蛋白相互作用

一、技术简介
BiFC是由Hu 等在2002 年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术[1]. 有报道在GFP 的两个β片层之间的环结构（loop）上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响GFP的荧光活性，BiFC技术正是利用该荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。

如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发出荧光。

在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有重要意义。

其后发展出的多色荧光互补技(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.这项技术不需要特殊的设备，相互作用的蛋白也不需要特别的理论配比。

因此，BiFC 技术已被国际上众多实验室采用，在活细胞内证明蛋白质的相互作用。

BiFC技术以下几个特点使其对于研究蛋白质相互作用具有独特的优势：
1、能在显微镜下直接观察到蛋白相互作用而且不依赖于其它次级效应；
2、该相互作用可以在活细胞中进行观察，排除了由于细胞裂解或固定可能带来的假阳性结果；
3、蛋白质在近似生理条件的环境下表达，表达水平及特性如翻译后修饰极大地接近于内源蛋白；
4、不需要蛋白质有特别的理论配比，能检测到不同亚群蛋白质间的相互作用；
5、多色BiFC技术不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较；
6、BiFC技术除了荧光倒置显微镜外，不要求特殊的设备。

实验简单、快捷、直观，并适用于原核、真菌、植物、动物等多种组织、细胞. 该技术的完善与发展必然会为蛋白质组学、蛋白质相互作用连锁图的建立带来福音. 但是，该技术与大多检测蛋白质相互作用的技术一样，也存在着假阴性和假阳性的问题，需要在实验中仔细验证。

可参考文献：
Hu, C.D., Y. Chinenov, and T.K. Kerppola, Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell, 2002. 9(4): p. 789-98.
Hu CD , Kerppola TK. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis[J ] . Nature Biotechnology , 2003 ,21 (5) :539 - 545.
【摘要】双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）是指两个不发光的荧光蛋白互补片段在与其融合的蛋白质的相互作用驱动下重新组装形成荧光复合物，恢复荧光特性。

基于双分子荧光互补原理的相关技术在多种不同类型的蛋白质相互作用研究中得到越来越广泛的应用。

我们对双分子荧光互补技术的原理、特性、应用现状、面临的问题及应用前景进行了概述。

【关键词】双分子荧光互补（BiFC）；互补片段；荧光复合物；蛋白质相互作用
Advances of Bimolecular Fluorescence Complementation Assays
and its Application in the Study of Protein-protein InteractionsCHEN Jing
(State Key Laboratory of Trauma,Burn and Combined Injury, Department of Research Institute
of Surgery, Third Military Medical University，Chongqing 400042，China)
Abstract：Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) means two non-fluorescent complementary fragments of fluorescent protein can reassemble to form fluorescent complex and restore fluorescence when they
are fused to two proteins that interact with each other. BiFC analysis has been used to study interactions among a wide range of proteins in many cell types. In this paper, the principle and characteristics of BiFC，the application advances, the limitation and future prospects of BiFC assays are described.
Key words：Bimolecular fluorescence complementation(BiFC)；Complementary fragments；Fluorescent complex；Protein-protein interactions
1 引言
蛋白质相互作用和翻译后修饰的研究使人们对生物调控机制的认识取得了巨大的进展，蛋白质相互作用的研究方法也备受重视，出现了许多具有不同原理和应用特点的相关技术和方法［1-2］。

BiFC作为一种用于研究蛋白质间相互作用的新型方法引起了人们的关注。

利用BiFC分析能够在活细胞生理环境中原位显示蛋白质相互作用产物，尤其是能在单细胞中同时显示多个蛋白质间的相互作用。

近年来，基于BiFC原理的分析方法在蛋白质相互作用和翻译后修饰的研究中逐渐显现出其独特的应用价值。

2 BiFC概述
2.1 BiFC原理
GFP及其突变体作为能够在活体中表达且易于检测的报告基因［3］，通常是以完整的氨基酸序列作为标记物。

随着对其结构和功能研究的日益深入，不断发掘一些新的特点，如GFP基酸序列中的某些特定位点与氨基末端以及羧基末端之间的序列循环互换后仍然能够正确折叠形成生色团结构并保持荧光特性［4-5］。

Hu CD等通过进一步研究发现［6］，在GFP及其突变体氨基酸序列的155或173位点，将其分裂为均不具备发光性能的荧光蛋白片段，即氨基末端片段（含1-154或1-172氨基酸序列）和羧基末端片段（含155-238或173-238氨基酸序列），当某些特定的氨基末端片段与羧基末端片段组合作为标记分子分别与两个能够发生相互作用的蛋白质配偶体形成融合蛋白、并同时在活细胞中表达时，蛋白质配偶体的结合驱使氨基末端片段与羧基末端片段重新组装形成荧光复合物，恢复荧光效应
［6-7］。

这一现象称为双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC），能产生BiFC效应的氨基末端片段与羧基末端片段称为互补片段。

2.2 BiFC的特性
2.2.1 荧光蛋白片段的互补特性按照不同的分裂位点，每个荧光蛋白可产生两个氨基末端片段和两个羧基末端片段，分别以N155、N173和C155、C173表示。

BiFC可发生于同一荧光蛋白的氨基末端片段与羧基末端片段之间，如EYFP的N155和C155、N173和C173，也能发生于不同荧光蛋白的氨基末端片段与羧基末端片段之间，如GFP 的N173和EYFP的C173、EYFP的N173和ECFP的C155。

某些荧光蛋白片段具有多重互补特性，能够与两种以上其它片段互补，如EYFP的N173能够与EYFP的C173、C155和ECFP的C155形成荧光复合物。

但并非所有的荧光蛋白的氨基末端片段与羧基末端片段之间都能产生互补，至今尚未观察到GFP的氨基末端片段与羧基末端片段能形成荧光复合物［8］。

2.2.2 BiFC的光谱特性荧光蛋白的三肽生色团结构（65-67位氨基酸）位于氨基末端片段内，双分子荧光复合物的光谱特性主要取决于氨基末端片段。

来源于同一荧光蛋白的互补片段形成的荧光复合物的激发光谱和发射光谱与对应的完整的荧光蛋白光谱一致，在某些情况下有红移现象发生，这可能与互补片段组装过程中生色团周围的氨基酸排列产生一定改变有关［9］。

来源于不同荧光蛋白的互补片段形成的双分子荧光复合物的激发光谱和发射光谱介于其来源的两种荧光蛋白光谱之间，与氨基末端片段来源的荧光蛋白光谱接近。

总之，相对于天然荧光蛋白，双分子荧光复合物的荧光强度有不同程度的减弱。

2.3 互补片段的研究进展
自BiFC发现以来，最早确认的12种互补片段组合来源于EGFP、EYFP、ECFP［7］，分属7个不同的光谱类型。

这些互补片段标记的融合蛋白载体转染细胞并稳定表达后，必须在低温下（30℃）预孵化0～24 h以促进互补片段组装形成的生色团成熟。

为克服低温引起的应激刺激的影响，科学家们不断寻找新的性能优异的荧光蛋白互补片段。

现已证实YFP的两个新的突变体Citrine和Venus以及ECFP的改进型荧光蛋白Cerulean，其氨基末端片段与羧基末端片段的所有组合均能在37℃生理培养条件下产生荧光互补［8］，这不仅明显缩短了反应时间，使形成的双分子荧光复合物的荧光强度提高2倍以上，并且需要转染的质粒数量也大大减少。

在已经发现的互补片段组合中，目前认为最有效、并推荐使用的互补片段组合及其光谱特点［10］见表1。

表1 推荐使用的互补荧光片段组合
3 BiFC的应用特点
基于BiFC的原理和互补片段的特性，BiFC技术的应用具有如下特点：
(1)在活细胞生理环境中直接、原位显示蛋白质相互作用产物。

(2)不同的双分子荧光复合物之间的光谱差异能够满足以不同的颜色在同一细胞中同时显示多种蛋白质间相互作用的需要。

（3）BiFC分析适用于可形成二聚体或共价结合的蛋白质间的相互作用, 包括肽、核内蛋白、泛素家族蛋白、信号蛋白、酶复合物、膜蛋白、核酸结合蛋白、植物蛋白、植物病原体。

能鉴定新的蛋白质间的相互作用而无需了解其相互作用有关结构基础的先验知识。

（4）荧光蛋白片段与待检蛋白构成的融合蛋白在哺乳动物细胞、植物、微生物中都获得了成功的表达。

（5）双分子荧光复合物的形成不需要外加底物和辅助因子，使蛋白质相互作用的检测对细胞的干扰降低到最小程度。

（6）BiFC具有的灵敏度足以检测与内源性表达水平相当的蛋白质间的相互作用，从而使实验结果更真实地反映天然蛋白的特性。

（7）除普通荧光显微镜外，利用BiFC进行蛋白质相互作用分析不需要特殊仪器，实验结果也不需要进行复杂的数据处理或荧光校正。

4 BiFC的应用现状
4.1 用于蛋白质相互作用的亚细胞定位
不同蛋白质通常分布在细胞的不同部位，成熟蛋白质必须在特定的细胞部位才能发挥其生物学功能。

细胞周期的调控过程、细胞的信号转导和转录调控，都依赖于蛋白质空间位置的变化和运动。

利用BiFC分析能够获取活细胞中蛋白质相互作用复合物的亚细胞定位信息，从而为我们推断蛋白质的生物学功能提供必要的基础。

利用BiFC对多种不同结构的转录因子之间的相互作用及其亚核定位的研究发现，在多数情况下，转录因子相互作用形成的复合物在胞核的分布相对于未发生相互作用时发生明显改变，由此证实了转录因子之间的相互作用对其亚核定位具有调控作用［6,11-12］。

在蛋白质相互作用复合物亚细胞定位的调控研究方面，BiFC也显示出强大的优势。

Hu CD等发现Jun与转录激活因子ATF2相互作用形成的异源二聚体在应力活化蛋白激酶刺激下从胞浆易位到胞核［6］。

BiFC还应用于蛋白质复合物向不同的亚细胞区域募集的可视化研究，如鸟嘌呤核苷酸交换因子GBF1与ADP
核糖基化因子ARF1形成的复合物在布雷菲德菌素A的刺激下向高尔基体募集［13］；BCL2家族蛋白BIF1和BAX 相互作用产物在细胞凋亡诱导下重新定位于线粒体［14］。

4.2 在单细胞中同时显示多种蛋白质间的相互作用
利用不同的双分子荧光复合物之间的光谱差异，在单细胞中以不同颜色同时显示多种蛋白质间的相互作用产物，称为多色BiFC分析［7］。

多色BiFC分析的主要应用为：（1）利用不同的互补片段组合显示多个二聚化蛋白复合物在一细胞中的分布。

(2)利用某些荧光蛋白片段具有两个以上互补片段的多重互补特性，研究多个功能各异的蛋白质与共同的相互作用配偶体之间竞争结合。

（3）通过比较具有不同光谱特点的荧光复合物之间的相对荧光强度，确定多个蛋白质相互作用复合物形成的相对效率。

Fos、Jun以及转录激活因子ATF2三者的所有配对组合均能发生二聚作用，在细胞中调节不同的基因转录。

通过多色BiFC分析对Fos、Jun及ATF2之间交互作用相对效率的比较表明，在哺乳动物活细胞中，bFos-bJun异源二聚体形成的效率比bFos-bATF2和bJun-bATF2更高［7］。

在Myc/Max/Mad转录因子调节网络中，Myc和Mad家族蛋白均通过与Max蛋白的二聚作用分别实现对细胞生长和增殖的正向和负向调节，Myc和Mad家族蛋白同时与Max发生二聚作用的竞争结果最终决定Myc/Max/Mad网络对细胞增殖的调控。

Grinberg 等［12］利用多色BiFC对Max-bMyc和Max-Mad二聚体形成的相对效率进行分析，发现Mad3-Max异源二聚体形成效率低于bMyc- Max，而Mad4-Max异源二聚体形成效率高于bMyc- Max，从而揭示Mad3、Mad4对细胞生长增殖的不同调控机制。

4.3 鉴别酶-底物复合物
在酶-底物的相互作用中，底物特异性以及酶作用部位的识别有助于其新功能的发现。

Blondel［15］等利用BiFC
技术研究泛素E3连接酶Grr1与胞质分裂调控因子Hof1在酿酒酵母有丝分裂期的相互作用，发现Grr1诱导的Hof1降解是酵母胞质分裂过程中引起肌动球蛋白收缩的重要步骤。

BiFC也成功用于激酶、鸟嘌呤核苷酸交换因子与底物相互作用的鉴定［13,16］。

4.4 信号转导级联
借助于BiFC技术，许多信号蛋白分子在信号转导网络中的相互作用研究也不断深入。

转录因子SMAD家族是转化生长因子TGF-β的细胞内信号转导分子，通过BiFC分析发现，SMAD3与SMAD4结合形成的异聚体进入胞核，发挥对靶基因的调节作用；而SMAD3与AKT/PKB的结合却阻止其向核转运［17］。

BiFC技术对于研究细胞膜环境对膜蛋白相互作用的潜在影响也具有独特的价值［18-19］，发现一些与人们预期相反的实验结果，如膜蛋白的流动性既不会扰乱发生于其中的相互作用的特异性，也不影响荧光蛋白片段的结合。

4.5 翻译后修饰
许多蛋白质之间的相互作用取决于特定的翻译后修饰，如溴区包含蛋白Bromodomain家族成员BRD2 与乙酰化组蛋白H4之间的结合必须以BRD2含有溴基域、同时组蛋白H4具有含乙酰化作用位点的尾部结构为前提［20］。

ERGIC53受体与组织蛋白酶C或组织蛋白酶Z之间的相互作用必依赖于ERGIC53受体的lectin结合域以及配体的糖基化［21］。

因此，通过荧光互补现象的观察能够直接检测蛋白质相互作用所必需的特定的翻译后修饰是否发生。

4.6 相互作用配偶体的筛选
基于BiFC进行蛋白质相互作用配偶体筛选的优势在于不仅可在活细胞生理环境中检测目标蛋白的相互作用，并且能直接反映各种刺激因素对相互作用的影响。

其主要局限为不同实验条件下蛋白表达水平的差异可能影响鉴定结果。

总的来说，BiFC极有希望成为特定细胞环境中相互作用蛋白质配偶体的鉴定方法，也可用于调控蛋白质相互作用的合
成分子或细胞因子的鉴定。

Remy［22］等采用基于BiFC的基因库筛选方法，已筛选出AKT/PKB的作用配偶体Ft1蛋白。

4.7 泛素与蛋白底物共价结合的可视化研究
泛素及其类似物(ubiquitin-like modifiers，ubls)与各种底物蛋白形成共价结合以后，通过介导蛋白质降解以及改变蛋白质的细胞定位、蛋白质的酶活性、蛋白质之间的相互作用影响这些底物的功能与活性。

泛素/ubls与靶蛋白质之间的共价结合能够促进与其融合的荧光蛋白互补片段结合而形成荧光复合物。

尤其是当细胞内存在大量未修饰蛋白质的高表达时，利用BiFC能够选择性地显示那些发生泛素化修饰的蛋白质小亚群。

Jun蛋白与泛素家族不同成员相互作用的BiFC分析显示［23］，Jun蛋白与泛素的共价结合使Jun蛋白从核转移到胞浆溶酶体小囊泡，Jun蛋白与泛素类似物SUMO1的结合使Jun蛋白从核质和核仁转运到亚核部位，并且Jun蛋白与泛素、SUMO1的共价结合产物在同一细胞内的分布无重叠。

利用BiFC技术对泛素/ ubls与蛋白底物结合产物进行可视化，将成为研究活细胞生理环境中蛋白底物的泛素化及其对蛋白底物生理功能调节作用的有力工具。

5 问题与展望
从2002年首次报道以来，BiFC技术在理论基础和应用方面取得了很大进展，但作为一种新近发展的用于蛋白质间相互作用研究的方法，BiFC技术本身还存在一些局限［10, 24］，如互补片段之间可能发生不依赖蛋白质间相互作用的自发结合而产生背景荧光；互补片段重新组装形成成熟的生色团往往需要数小时，限制了BiFC技术对蛋白质相互作用的实时检测；互补片段结合的可逆性尚存在争议等。

可喜的是，经过相关领域科学家的努力，上述问题的解决已初现曙光。

大量研究证实来源于EYFP的YN155-YC155是一对特异性较高的互补片段，在其标记的蛋白质发生相互作用时互补效率很高，反之荧光非常微弱［6］。

Demidov［9］等通过克隆EGFP的1-158、159-238氨基酸序列作为互补片段研究核酸杂交，在数分钟后观察到荧光，表明氨基末端片段内生色团的自身催化和成熟能够在数分钟内完成。

Anderie等发现actin/actin双分子荧光复合物具有可逆性［25］。

这些研究表明BiFC完全可能用于蛋白质相互作用的实时研究及其动力学特性分析。

我们相信，随着BiFC基础理论研究的深入和新的性能优异的互补片段的发掘，BiFC 技术必将在蛋白质相互作用以及翻译后修饰的研究中具有更加广泛的应用前景。

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