国家重点基础研究发展计划

国家重点基础研究发展计划

（973计划）课题1任务书

一、研究内容

在我国畜牧养殖业高速发展下, 家畜寄生虫病问题日益凸显。家畜寄生虫病分布广泛、危害严重，给畜牧业造成重大经济损失；已成为制约农业发展、农村进步和农牧民增收的重要因素。作为一类特殊的动物，家畜寄生虫的生活史很复杂，多数寄生虫不仅存在“有性”与“无性” 阶段的世代交替，还发生不同生长发育阶段的转换，其感染宿主的能力只在特定的生长发育阶段获得，并发生明显变化。本课题针对家畜寄生虫感染力变化这一关键科学问题，分别以代表性捻转血矛线虫、片形吸虫和棘球蚴为对象，进行如下主要研究内容，期望在家畜寄生虫感染力变化研究方面取得突破。

研究内容：

1.捻转血矛线虫感染性相关分子的鉴定与功能：

（1）捻转血矛线虫感染性相关分子的鉴定与功能：用比较蛋白组学等技术对不具有感染性的第2期幼虫（L2）和具有感染性的第3期幼虫(L3)进行分析，寻找这两个阶段虫体的差异性表达蛋白；鉴定与感染性有关的基因并研究其功能。

（2）捻转血矛线虫TGF-β样生长因子信号通路中重要基因的结构和功能：分离、鉴别捻转血矛线虫TGF-β样生长因子信号通路中重要基因；测定上述重要基因在该虫不同发育阶段的时空表达谱；通过RNAi等技术来确定这些基因的功能及其与捻转血矛线虫感染性的关系。

2. 片形吸虫感染性相关重要功能分子的鉴定及功能：

（1）片形吸虫感染性相关基因的鉴定及功能：比较分析片形吸虫虫卵、毛蚴、尾蚴、囊蚴及成虫的mRNA转录组，筛选鉴定在感染期特异表达的mRNA 分子并研究其功能。

（2）片形吸虫感染性相关的miRNAs的鉴定及功能：比较分析片形吸虫不同生长阶段的miRNAs，筛选鉴定在感染期特异表达的miRNA分子并研究其功能。

3. 棘球蚴感染性相关基因的鉴定及功能：

应用已建立的体外3D培养模型培养棘球绦虫原头蚴；在培养的不同时间点取样，实时、高通量分析与原头蚴感染性及发育相关基因的表达，筛选出调控原头蚴感染性、发育的重要基因;应用细粒棘球绦虫原头节体外培养及RNAi技术，研究Wnt/β-catenin信号转导通路及MicroRNA分子在细粒棘球绦虫节片及生殖细胞发育过程的作用及调控机制。

创新点和特色：

运用寄生虫学、分子生物学和生物信息学等技术手段，开展捻转血矛线虫、片形吸虫和棘球蚴等寄生虫感染性变化的分子基础研究，发掘并确证与寄生虫感染力相关的新基因，研究不仅可从理论上更深入的了解寄生虫感染力变化的分子基础，还可从技术上支撑与促进我国寄生虫病的防控技术的发展，满足畜禽健康养殖与食品安全的国家需求。

二、预期目标

1. 鉴定与捻转血矛线虫感染性相关的主要分子并解析其功能。阐明捻转血矛线虫TGF-β样生长因子信号转导通路对捻转血矛线虫感染性的调控机理。

2. 发现并鉴定与片形吸虫感染性相关的重要miRNAs及基因，并阐明其功能。

3. 发现并鉴定与棘球蚴感染性调控有关的重要miRNAs及基因，阐明其功能；探明棘球蚴包囊薄片层形成机理。

4. 揭示Wnt/β-catenin信号转导通路在细粒棘球绦虫节片发育过程的作用及调控机制。

5. 发表SCI收录论文12～15篇，申请国家发明专利2～3项，培养学术带头人1～2名、学术骨干2～3名、博士后1～2名、博士及硕士研究生12～15名。

三、研究方案及技术路线

研究方案：

1. 捻转血矛线虫感染力相关分子的鉴定与功能及TGF-β信号传导通路中重要基因的结构和功能研究：

（1）捻转血矛线虫感染力相关分子的鉴定与功能：

用比较蛋白组学技术对不具有感染性的第2期幼虫（L2）和具有感染性的第3期幼虫(L3)进行分析，寻找这两个阶段虫体的差异性表达蛋白；对这些蛋白进行质谱分析和生物信息学分析；对可能与虫体感染力相关的分子进行基因克隆和表达；用抗体封闭L3相应蛋白、用RNA干扰抑制L3相应基因的表达，观察处理后的L3对CO2的活化刺激的反应性能（脱鞘率、蛋白组等）的变化。

（2）捻转血矛线虫TGF-β样生长因子信号通路中重要基因结构的结构和功能研究：

捻转血矛线虫TGF-β样生长因子信号通路中重要基因结构的结构研究：

分离、鉴别捻转血矛线虫TGF-β样生长因子信号通路中重要基因(daf-1, daf-3, daf-4, daf-5, daf-7, daf-8, daf-14)的全长cDNA, 基因组的DNA以及启动子DNA 序列，用生物信息学对这些DNA序列的结构进行分析并与来自其它生物种系的同源基因的结构进行比较以确定这些基因的结构特征。

TGF-β样生长因子信号通路重要基因表达的时空特征：

测定上述重要基因在该虫不同发育阶段的转录水平，检测这些基因编码的蛋白质在捻转血矛线虫中分布的部位。应用秀丽新杆线虫的转基因技术来研究启动子在基因定位中的作用。

TGF-β样生长因子信号通路重要基因功能的研究：

通过RNA干扰技术来确定这些基因在捻转血矛线虫生长发育过程中的重要性；通过异种基因救援法来确定这些基因与秀丽新杆线虫同源基因在功能上的相似性以推测其在捻转血矛线虫生长发育中可能发挥的作用。

2.片形吸虫感染力相关重要功能分子鉴定及功能研究：

（1）片形吸虫不同发育阶段的转录组学研究：比较分析片形吸虫虫卵、毛蚴、尾蚴、囊蚴及成虫的mRNA转录组，筛选发育阶段特异表达的mRNA分子，分析差异分子的表达和组织分布特征；

（2）片形吸虫不同发育阶段的miRNAs研究：比较分析片形吸虫虫卵、毛蚴、尾蚴、囊蚴及成虫的miRNAs，筛选阶段特异表达的差异表达的miRNAs，并分析差异分子的表达和组织分布特征；

（3）差异表达的mRNA和miRNAs的功能鉴定：各选择几种已鉴定的mRNA和miRNAs，在沉默或过表达的情况下，重点研究它们对由尾蚴发育为囊蚴的影响，并通过动物实验研究其感染力的变化。

3. 棘球蚴发育机理及棘球绦虫生殖器官生长和退化中功能基因的动态程序化表达规律研究：

基于原头蚴与肝细胞体外3D共培养的原头蚴发育的研究：

（1）定期收集培养的原头蚴进行分析：原头蚴用FDA/PI染色后显微镜下观察计数，计算其成活率、外翻率、成囊率；同时，测量囊泡的直径，绘制相应生长曲线图。

（2）用免疫荧光染色法分析囊泡特异性抗原的表达，包括Em2、EmP2。

（3）原头蚴体外培养发育为囊泡的直径大于3 mm后，用PGI糖酵解法和蛋白印迹法检测囊泡分泌产物。

（4）对培养成囊原头蚴的囊液蛋白质使用阴离子交换层析法进行分析。洗脱的组分进一步通过SDS-PAGE分离、条带回收，测定蛋白质的氨基酸排列顺序，参照数据库对分离的蛋白进行分析。

（5）培养成囊原头蚴的囊壁细胞的分离：采用机械剪碎及酶消化法进行，分离得到的细胞进行增殖能力分析。提取细胞蛋白，进一步通过SDS-PAGE分离、条带回收，并测定蛋白质分子的氨基酸排列顺序，参照数据库对分离的蛋白进行分析。

（6）定期收集培养的囊泡，分析其转录组基因的表达，筛选出不同时期差异表达的基因，并分析其对原头蚴发育的调控。

肝细胞-原头蚴之间相互作用研究：

（1）定期对培养的肝细胞用AO/EB染色后显微镜下观察计数，计算其成活率并绘制相应生长曲线图。

（2）用免疫荧光染色法测定肝细胞特异性白蛋白的表达。

（3）Periodic acid-Schiff (PAS)染色法进行肝细胞糖原染色分析。

（4）定期收集细胞培养的上清液，用ELISA试剂盒进行甲胎蛋白测定，分