓꎬ７２ħ４０ｓꎬ３０个循环ꎻ最后７２ħ７ｍｉｎꎮＡｌｔａ１基因:９５ħ预变性３ｍｉｎꎻ９４ħ３０ｍｉｎꎬ５７ħ３０ｓꎬ７２ħ４５ｓꎬ３０个循环ꎻ最后７２ħ１０ｍｉｎꎮＧＡＰＤＨ基因:９５ħ预变性３ｍｉｎꎻ９４ħ３０ｓꎬ５３ħ３０ｓꎬ７２ħ３０ｓꎬ３０个循环ꎻ最后７２ħ１０ｍｉｎꎮＰＣＲ扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测后ꎬ送通用生物(安徽)股份有限公司进行双向测序ꎮ获得的目的片段序列经校对后ꎬ在ＮＣＢＩ网站进行ＢＬＡＳＴ检索分析ꎮ下载芸薹生链格孢㊁其他链格孢属成员及番茄匍柄霉的目的基因序列ꎬ采用ＭＥＧＡ７.０软件构建多基因系统发育树ꎮ８４９江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期表１㊀扩增目的基因所用引物Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ引物名称㊀引物序列参考文献ＩＴＳ１５ᶄ￣ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ￣３ᶄ[１１]ＩＴＳ４５ᶄ￣ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３ᶄＡｌｔａ１￣Ｆ５ᶄ￣ＡＴＧＣＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣ￣３ᶄ[１２]Ａｌｔａ１￣Ｒ５ᶄ￣ＡＣＧＡＧＧＧＴＧＡＹＧＴＡＧＧＣＧＴＣ￣３ᶄＧＡＰＤＨ￣１５ᶄ￣ＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＧＴＣＧＣＡＴＴＧ￣３ᶄ[１３]ＧＡＰＤＨ￣２５ᶄ￣ＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＴＧＣ￣３ᶄ１.５㊀病原菌对杀菌剂敏感性测定采用菌丝生长抑制试验测定病原菌对不同化学药剂的敏感性ꎮ供试药剂如下:２５％苯醚甲环唑用乳油(ＥＣ)稀释(终质量浓度分别为１.００００μｇ/ｍｌ㊁０.５０００μｇ/ｍｌ㊁０.２５００μｇ/ｍｌ㊁０.１２５０μｇ/ｍｌ㊁０.０６２５μｇ/ｍｌ)ꎻ２５％丙环唑用乳油(ＥＣ)稀释(终质量浓度分别为１.００００μｇ/ｍｌ㊁０.５０００μｇ/ｍｌ㊁０.２５００μｇ/ｍｌ㊁０.１２５０μｇ/ｍｌ㊁０.０６２５μｇ/ｍｌ)ꎻ５０％异菌脲用可湿性粉剂(ＷＰ)稀释(终质量浓度分别为２ ０００μｇ/ｍｌ㊁１ ０００μｇ/ｍｌ㊁０ ５００μｇ/ｍｌ㊁０ ２５０μｇ/ｍｌ㊁０ １２５μｇ/ｍｌ)ꎻ８０％代森锰锌用可湿性粉剂(ＷＰ)稀释(终质量浓度分别为２００ ０μｇ/ｍｌ㊁１００ ０μｇ/ｍｌ㊁５０ ０μｇ/ｍｌ㊁２５ ０μｇ/ｍｌ㊁１２ ５μｇ/ｍｌ)ꎻ４０％氟硅唑用乳油(ＥＣ)稀释(终质量浓度分别为１.００００μｇ/ｍｌ㊁０.５０００μｇ/ｍｌ㊁０.２５００μｇ/ｍｌ㊁０.１２５０μｇ/ｍｌ㊁０.０６２５μｇ/ｍｌ)ꎻ５０％咯菌腈用可湿性粉剂(ＷＰ)稀释(终质量浓度分别为１.００００μｇ/ｍｌ㊁０.５０００μｇ/ｍｌ㊁０.２５００μｇ/ｍｌ㊁０.１２５０μｇ/ｍｌ㊁０.０６２５μｇ/ｍｌ)ꎻ４５％戊唑醇用悬浮剂(ＳＣ)稀释(终质量浓度分别为１.００００μｇ/ｍｌ㊁０.５０００μｇ/ｍｌ㊁０.２５００μｇ/ｍｌ㊁０.１２５０μｇ/ｍｌ㊁０.０６２５μｇ/ｍｌ)ꎻ４０％己唑醇用悬浮剂(ＳＣ)稀释(终质量浓度分别为１.００００μｇ/ｍｌ㊁０.５０００μｇ/ｍｌ㊁０.２５００μｇ/ｍｌ㊁０.１２５０μｇ/ｍｌ㊁０.０６２５μｇ/ｍｌ)ꎮ菌丝生长抑制测定:将直径为０.５ｃｍ的菌块分别接种到含杀菌剂ＰＤＡ平板和不含杀菌剂但含等量稀释溶剂的ＰＤＡ平板(对照)上ꎮ每个处理重复４次ꎮ接种后的ＰＤＡ平板置于２５ħ恒温培养箱中培养７ｄꎬ然后以十字交叉法测量各处理的菌落直径ꎬ求出菌落直径平均值ꎬ并计算抑制率ꎮ菌丝生长抑制率＝(对照菌丝生长直径－不同杀菌剂下的菌丝生长直径)/(对照菌丝生长直径－０.５ｃｍ)ˑ１００％ꎮ使用ＳＰＳＳＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ２０ꎬ对以１０为底数的杀菌剂质量浓度的对数值(ｘ)和对应的菌丝生长抑制率(Ｙ)进行回归分析ꎬ求出毒力回归方程(Ｙ＝ａｘ＋ｂ)和有效抑制中浓度(ＥＣ５０)ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀甘蓝黑斑病田间典型症状田间调查发现ꎬ甘蓝植株下部叶片发病最为频繁ꎬ同时叶球部分也有发病ꎮ发病初期形成圆形褪绿斑ꎬ随着病情进一步发展ꎬ病斑逐渐扩大变黑ꎬ四周伴有黄色晕圈ꎬ后期病斑转为淡褐色且带有同心轮纹ꎬ湿度高时可见黑褐色霉状菌丝ꎬ病斑部分有时破裂或穿孔ꎬ严重时病斑汇集成块ꎬ叶片大面积枯死ꎬ全株叶片由外向内干枯(图１)ꎮ图１㊀甘蓝黑斑病田间症状Ｆｉｇ.１㊀Ｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆｃａｂｂａｇｅｂｌａｃｋｓｐｏｔｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄ９４９刘志刚等:甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性２.２㊀病原菌分离采用组织分离法对甘蓝病叶进行病原分离和纯化ꎬ共得到６个菌株ꎬ利用显微镜观察菌丝产孢形态及孢子形态(图２)ꎮ６个菌株菌落形态和分生孢子形态的具体描述见表２ꎮＨＢ１㊁ＨＢ３㊁ＨＢ６菌落和分生孢子形态相似但孢子大小略有差异ꎬ其他３个菌株的菌落和分生孢子形态差异明显ꎮ表２㊀６个病原菌菌株的形态学比较Ｔａｂｌｅ２㊀Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｉｘｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｓｔｒａｉｎｓ菌株菌落形态分生孢子特征形态孢子直径(μｍ)隔膜数横隔膜纵隔膜ＨＢ０菌落呈不均匀黄褐色ꎬ具同心轮纹ꎬ气生菌丝发达ꎬ菌丝绵密倒棒状或卵形ꎬ喙长短不一(７~４３)ˑ(６~２５)１~８０~４ＨＢ１菌落呈黑褐色ꎬ气生菌丝少ꎬ分生孢子茂密倒棒状ꎬ无喙或短至不明显ꎬ部分孢子具有小疣突(１２~６８)ˑ(８~１６)１~５０ＨＢ２菌落呈灰绿色ꎬ气生菌丝发达卵形或近球形ꎬ无喙或短喙(１５~４８)ˑ(１２~３８)１~８０~５ＨＢ３菌落呈黑褐色ꎬ气生菌丝少ꎬ分生孢子茂密倒棒状ꎬ无喙或短至不明显ꎬ部分孢子具有小疣突(８~５０)ˑ(８~１５)１~５０ＨＢ５菌落呈灰黄色ꎬ具同心轮纹ꎬ气生菌丝发达卵形或近球形ꎬ喙长短不一(２０~６２)ˑ(１０~３７)１~７０~４ＨＢ６菌落呈黑褐色ꎬ气生菌丝少ꎬ且分生孢子茂密倒棒状ꎬ无喙或短至不明显ꎬ部分孢子具有小疣突(８~４５)ˑ(６~１５)１~４０２.３㊀病原菌的致病性参照科赫氏法则测试分离病原菌的致病性ꎮ通过菌丝块法及孢子喷雾法接种甘蓝离体叶片发现ꎬ在分离的菌株中ꎬ仅有ＨＢ１㊁ＨＢ３㊁ＨＢ６能在甘蓝叶片上致病(图３)ꎮ与对照相比ꎬ接种上述３个菌株菌丝块的叶片黄化严重ꎬ有时可见霉层ꎬ且病斑部分易破裂(图３)ꎻ通过喷雾法接种孢子３ｄ后ꎬ叶片表面密布水渍状小病斑ꎬ病斑周围黄化ꎬ与田间甘蓝黑斑病初期症状一致(图３)ꎮ２.４㊀分子生物学鉴定及序列分析在形态学初步鉴定的基础上ꎬ结合分子鉴定技术进一步明确分离得到的黑斑病病原菌的分类地位ꎮ基于形态学鉴定及致病性测定ꎬ确定ＨＢ１㊁ＨＢ３㊁ＨＢ６为病原菌ꎬ以ＨＢ１㊁ＨＢ３㊁ＨＢ６的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ分别扩增ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ㊁Ａｌｔａ１㊁ＧＡＰＤＨ基因ꎬ经测序获得ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ长度分别为５７８ｂｐ㊁５８７ｂｐ㊁５８７ｂｐꎬＡｌｔａ１长度分别为５１６ｂｐ㊁５１１ｂｐ㊁５１８ｂｐꎬＧＡＰＤＨ长度分别为５９５ｂｐ㊁５９５ｂｐ㊁５９６ｂｐ的目的片段ꎮ将３个菌株的目的片段序列在ＮＣＢＩ网站进行ＢＬＡＳＴ检索分析ꎬ结果显示供试菌株的目的片段与芸薹生链格孢菌株具有很高的序列相似性(９９.６３％~１００ ００％)ꎮ下载芸薹生链格孢及其他链格孢属成员的目的基因序列(表３)ꎬ按照首尾相连方法将上述序列拼接后进行分析ꎮ以番茄匍柄霉为外群ꎬ采用ＭＥＧＡ７.０软件中的最大似然法(Ｍａｘｉｍｕｍｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ)构建多基因系统发育树ꎬ以Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ进行１０００次重复检验ꎬ估算分支的自展支持率ꎬ分析供试菌株与其近缘种菌株的亲缘关系ꎬ确定其分类地位ꎮ如图４所示ꎬ本研究中获得的３个菌株与芸薹生链格孢的２个参考菌株紧密聚类在一起ꎬ自展支持率为１００％ꎮ综合致病性测定结果以及病原菌形态特征ꎬ结合多基因序列联合分析ꎬ最终确定分离得到的甘蓝黑斑病病原菌为芸薹生链格孢ꎮ２.５㊀病原菌对杀菌剂的敏感性采用菌丝生长抑制法测试８种杀菌剂对供试菌株ＨＢ１的毒力ꎮ结果显示ꎬ苯醚甲环唑㊁咯菌腈㊁己唑醇㊁氟硅唑㊁戊唑醇㊁丙环唑㊁异菌脲对供试菌株的抑制效果较好ꎬＥＣ５０分别为０ ０３７μｇ/ｍｌ㊁０ ０３９μｇ/ｍｌ㊁０ ０６４μｇ/ｍｌ㊁０ １３４μｇ/ｍｌ㊁０ １７５μｇ/ｍｌ㊁０ ２６３μｇ/ｍｌ㊁０ ６４１μｇ/ｍｌꎬ对供试菌株的抑制效果最弱的药剂为代森锰锌ꎬ其ＥＣ５０为２８０ １０１μｇ/ｍｌ(表４)ꎮ０５９江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期图２㊀分离获得的６个病原菌的形态学特征Ｆｉｇ.２㊀Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓｉｘｐａｔｈｏｇｅｎｓ图３㊀分离获得的甘蓝黑斑病病原菌的致病性Ｆｉｇ.３㊀Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｃａｕｓｉｎｇｃａｂｂａｇｅｂｌａｃｋｓｐｏｔ１５９刘志刚等:甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性表３㊀聚类分析所用的参考菌株及其目的基因和核糖体ＤＮＡ内转录间隔区(ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ)ＧｅｎＢａｎｋ登录号Ｔａｂｌｅ３㊀ＲｅｆｅｒｅｎｃｅｉｓｏｌａｔｅｓｕｓｅｄｉｎｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎｄｔｈｅｉｒｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓａｎｄｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒｏｆｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ(ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ)ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓ种名㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀菌株编号㊀㊀㊀目的基因和核糖体ＤＮＡ内转录间隔区(ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ)ＧｅｎＢａｎｋ登录号ｒＤＮＡ￣ＩＴＳＡｌｔａ１ＧＡＰＤＨＡｌｔｅｒｎａｒｉａａｇｅｒａｔｉＣＢＳ１１７２２１ＫＪ７１８０９８ＫＪ７１８６１８ＫＪ７１７９５３ＡｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａｔａＴＣＳ３００１ＭＮ３９４８７９ＭＮ４１０９１１ＭＮ４１０９１９Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ１００７￣１０￣２ＭＷ８９８６３１ＭＷ５４１７５７ＭＷ５４１６９８ＡｌｔｅｒｎａｒｉａａｒｇｙｒａｎｔｈｅｍｉＹＺＵ１７１０６７ＭＧ６４７６１８ＭＧ６４７６１６ＭＧ６７４１３９ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｂａｔａｔｉｃｏｌａＰＰＲＩ:１１９７２ＫＹ０９９６９０ＫＹ０９９６５２ＫＹ０９９６７１Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃａｅ４３３ＫＰ９９３５３３ＫＲ０５１３８４ＫＲ０５１３９２ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａＣＣＰＹ３ＭＧ２５０６０３ＭＧ２５０６３９ＭＧ２５０６１５Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ１０１/１ＭＮ１７３８２４ＭＮ１７５５０５ＭＮ１７５５１５ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｂｕｒｎｓｉｉＹＺＵ１９１００３ＭＮ６５６１３６ＭＮ６５６１４１ＭＮ７１８６６２ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｃａｒｏｔｉｉｎｃｕｌｔａｅＢＭＰ００６４ＥＵ１３６６４１ＥＵ１３９３２９ＥＵ１４１９８９ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｃａｒｔｈａｍｉＣＢＳ６３５.８０ＫＪ７１８１３１ＫＪ７１８６４９ＫＪ７１７９８１Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｃｈｅｉｒａｎｔｈｉ９０３/４ＭＷ４８７２２８ＭＷ４９６４２０ＭＷ４９６４２１ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｃｉｎｅｒａｒｉａｅＹＺＵ１７１９７１ＭＨ３５０３９５ＭＨ２８５９４６ＭＨ２８５９４８ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｃｒａｓｓａＣＢＳ１１６６４８ＫＪ７１８１５１ＫＪ７１８６６７ＫＪ７１７９９９ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｃｕｃｕｍｅｒｉｎａＣＢＳ１１７２２６ＫＪ７１８１５５ＫＪ７１８６７０ＫＪ７１８００２ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｄａｕｃｉＣＢＳ４７７.８３ＫＪ７１８１６１ＫＪ７１８６７６ＫＪ７１８００８ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｅｕｐｈｏｒｂｉｉｃｏｌａＣＢＳ１３３８７４ＫＪ７１８１７４ＫＪ７１８６８７ＫＪ７１８０１９Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｇａｉｓｅｎ０４０７￣５￣５ＭＷ８９８６３３ＭＷ５４１８１５ＭＷ５４１７００ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｇｏｓｓｙｐｉｎａＣＢＳ１０４.３２ＫＰ１２４４３０ＪＱ６４６３９５ＪＱ６４６３１２Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ２０７ＭＮ１７３８２６ＭＮ１７５５０７ＭＮ１７５５１７Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇｉｐｅｓ２０ＮＬ０２ＯＫ４２６３８８ＯＫ４６９３０４ＯＫ４６９３０２ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｍａｃｒｏｓｐｏｒａＣＢＳ１１７２２８ＫＣ５８４２０４ＫＪ７１８７０２ＫＣ５８４１２４ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｐａｎａｘＣＮＵ３１５９ＪＦ４１７５６０ＪＸ２１３２９６ＪＦ４１７６４１ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｐｏｒｒｉＣＮＵ１０３０１３ＪＦ３３１４５５ＪＦ３３１５４３ＪＦ３３１４８６ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｒａｄｉｃｉｎａＢＭＰ００４７ＥＵ１３６６６１ＥＵ１３９３４９ＥＵ１４２００９ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｓｅｓａｍｅＣＢＳ２４０.７３ＫＪ７１８２３１ＪＱ６４６４２７ＪＱ６４６３４３ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｓｏｌａｎｉＥｇｙ￣Ｐ１ＭＴ９９６２７６ＭＴ９９６２５５ＭＴ９９６２６２ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｓｔｅｖｉａｅＣＢＳ１１７３６２ＫＪ７１８２５２ＫＪ７１８７５８ＫＪ７１８０７９ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｔａｇｅｔｉｃａＣＢＳ４７９.８１ＫＣ５８４２２１ＫＪ７１８７６１ＫＣ５８４１４３Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ０５１７￣１８￣９ＭＷ８９８６２９ＭＷ５４１７５５ＭＷ５４１６９６ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｔｏｍａｔｉｃｏｌａＣＮＵ１３１０６１ＫＪ６５１２７０ＫＪ８６２２５８ＫＪ６５１２７３ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｔｏｍａｔｏＭＸ￣３ＭＫ２２６３０８ＭＫ２２６３１２ＭＫ２２６３１０ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｚｉｎｎｉａＣＢＳ１１８.４４ＫＪ７１８２６４ＫＪ７１８７７１ＪＱ６４６３６１ＳｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉＣＮＵ０７００６７ＪＦ４１７６８３ＪＸ２１３３１１ＪＦ４１７６９３２５９江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期图４㊀基于ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ㊁Ａｌｔａ１㊁ＧＡＰＤＨ的多序列联合聚类分析Ｆｉｇ.４㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄｏｎｒＤＮＡ￣ＩＴＳꎬＡｌｔａ１ꎬＧＡＰＤＨ表４㊀不同化学药剂对芸薹生链格孢的抑制效果Ｔａｂｌｅ４㊀ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｏｎＡｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ杀菌剂名称㊀毒力回归方程㊀㊀有效抑制中质量浓度(μｇ/ｍｌ)杀菌剂质量浓度的９５％置信区间(μｇ/ｍｌ)相关系数(ｒ)苯醚甲环唑Ｙ＝０.４９１ｘ＋０.７０６０.０３７０.００３~０.０８１０.８４０咯菌腈Ｙ＝０.７２６ｘ＋１.０２００.０３９０.０１２~０.０７１０.９５６己唑醇Ｙ＝０.９００ｘ＋１.０７５０.０６４０.０３３~０.０９５０.９８８氟硅唑Ｙ＝１.１３２ｘ＋０.９８７０.１３４０.０９８~０.１７２０.９６２戊唑醇Ｙ＝０.７６１ｘ＋０.５７６０.１７５０.１１３~０.２４６０.９８９丙环唑Ｙ＝０.８４０ｘ＋０.４８７０.２６３０.１９１~０.３６７０.９６８异菌脲Ｙ＝０.９３６ｘ＋０.１８１０.６４１０.４８５~０.８８４０.９２４代森锰锌Ｙ＝０.６８８ｘ－１.６８３２８０.１０１１５７.５９９~９３７.８０００.９９２３５９刘志刚等:甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性３㊀讨论链格孢属真菌种类多且分类复杂[１４￣１７]ꎬ目前已有记录的就有３００多种[７]ꎬ随着高通量测序技术的快速发展ꎬ越来越多的真菌基因组相继被报道ꎬ这也为多序列联合分析提供了极大便利ꎮ基于１６８个链格孢属真菌菌株的Ａｌｔａ１㊁ＧＡＰＤＨ㊁内聚半乳糖醛酸酶基因(ｅｎｄｏＰＧ)㊁ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ㊁翻译延伸因子１￣ａｌｐｈａ基因(ＴＥＦ１)㊁ＲＮＡ聚合酶ＩＩ亚基基因(ＲＰＢ２)和一个匿名基因区域ＯＰＡ１０￣２的序列ꎬＷｏｕｄｅｎｂｅｒｇ等[１８]构建了链格孢属真菌系统发育树ꎮ在其他植物黑斑病的病原菌鉴定方面ꎬ研究人员在ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ的基础上ꎬ联用Ａｌｔａ１㊁三磷酸腺苷酶基因(ＡＴ￣Ｐａｓｅ)㊁钙调蛋白基因(ＣＡＬ)㊁ＧＡＰＤＨ㊁ＲＰＢ２㊁ＴＥＦ１中的部分基因ꎬ明确了大麻黑斑病[１９]㊁香蕉黑斑病[２０]㊁甜瓜黑斑病[２１]的病原菌ꎮ本研究通过ｒＤ￣ＮＡ￣ＩＴＳ㊁Ａｌｔａ１㊁ＧＡＰＤＨ序列联合分析发现ꎬ致病菌株ＨＢ１㊁ＨＢ３㊁ＨＢ６与２个芸薹生链格孢参考菌株紧密聚在一起ꎬ综合致病性测定结果以及病原菌形态特征ꎬ确定从甘蓝病叶中分离到的黑斑病病原菌为芸薹生链格孢ꎮ鉴于引起十字花科黑斑病的链格孢属真菌的种群组成复杂[２２]ꎬ后续将进一步对江苏省其他地区的甘蓝黑斑病病样进行病原菌分离鉴定ꎬ借以探明江苏省甘蓝黑斑病的致病菌组成ꎮ如何有效防治链格孢属真菌引起的黑斑病是当前蔬菜生产上面临的难题ꎬ目前十字花科芸薹属栽培种中缺乏高抗黑斑病的材料ꎬ只在亚麻荠(Ｃａｍ￣ｅｌｉｎａｓａｔｉｖａ)㊁荠菜(Ｃａｐｓｅｌｌａｂｕｒｓａ￣ｐａｓｔｏｒｉｓ)等其他十字花科植物中发现了一些抗性较好的种质资源[２３]ꎮ化学防治仍然是目前十字花科作物黑斑病防控的重要手段ꎮ本研究结果表明ꎬ苯醚甲环唑㊁咯菌腈㊁己唑醇㊁氟硅唑㊁戊唑醇㊁丙环唑㊁异菌脲对甘蓝黑斑病病原菌的抑制作用较强ꎮ前人研究结果表明ꎬ丙环唑㊁苯醚甲环唑㊁己唑醇对引起秋葵黑斑病的链格孢具有较好的抑制效果[２４]ꎻ咪鲜胺㊁异菌脲㊁戊唑醇对引起核桃黑斑病的链格孢有较好抑制作用[２５]ꎻ戊唑醇和苯醚甲环唑这两种三唑类药剂对白菜黑斑病的芸薹链格孢的抑制效果较好[２６]ꎻ苯醚甲环唑对三七黑斑病病原菌(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｐａｎａｘ)的菌丝生长抑制效果明显[２７]ꎻ丙环唑对导致芥菜黑斑病的芸薹链格孢的抑制效果较好[２８]ꎻ咯菌腈和异菌脲对引起月季黑斑病的链格孢的抑制作用较强[２９]ꎮ从以上研究结果可以看出ꎬ在测试的化学药剂中ꎬ苯醚甲环唑和戊唑醇为代表的三唑类㊁咯菌腈为代表的苯基吡咯类㊁异菌脲为代表的二甲酰亚胺类杀菌剂对黑斑病病原菌的菌丝生长抑制效果总体较好ꎮ但也有报道ꎬ异菌脲对三七黑斑病病原菌的菌丝生长抑制效果较差[２７]ꎻ戊唑醇和异菌脲对引起芍药黑斑病的链格孢的抑制作用较差[３０]ꎮ因此ꎬ针对链格孢属真菌引起的不同植物的黑斑病ꎬ需要筛选和匹配合适的杀菌剂ꎬ才能达到较好防治效果ꎮ由于本研究筛选的药剂主要来自室内毒力测定试验结果ꎬ后续需要室外试验来进一步检验ꎮ参考文献:[１]㊀辛竹琳ꎬ崔彦娟ꎬ杨小薇ꎬ等.全球蔬菜产业现状及中国蔬菜育种发展路径研究进展[Ｊ].分子植物育种ꎬ２０２２ꎬ２０(９):３１２２￣３１３２.[２]㊀陈永生ꎬ崔志超ꎬ杨雅婷ꎬ等.关于甘蓝类蔬菜种植模式规范化的建议[Ｊ].长江蔬菜ꎬ２０２１(８):２０￣２１.[３]㊀ＳＡＨＡＲＡＮＧＳꎬＭＥＨＴＡＮꎬＭＥＥＮＡＰＤꎬｅｔａｌ.Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｄｉｓｅａ￣ｓｅｓｏｆｃｒｕｃｉｆｅｒｓ:Ｂｉｏｌｏｇｙꎬｅｃｏｌｏｇｙａｎｄｄｉｓｅａｓｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔ[Ｍ].Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ:Ｓｐｒｉｎｇｅｒꎬ２０１６.[４]㊀ＤＨＡＲＭＥＮＤＲＡＫꎬＮＥＥＬＡＭＭꎬＹＡＳＨＷＡＮＴＫＢꎬｅｔａｌ.Ａｌｔｅｒｎａ￣ｒｉａｂｌｉｇｈｔｏｆｏｉｌｓｅｅｄＢｒａｓｓｉｃａｓ:Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].Ａｆｒｉ￣ｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１４ꎬ８(３０):２８１６￣２８２９. 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植物病原菌的检测原理
植物病原菌的检测原理植物病原菌的检测原理主要分为传统检测方法和分子检测方法两大类。
传统检测方法包括病斑观察、显微镜检测、分离培养、生化、免疫学和生物学检测方法等；分子检测方法主要包括PCR、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、荧光定量PCR、内参PCR、两步PCR、多重PCR、血清学检测、微阵列分析、测序等。
下面将详细介绍传统检测和分子检测方法的原理和应用。
传统检测方法1. 病斑观察法病斑观察是一种最简单、最常用的检测方法。
通过观察植物叶面、茎部等组织上的病斑症状特征，如色素改变、溃疡、软腐、凋萎等症状，判断植物是否感染了病原菌。
该方法通常用于狭义上的病原菌检测，即只能推断出可能存在病原菌，但不具备进一步鉴定病原菌的能力。
2. 显微镜检测法显微镜检测是通过放大被检测样品的细菌菌落、孢子、分生孢子等微观结构，借助显微镜观察和鉴定病原菌的一种方法。
该方法通过观察病原菌的形态、大小、染色性质、分离和生长特征等，与已知的病原菌进行比对，确定植物感染的病原菌种类。
3. 分离培养法分离培养法是通过将被检测的植物组织样品分离培养于富含营养物的培养基上，利用病原菌的生长特性和营养需求进行分离纯化。
通过培养基的选择、温度、湿度、pH值、光照等条件的控制，使病原菌表现出明显的生理与形态特征，便于进一步鉴定和定量检测。
4. 生化检测法生化检测法主要是通过检测病原菌体内的一些特有的生化成分和活性，如酶活性、甘油分解酸生成、酸碱生成、氨氧化等，根据其特异性判断病原菌的类型和数量。
5. 免疫学检测法免疫学检测法主要是利用免疫学原理，通过检测样品中的病原菌抗原或抗体来判断其存在与否。
免疫学检测方法可分为免疫电镜检测、免疫荧光检测、ELISA等。
6. 生物学检测法生物学检测法是利用宿主植物对某一种病原菌的特异性反应来检测病原菌。
常用的生物学检测方法包括种子法、接种法、淫种法、耐病品种鉴定法等。
分子检测方法1. PCR检测法PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，能在短时间内通过特异引物和聚合酶对DNA模板进行扩增。
枯草芽孢杆菌KC1723的鉴定及生物学特征研究
枯草芽孢杆菌KC1723的鉴定及生物学特征研究作者：薛德星李美孙作文李纪顺扈进冬高兴祥李健来源：《山东农业科学》2023年第09期关键词：枯草芽孢杆菌；鉴定；生物学特征；生物防治链格孢属（Alternaria）和炭疽菌属（Colletotri-chum）病原真菌种类繁多，地理分布广泛，可侵害各种农作物，对全球农业生产造成严重威胁。
链格孢属病原菌感染南瓜、甜瓜、西葫芦、黄瓜等瓜类植物引起叶斑病。
芸薹链格孢（Alternar-ia brassicae）是全球性植物病原菌，具有很强的环境适应性，能够快速引起十字花科蔬菜黑斑病，给农业生产造成巨大的经济损失。
近年来，草莓炭疽病危害日趋严重，其致死率一般在10%～20%，严重可达80%以上，对我国草莓产业造成巨大危害。
化学药剂可以很好地防治病菌感染，但长期大量使用化学药剂会导致病原菌产生抗药性，造成环境污染，且农药残留影响人类身体健康。
生物防治是利用微生物之间的拮抗、竞争等方式阻碍病原微生物繁殖，改善土壤理化性质，促进植物生长，提高植物抗病性，具有安全、有效和持久的特点，可以更好地防治植物病虫害。
应用于植物病害的生防细菌、真菌、放线菌等多种菌剂相继被开发，并取得了良好的生防效果。
枯草芽孢杆菌（Bacillus SLLbtilis）是一种常见的产芽孢杆状细菌，广泛存在于土壤和植物表面，对人畜无毒无害，不污染环境，具有很强的抗逆能力，能产生多种抗菌素和抗菌酶，对植物病原菌具有广谱抗性，已成為重要的生防菌之一。
目前，枯草芽孢杆菌已经应用在小麦、玉米、大豆、花生、番茄、辣椒、苹果等多种作物上，并取得理想的生防效果。
本研究从土壤中分离筛选到一株芽孢杆菌KC1723，经形态学、生理生化特征分析和16SrDNA基因鉴定，确定为枯草芽孢杆菌，并通过抑菌试验研究其对炭疽菌、链格孢菌的抑菌效果，以期为其生防制剂的开发应用奠定理论基础。
1材料与方法1.1材料来源菌株KC1723：分离自济南地区土壤样本。
大白菜黑斑病识别与综合防治
大白菜黑斑病识别与综合防治作者：王仰珍来源：《农业开发与装备》 2014年第5期王仰珍（隆化县农牧局植保植检站，河北隆化 068150）摘要：大白菜黑斑病又称黑霉病，是危害大白菜的一种真菌性病害，寄主种类有白菜、甘蓝、等十字花科蔬菜，近几年在承德市零星发现。
我们通过三年的防控实践，基本得到了有效控制。
现对该病的症状识别与防控技术进行总结。
关键词：大白菜；黑斑病；识别；防治大白菜黑斑病是2006年3月2日农业部公布的检疫性有害生物（十字花科黑斑病），其主要危害白菜、甘蓝及花椰菜，还能危害青菜、芥菜、榨菜等十字花科蔬菜。
黑斑病对十字花科蔬菜的危害仅次于软腐病、霜霉病和病毒病三大病害。
该病以春秋两季发生普遍，发生地块可减产15～40%，在我市通过三年的防控实践，将该病的具体识别与综合防控技术总结如下。
1 大白菜黑斑病的发病症状白菜黑斑病主要为害子叶、真叶的叶片及叶柄。
有时也为害花梗和种荚。
叶片染病，初生近圆形褪绿斑，后见扩大。
边缘淡绿色至暗褐色，几天后病斑直径扩大至5～7mm，且有明显同心轮纹，有的病斑具黄色晕圈，高温高湿条件下病部穿孔，发病严重的病斑汇合成大块斑，至半叶或整叶枯死，全株叶片自外向内干枯。
茎或叶柄上病斑长梭形，呈暗褐色条状凹陷。
采种株的茎或花梗受害，病斑近圆形，暗褐色。
种荚上病斑近圆形，中心灰色，边缘褐色，周围淡褐色，有或无轮纹，偶成条斑，稍凹陷，湿度大时生黑褐色霉层区别于霜霉病。
根头部初生暗色病斑后变深，渐成黑色或不规则圆形斑纹。
2 发病原因大白菜黑斑病是一种真菌性病害，是由半知菌亚门真菌的芸薹链格孢菌侵染所致。
大白菜黑斑病病菌主要以菌丝体及分生孢子在病残体、土壤、采种株或种子表面越冬。
翌年春产生分生孢子借风雨传播，从气孔或直接穿透表皮侵入，潜育期3天，侵染春白菜，油菜、甘蓝菜心等十字花科蔬菜，并在病斑上产生分生孢子进行再侵染，使病害不断扩展蔓延。
秋季传播到大白菜上为害，该病发生轻重与连阴雨持续时间长短及品种抗性有关，多雨高湿及温度偏低发病重。
十字花科蔬菜黑斑病
图13-4 十字花科蔬菜黑斑病菌1 分生孢子 2。
分生孢子梗十字花科蔬菜黑斑病Crucifers Alternaria Leaf Spot黑斑病是十字花科蔬菜中常见的病害之一，全国各地分布广泛。
该病在白菜、甘蓝及花椰菜上发生较多，以春秋两季发生普遍，流行年份，可减产20%～50％。
感病后，蔬菜茎叶变苦，品质低劣。
20世纪80年代末期，黑斑病在我国北方地区频频流行，已成为白菜生产上的重要病害之一。
症状主要危害十字花科蔬菜植株的叶片、叶柄，有时也危害花梗和种荚。
在不同种类的蔬菜上病斑大小有差异。
叶片受害，多从外叶开始发病，初为近圆形褪绿斑，以后逐渐扩大，发展成灰褐色或暗褐色病斑，且有明显的同心轮纹，有的病斑周围有黄色晕圈，在高温高湿条件下病部穿孔。
白菜上病斑比花椰菜和甘蓝上的病斑小，直径2～6mm ，甘蓝和花椰菜上的病斑5～30mm 。
后期病斑上产生黑色霉状物（分生孢子梗及分生孢子）。
发病严重时，多个病斑汇合成大斑，导致半叶或整叶变黄枯死，全株叶片自外向内干枯。
叶柄和花梗上病斑长梭形，暗褐色，稍凹陷；种荚上的病斑近圆形，中央灰色，边缘褐色，外围淡褐色，有或无轮纹，潮湿时病部产生暗褐色霉层，区别于霜霉病。
病原病原为芸苔链格孢Alternaria brassicae (Berk.)Sacc. 和芸苔生链格孢A. brassicola (Schw.) Wiltshire(=A. oleracea Milbr. )，属半知菌亚门链格孢属。
两者分生孢子形态相似，倒棍棒状，有纵横分隔，分生孢子3～10个横隔，1～25个纵隔，深褐色。
两种病菌的主要区别是：前者分生孢子梗单生或2～6根丛生，分生孢子多单生，较大，42～138µm ×11～28µm ，淡橄榄色，喙长，顶端近无色，具15个隔膜，主要危害白菜、油菜、芥菜等。
后者分生孢子常串生，8～10个连成一串，较小，50～75µm ×11～17µm ，色较深，无喙或喙短，主要危害甘蓝和花椰菜。
十字花科黑腐病菌σ因子在致病中的作用研究
十字花科黑腐病菌σ因子在致病中的作用研究细菌利用各种机制来精确地调节自身行为,以响应环境的变化,从而促进细菌生长、生存和侵染。
Sigma（σ）因子就是其中一类影响基因表达转录调控的全局信号调控系统。
σ因子作为RNA聚合酶（RNA polymerase,RNAP）的重要组成部分,负责识别特异的启动子序列,提高RNA聚合酶辨认启动子的能力。
细菌募集各类σ因子调控基因表达,响应不同的环境信号,如温度、渗透压、酸碱、重金属等各种胁迫等。
基于结构和功能上的差别,σ因子可分为两类:σ54家族和σ70家族。
十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campstris,Xcc）是一种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的重要植物病原细菌。
本研究对Xccσ因子在致病中的调控作用进行了研究,为进一步阐明Xcc 8004菌株的致病机理提供基础。
基于已经测序的Xcc8004基因组序列,我们利用SMART（Simple Modular Architecture Research Tool）（http://smart.embl-heidelberg.de）分析预测得到 15 个σ因子:XC1311（RpoN1）和 XC2251（RpoN2）属于σ54家族,其它13个σ因子属于σ70家族,其中XC3806（RpoD）属于 group 1,XC3843（RpoH）和 XC2281（FliA）属于 group 3,XC0556（RpoE9）、XC1193（RpoE6）、XC1474（RpoE5）、XC2566（RpoE4）、XC2905（RpoE3）、XC2934（RpoE7）、XC2974（RpoE1）、XC3099（RpoE10）、XC3383（RpoE2）和XC3864（RpoE8）属于group 4,即 ECF（extracytoplasmic function）家族。
为研究Xcc中各σ因子的致病性,实验中构建了各σ因子的缺失突变体及互补菌株。
白菜黑斑病研究进展
２ 份 。占绝大多数 ， Ｏ 感病品种材料 １ 份 ， ２ 高感 病品 种 １ 。抗性材料 中有 ２ 份 份是多倍体 品种 ， 体现 了 多倍体材料抗逆性 ， 明利用染色体加倍 可能是抗 说 黑 斑病 育 种 的一种 有 效 途径 。 中抗 材 料 居 多 ， 是 也 黑斑病较轻 的一个原因 ，所 以合 理进行 品种布局 ，
是 减轻 黑斑 病发 生 的一个 可 行方 法 。
Ｊｓｌ ｉ 等对 十字花科 蔬菜有致病 性 的链格 ａ ａｃ ａ ｖｈ 孢 ｒＮ Ｄ Ａ部分序列进行 了分析 比较 ，表明芸薹链格 孢、 甘蓝链格孢 、 卜 萝 链格孢等病原菌 ＩＳ 和 ＩＳ Ｔ １ Ｔ２ 区包 含 较 多 变异 ， Ｓ Ｉ １比 ＩＳ 更 大 的序 列 变异 ， Ｔ Ｔ ２有
抗病亲本杂交的 Ｆ 仍表现抗病 ， 两个感病亲本的 Ｆ 仍表现感病 ， 一个抗病亲本和一个感病亲本杂交的 Ｆ 表现 中间偏 抗类型，Ｆ 的抗性 和中亲值差异显 著， 但未达到极显著水平 ， 为部分显性 ， 正反交差异 不显著呈现 核遗传 ， 细胞质作用不显著 ， 白菜苗 大 期 对黑 斑病 的抗 性 以加 性效 应 为主［ ７ １ 。 杨广东等采用 ２个抗病 品系和 ２ 感病 品系 个 作为试材 ， 并配制杂交组合 ， 采用真叶期人工接种 病菌鉴定 Ｆ、 Ｃ 和 Ｂ Ｆ、 Ｂ Ｃ 杂种抗性 的方法 ，研究 了大 白菜对黑斑病的抗性遗传规律［ ８ １ 。结果表明， 大 白菜对黑斑病 的抗性为显性遗传并受单 个显性基
增甘 蓝 链 格 孢 （ ． ａｓｅ ｏ ）４ ７ ｐ的 片段 ， ａ ｌ Ａｂ ｓｉ ｃｌ ５ ｂ ｒ ｉ ａ Ａｉ ｐ
张凤兰等采用 ４× ４完全双列杂交对大 白菜苗
期 黑 斑 病 的抗 性 遗传 规 律 进行 了研 究 ，结 果 表 明 ， 两 个 抗病 亲本 和 两个 感 病 亲本 抗 性 差 异 显著 ； 两个
5 常见种传病害
5.2 马铃薯环腐病
5.2.5 防治措施 （1）)实行检疫 严禁无病区从病区调种，以免扩 大蔓延。 （2）选用适合当地种植的抗病丰产良种。
克新一号，白头翁、长薯4号、5号，同薯8号、晋薯5号、 郑薯4号。
（3）选留无病种薯
南方可采用秋播留种的办法，选出适中的小型块茎作种用。 北方产区应有计划地建立无病留种田，采用整薯播种，生 育期间随时拔除病株，保证收获无病种薯。留种田先收， 在收、选、晾和入窖过程中，严格进行挑选，剔除病薯， 去杂去劣。
5.1 十字花科蔬菜黑斑病
5.1.6 利于发病的因素
（1）多雨高湿及温度偏低发病早而重 发病温度范围11—24℃，适宜温度11．8～ 19．2℃，相对湿度72～85％； （2）品种间抗性有差异，但未见免疫品种
5.1 十字花科蔬菜黑斑病
5.1.7 防治措施 （1）使用抗病品种
北京新1号、2号、3号，郑杂2号，北京88号，津青9号， 双青156，晋菜3号
（2）种子处理
A 54 ℃温汤浸种处理20 min，晾干后播种 B 用种子重量0．4％的50％福美双可湿性粉剂拌种， C 用种子重量0．2～0．3％的50％扑海因可湿性粉剂拌种
5.1 十字花科蔬菜黑斑病
（3）轮作
与非十字花科蔬菜轮作2～3年
（4）施足基肥，增施磷钾肥，有条件的采用配 方施肥，提高菜株抗病力。 （5）喷药防治
5.2.2 病原：
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
Davis et al.
菌体为棒杆状，通常长为0.8μm～1.2μm，宽为 0.4μm～0.6μm，单个存在，偶尔成双，间或出现 “V”、“L”、“Y”形连接
十字花科蔬菜种传黑斑病研究进展
十字花科蔬菜种传黑斑病研究进展
肖长坤;李勇;李健强
【期刊名称】《中国农业大学学报》
【年(卷),期】2003(008)005
【摘要】黑斑病是危害十字花科蔬菜生产的世界性真菌病害,20世纪90年代前后在我国北方严重发生,目前在生产中仍有潜在风险.黑斑病病原芸薹链格孢、甘蓝链格孢、萝卜链格孢的鉴定主要借助病菌形态、病原变异、核酸序列、同工酶与酶联免疫分析,其中从核酸水平进行病原鉴定更为快捷;黑斑病菌毒素等次生代谢产物是重要致病因子.分子生物学方法已用于十字花科蔬菜种传黑斑病菌种的检测和鉴定.在该病害的防治方法中,种子处理及施用高效低毒杀菌剂是有效途径.今后应在分子水平上注重对病原种群构成、病害流行及种子健康检测方法的研究,同时加强该病害生物防治的基础和技术性探索.
【总页数】8页(P61-68)
【作者】肖长坤;李勇;李健强
【作者单位】中国农业大学,农学与生物技术学院,北京,100094;密苏里大学哥伦比亚分校,食品科学系,美国,密苏里州,65211;中国农业大学,农学与生物技术学院,北京,100094
【正文语种】中文
【中图分类】S435.11
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果 幼苗 感染 本 菌后 ， 即使 苗期 不产 生 明显 的病 症 ， 但 种
子 带菌 可在 植 株上 增 殖 或 群集 ， 致 生 长 后期 或采 种 株 爆发 严 重 的危 害 。全 国各大 白菜 产 区均有 不 同程度 的
参 照文献 ［ ２ ］ 方法 ， 选择 了以下 ８种培 养基 。 ｍｏ ｄ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ Ｓ Ｄ Ａ 培养 基 ： 葡萄糖 （ ２ ０ ． ０ ｇ ） ， 蛋 白 胨 （ １ ０ ． ０ ｇ ） ， 琼脂（ ２ ０ ． ０ ｇ ） ， 蒸 馏水 （ １ Ｌ ） 。 Ｐ ＤＡ培 养 基 ： 马铃薯（ ２ ０ ０ ． ０ ｇ ） ， 葡萄糖（ ２ ０ ． ０ ｇ ） ，
１ Ｏ ～２ Ｏ ， 发病 严重的年份可减产 ３ ０ ９ ／ ６ ～４ ０ ， 所 以在 进行 种子 调运 、 播 种 前 进 行 种 子 健 康 检 测 和 预警
显 得尤 为 重要 。 十字 花科 黑斑 病病 原 菌主要 是 半知 菌亚 门丝 孢纲
（ Ｍｇ Ｓ Ｏ４・ ７ Ｈ ２ ０） （ ０ ． ５ ｇ ） ， 氯化钾 （ ｏ ． ５ ｇ ） ， 硫 酸 亚 铁
Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｆ ｏ ｒ ＰＣＲ Ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏｎ Ｍｅ ｔ ｈｏ ｄ ｏ ｆ ｔ ｈｅ Ｐａ ｔ ｈｏ ｇ ｅ ｎｓ Ｃａ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ Ｂｌ ａ ｃ ｋ
Ｌｅ ａ ｆ Ｓ ｐ ｏ ｔ ｏ ｆ Ｃｒ ｕ ｃ ｉ ｆ ｅ ｒ ａ ｅ Ｖｅ ｇ ｅ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｓ
琼脂 （ ２ ０ ． ０ ｇ ） ， 蒸馏 水 （ １ Ｌ ） 。 Ｃ Ｓ培 养基 ： 硝 酸钠 ３ ｇ ， 磷 酸氢 二钾 （ １ ｇ ） ， 硫 酸 镁
病 害发 生 ， 西南 、 华 北 地 区 近 年来 为 害呈 上 升 趋 势 ， 南
方秋 季 多雨 季 节发 病 最 为 严 重 ， 一 般 发 病 年份 可 减 产
黑 斑病 是 十 字 花 科 蔬 菜 作 物 的 一 种 主要 种 传 病 害， 带 菌种子 发 芽后 会 引发猝 倒病 ， 造 成幼 苗猝 倒 。如
株分 别为 ｃ ｏ ｌ ａ １和 ｃ ｏ ｌ ａ ２ ； 萝 卜 链 格 孢菌 ２个 菌 株 分
别为 ｒ ａ ｐ １ 、 ｒ ａ ｐ ２ 。
Ｐ Ｃ Ｒ检测方 法进行 了初 步研究 ， 探索 建立简便 、 准确、 高
效 的十字花科蔬菜 黑斑病 菌种子 （ 苗） 健康 检测技术 。
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 供 试 材 料
关键词 ： 芸 薹链 格 孢 菌 ；甘 蓝 链 格 孢 菌 ；萝 卜 链格孢菌 ； 培 养 基 ；引 物 ； Ｐ Ｃ Ｒ 检 测 方 法
的富集 培 养 ； 引物 Ｂ ２和 ｓ １ 可 分 别 对 Ａ． ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ｉ ｃ ｏ ｌ ａ 和 Ａ． ｒ ａ ｐ ｈ ａ ｎ ｉ 菌种 进 行 特 异 性 鉴 定 ， 而 Ａ． ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ａ ｅ特 异 性 鉴 定 还
需 进 一 步研 究确 定 。
问 题 探 讨
云 晓敏 等 ： 十 字 花 科 蔬 菜黑 斑 病 菌 Ｐ Ｃ Ｒ 检 测 方 法 研 究
・
问题探 讨 ・
十字花科蔬 菜黑斑病菌 Ｐ Ｃ Ｒ检 测 方 法 研 究
云晓敏 。 宋 歌， 律 宝春 。 蒋晓 春
（ 北 京市 种子 管 理站 ， 北京 １ Ｏ Ｏ Ｏ ８ ８ ）
文 献标 志码 ： Ａ
文章编号 ： １ ０ ０卜４ ７ ０ ５ （ ２ ０ １ ５ ） １ ０ － ０ ０ ６ ５ — ０ ４
农 业 大学种 子健 康 中心 提 供 ， 其 中芸 薹 链 格孢 菌 ３个 菌株 分别 为 ｃ ａ ｅ １ 、 ｃ ａ ｅ ２和 ｃ ａ ｅ ３ ； 甘蓝 链格 孢 菌 ２个 菌
Ｙ Ｕ Ｎ Ｘ ｉ ａ ｏ ｍｉ ｎ ， Ｓ ＯＮ Ｇ Ｇ ｅ ，Ｌ Ｏ Ｂ ａ ｏ ｃ ｈ ｕ ｎ ， Ｊ Ｉ Ａ Ｎ Ｇ Ｘ ｉ ａ ｏ ｃ ｈ ｕ ｎ
摘 要 ： 为 建 立 十 字花 科 蔬 菜 黑 斑 病 菌 分 子 检 测 鉴 定 技 术 ， 以
视 。Ｂ ａ ｓ ｓ ｉ ｍｂ ａ ， Ｄ ． Ｄ ． Ｍ 首 次 报道 萝 卜中 的黑斑 病 是 由 萝 卜链格 孢菌 引起 ， 并 同 时进 行 了 Ｐ Ｃ Ｒ 鉴 定研 究 ［ １ 。 但 有 关从 种子 （ 苗） 上分 离 和富集 ３种 链格 孢菌 所适 宜 的 培养基 ， 以及 不 同菌 株特 异 Ｐ Ｃ Ｒ检测 方 法还需 要 进
Ｄ０Ｉ 编码 ： １ ０ ． ０ ０ １ — ４ ７ ０ ５ ． ２ ０ １ ５ ． １ ０ ． ６ ５
１ ． １ ． １ 供 试 菌株 十字花 科蔬 菜 黑斑 病菌 ３个 种共 ７个 菌株 由 中国
中图分类号 ： Ｓ ４ １ — ３ ０
一
黑 斑 病 茵 ３个种 芸 薹 链 格 孢 （ Ａｌ ｔ ｅ ｒ ｎ ａ ｒ ｉ ａ ． ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ａ ｅ ） ， 甘 蓝 链 格 孢（ Ａ． ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ｉ ｃ ｏ ｌ ａ ） 和萝 链格 孢 （ Ａ． ｒ ａ ｐ ｈ ａ ｎ ｉ ） 为 实验对 象 ， 筛
选 适宜其生长的 富集培养基 ； 依 据 文 献 报 导 和 ３个 种 Ｄ ＮＡ 的
Ｉ ＴＳ序 列 共 设 计 合 成 ７对 特 异 性 引物 ， 利用 Ｐ ＣＲ检 测 方 法 进 行
鉴 定。结果显示 ， Ｐ Ｄ Ａ和 Ｃ ＭＡ 均 适 合 十 字 花 科 蔬 菜 黑斑 病 菌
步研究 。本 试 验 针 对 ３种 链 格 孢 菌 培 养 基 筛 选 及