2020版高考生物复习第1讲无菌操作技术教学案苏教版(选修1)

第1讲无菌操作技术

[考纲展示] 1.微生物的分离和培养 2.某种微生物数量的测定 3.培养基对微生物的选择作用

考点一| 微生物的分离和培养

1．相关技能、技术和方法

(1)无菌操作的技能——灭菌

①分类：实验室常用高温处理达到灭菌效果，包括干热灭菌和湿热灭菌。

②作用：微生物分离和培养的基础。

③关键：防止外来杂菌的入侵。

(2)配制培养基

①培养基概念：

为人工培养微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养物质。

②分类：按化学性质的不同分为天然培养基和合成培养基。

(3)接种微生物

①接种：指在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。

②接种方法和常用工具(连线)

接种方法常用工具

Ⅰ.涂布平板接种a．接种针

Ⅱ.穿刺接种 b．接种环

Ⅲ.斜面接种 c．玻璃涂布器

Ⅳ.平板划线接种

答案：Ⅰ－c Ⅱ－a Ⅲ－b Ⅳ－b

2．大肠杆菌的接种与分离培养

(1)配制牛肉膏蛋白胨培养基

其操作步骤：配制培养基→调节pH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面。

(2)斜面接种和培养大肠杆菌

①主要目的：菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。

②主要步骤：准备接种→接种环灭菌→试管口灭菌→挑取少许菌种→划线接种→在37_℃恒温箱中培养大肠杆菌24 h→将增殖的菌种放置在冰箱的冷藏室中(4 ℃)保存。

(3)平板划线分离和培养大肠杆菌

①平板的作用：培养、分离细菌等微生物。

②平板划线法是指用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。

[思考回答]

1．微生物接种的核心是什么？

提示：防止杂菌污染，保证培养物的纯度。

2．如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析接种的具体方法。

(1)获得图A和图B效果的接种方法分别是什么？

提示：图A效果是稀释涂布平板法，图B效果是平板划线法。

(2)某同学在用A方法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什么？为了防止杂菌污染，有同学建议加入抗生素，你觉得可以吗？并说明理由。

提示：菌液浓度过高(土壤溶液稀释不够)。不可以，因为抗生素不但杀灭杂菌，而且也可以杀灭大肠杆菌，因此在培养基上不可以加入抗生素。

1．选择无菌技术的原则

(1)考虑无菌技术的效果：灭菌的效果比消毒要好。

(2)考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能灭菌。

2．微生物的培养基

(1)培养基的成分

◎考法1 考查无菌技术和培养基成分及分类[解题指导] 关于培养基的理解

1．(2019·江西赣中南五校第一次联考)下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题。

(2)若根据用途划分，该培养基属于__________(填“选择”或“鉴别”)培养基。若要用上述培养基来筛选出土壤中的尿素分解菌，培养基的营养成分必需怎样更改？________________，并用__________作为指示剂。

(3)在微生物培养的过程中，为防止杂菌污染，需要对培养基和培养皿进行__________；操作者的双手需要进行清洗和__________。

(4)图1和图2是培养某细菌的结果图，其对应的接种方法分别是：______________和______________，这两种方法接种后培养基上都可以得到由单个细胞繁殖所形成的__________。

图1 图2

解析：(1)大肠杆菌只能从环境中摄取有机物，不能自己合成有机物，属于分解者。(2)该培养基中含有指示剂，属于鉴别培养基。尿素分解菌可以分解尿素，而其他微生物不能，因此可将培养基中的蛋白胨改为尿素用于筛选土壤中的尿素分解菌，并用酚红作为指示剂，尿素分解菌分解尿素产生了NH3可使酚红变红。(3)培养微生物时，培养基和培养皿需要灭菌，操作者双手需要进行消毒。(4)图1采用的是稀释涂布平板法，图2采用的是平板划线法。单个微生物细胞繁殖所形成的细胞群叫菌落。

答案：(1)分解者(2)鉴别将蛋白胨改成尿素酚红(3)灭菌消毒(4)稀释涂布平板法平板划线法菌落

2．某研究小组研究了不同浓度的抗生素A对大肠杆菌生长的影响，实验结果见如图1。回答下列相关问题：

(1)该培养基为大肠杆菌提供的主要营养物质有碳源、水、无机盐、________四类，而配置该培养基时，通常加入________作为凝固剂。

(2)为了确保利用________________法接种大肠杆菌时，形成一层菌膜，则对菌种的稀释倍数________。另外，在培养和接种大肠杆菌时要特别注意进行__________操作。根据实验结果，选出对大肠杆菌抑制作用最明显的抗生素A浓度的依据是

_________________________________________________________________

________________________________________________________________。

(3)为减少实验误差，每一浓度的抗生素A还要制备________。

(4)该研究小组运用上述实验方法还研究了相同浓度的a、b、c三种不同抗生素对大肠杆菌生长的影响。请在图2中图示这一处理方案(可模仿图1加以必要的注解)。

解析：(1)微生物生长繁殖所需要的四类主要营养物质是水、无机盐、碳源和氮源。该实验所用的培养基为固体培养基，常用的凝固剂是琼脂。

(2)图中接种大肠杆菌时所使用的接种方法是稀释涂布平板法，为了得到菌膜，稀释倍数不能太大。接种和培养大肠杆菌的关键是无菌操作。据图1分析，⑤号圆纸片的抑菌圈最大，说明该浓度的抗生素A对大肠杆菌抑制作用最明显。

(3)为减少实验误差，每一浓度的抗生素A还要制备多个圆纸片进行重复实验。

(4)该方案的自变量为相同浓度的a、b、c三种不同抗生素，还应有空白对照，注意在图中要标记清楚，具体图解见答案。

答案：(1)氮源琼脂(2)稀释涂布平板不能太大无菌透明圈越大，抑制效果越明显(3)多个圆纸片(4)图示见如图所示

◎考法2 考查微生物的分离和培养

3．(2014·全国卷Ⅱ)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：

(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是

____________________________________；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为________。

(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过________灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_______________________________________________________________。

(3)示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。

(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________的利用率。

解析：(1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取灭菌后的空白平板先行培养一段时间。0.1 mL稀释液中平均有(39＋38＋37)/3＝38个活菌，则每毫升稀释液中活菌的数目为38/0.1＝380，则稀释前每毫升水样中活菌数目为380×100＝3.8×104，则每升水样中活菌数目为3.8×104×1 000＝3.8×107。

(2)接种环、接种针等金属用具可直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，以达到迅速彻底灭菌的目的。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。

(3)比较图A和图B可以看出：A培养基中细菌的分布呈线性，是用平板划线法接种培养后得到的结果；B培养基中细菌均匀分布，是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。

(4)振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高了营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。

答案：(1)检测培养基平板灭菌是否合格 3.8×107(2)灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落(3)B (4)溶解氧营养物质

考点二| 微生物的分离和计数

1．分离特定微生物的知识准备

(1)区分涂布平板法和混合平板法

①区分两种平板法过程图

②结果不同

a．涂布平板法：细菌菌落通常仅在平板表面生长。

b．混合平板法：细菌菌落出现在平面表面及内部。

③目的相同：分离各种目的微生物。

(2)选择培养分离

①原理：不同微生物有不同的营养需求或对某种化学物质有不同的敏感性。

②方法：针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。

③用途：从众多微生物中分离出特定的微生物。

(3)菌落

①概念：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。

②特征：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以作为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。

2．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

(1)培养基

采用唯一氮源为尿素的培养基。

(2)统计菌落数目

统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。

(3)实验流程

土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。

3．纤维素分解菌的筛选

(1)原理

纤维素分解菌

↓

?

??刚果红纤维素―→红色复合物――――→纤维素酶红色消失，出现透明圈。 (2)筛选方法：刚果红染色法。

(3)培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

(4)实验流程 土壤取样：富含纤维素的环境

↓ 选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度

↓ 梯度稀释：制备系列稀释液

↓ 涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

↓ 挑选产生：产生透明圈的菌落

4．显微镜直接计数法

(1)原理：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

(2)缺点：不能区分死菌还是活菌。

(3)1 mL 培养液中菌体的总数换算公式为：

①16×25型的血球计数板：1 mL 悬液中待测标本(菌体)数＝100小方格内菌体数100

×400×104×稀释倍数。

②25×16型的血球计数板：1 mL 悬液中待测标本(菌体)数＝80小方格内菌体数80

×400×104×稀释倍数。

[思考回答]

1．选择菌落数时，若得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板是否一定正确？并说明理由。

提示：不一定。如得到3个平板，菌落数分别为200、34、240，虽然菌落数均在“30～300”，但由于34与另外两个平板上的菌落数差异较大，应找出原因并重新实验。

2．研究人员用含有刚果红的培养基培养纤维素分解菌时，筛选到了几株有透明降解圈的菌落如图所示。据图回答以下问题：

(1)简述透明圈的形成过程。

提示：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，形成透明圈。

(2)推测与图中透明圈大小有关因素主要是什么？降解纤维素能力最强的菌种是哪种？

提示：纤维素酶的产量和活性。菌落①。

1．平板划线法在不同阶段灼烧接种环的目的

(1)第一次操作：杀死接种环上原有的微生物。

(2)每次划线之前：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。

(3)划线结束后：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

2．稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目“低”。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。而显微计数法由于不能区分死菌与活菌，故所得数值可能比实际值“偏高”。

3．平板划线法只适用于微生物的提纯，不适用于微生物的计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。

4．目的微生物选择的三种方法

(1)利用平板划线法或稀释涂布平板法接种在固体平板培养基上，根据目的微生物特定的菌落特征挑选目的微生物。

(2)利用选择培养基直接筛选目的微生物。

(3)利用鉴别培养基鉴别筛选目的微生物。

◎考法1 微生物的分离与计数

1．(2018·全国卷Ⅰ)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。

回答下列问题：

(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。

(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有____________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有____________(答出两点即可)。

(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_________________________。

(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：

甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是

_________________________________________________________________

_______________________________________________________________。

解析：(1)在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。若M培养基是用于真菌的筛选，则应加入链霉素以抑制细菌的生长，其属于选择培养基。(2)马铃薯浸出液中含有淀粉、蛋白质、脂质、无机盐、水等多种物质，因此，除氮源外其中还有微生物生长所需要的碳源、无机盐等营养要素。进入细胞的氮源可参与合成蛋白质、核酸(DNA、RNA)等含氮的生物大分子。(3)加入显色剂碘液后，淀粉遇碘变蓝，而淀粉的水解产物则不发生这种反应。若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，土壤中能产生淀粉酶的微生物可将淀粉分解，菌落周围就会出现透明圈，这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选能产淀粉酶的微生物了。(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，结果的重复性太差，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。

答案：(1)细菌选择

(2)碳源、无机盐蛋白质、核酸

(3)碘液淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈

(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差

2．为研究“某品牌酸奶中乳酸菌数量及其对抗生素耐药性情况”，某同学进行了如下实验。请分析回答下列问题：

(1)配制的细菌培养基除了含有水、碳源、氮源和无机盐等主要营养成分外，还应加入适量的________和琼脂。在培养基各成分溶化与灭菌之间，要进行的是________。

(2)接种微生物的方法有很多，图中过程①②③所示的方法为______________。用该方法统计样本菌落数后，所得数据需要乘以10n后，才可表示乳酸菌的数量(单位：个/mL)，这里的n＝________。用该方法统计样本菌落数时，同时需要做A、B、C三个培养皿，原因是_________________________________________________________________

_______________________________________________________________。

(3)为了检测乳酸菌对抗生素的敏感性，取该单菌落适当稀释，接种于固体培养基表面，在37 ℃培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。将分别含有A、B、C三种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A________(填“敏感”或“不敏感”)；含C滤纸片周围的透明圈比含A 的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是____________________。

解析：(1)配制的细菌培养基除了含有水、碳源、氮源和无机盐等主要营养成分外，还需要特殊的物质维生素，由于该培养基为固体培养基，因此还应加入适量的琼脂作为凝固剂。在培养基各成分溶化与灭菌之间，要先调pH。(2)接种微生物的方法有很多，图中过程③所示的方法为稀释涂布平板法。用该方法统计样本菌数落时，同时需要做A、B、C三个培养皿，分别计数3次，取平均值，使实验结果更加准确可靠。用该方法统计样本菌落数后，所得数据需要乘以10n后，才可表示乳酸菌的数量(单位：个/mL)，这里的n＝6。(3)在抗药性检验过程中，如果在含某种抗生素的滤纸片周围出现透明的圆圈，说明此种抗生素可抑制该细菌，因此该致病菌对抗生素A敏感；含C滤纸片周围的透明圈比含A的小，且透明圈出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素C的耐药菌。

答案：(1)维生素调pH (2)稀释涂布平板法 6 分别计数3次，取平均值，使实验结果更加准确可靠(3)敏感抗生素C的耐药菌

◎考法2 考查微生物的选择培养

1．(2017·全国卷Ⅰ)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：

(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是

_________________________________________________________________

________________________________________________________________。

但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是

_________________________________________________________________

_________________________________________________(答出两点即可)。

(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是_____________________________________________________________________ ________________________________________________________________。

(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有

_________________________________________________________________

_______________________________________________(答出两点即可)。

解析：(1)有些细菌能分解尿素是因为这些细菌能产生脲酶，将尿素分解成CO2和NH3。能分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2作为碳源合成有机物，但这些细菌可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是：作为能源物质氧化分解为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料。

(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择尿素作为唯一氮源，这样只有能分解尿素的细菌才能在培养基上生存。若选择“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”作为氮源，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用。

(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，它们可以为细菌生长提供无机营养；同时，KH2PO4和Na2HPO4还可以作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定。

答案：(1)脲酶分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料(2)尿素其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定

真题体验| 感悟高考淬炼考能

1．(2018·全国卷Ⅱ)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：

(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。

(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是

_________________________________________________________________

________________________________________________________________。

(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________________。在

照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。

(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。

(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是

_________________________________________________________________

________________________________________________________________。

解析：(1)在实验室中，能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属材质的实验器具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)巴氏消毒法或高温瞬时消毒法与煮沸消毒法相比，其优点表现为在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。(3)紫外线照射能消毒的原因是其能够破坏微生物细胞中的DNA分子。在利用紫外线照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可强化消毒效果。(4)自来水通常采用氯气消毒。(5)采用高压蒸汽灭菌时，若压力达到设定要求，而温度未达到相应要求，最可能的原因是没有排尽高压蒸汽灭菌锅内的冷空气。

答案：(1)可以(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少(3)破坏DNA结构消毒液(4)氯气(5)未将锅内冷空气排尽

2．(2018·全国卷Ⅲ)回答下列与酵母菌有关的问题：

(1)分离培养酵母菌通常使用____________(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基，该培养基应采用________灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到菌落，菌落的含义是

_________________________________________________________________

________________________________________________________________。

(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进____________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)；若进行厌氧培养，可促进________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。

(3)制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是____________________________________________

________________________________________________________________。

解析：(1)酵母菌为异养型生物，通常使用麦芽汁琼脂培养基培养；培养基常用高压蒸汽灭菌法灭菌；由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称为菌落。(2)酵母菌为兼性厌氧型生物，有氧条件利于其繁殖，无氧条件下其进行酒精发酵。(3)酵母菌分解葡萄糖可产生二氧化碳，使面包松软多孔。

答案：(1)麦芽汁琼脂高压蒸汽由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体(2)菌体快速增殖乙醇产生(3)酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软

3．(2016·全国卷Ⅰ)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：

①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；

②制作无菌平板；

③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；

④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题：

(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。

(2)步骤③中，实验组的操作是

_________________________________________________________________

_________________________________________________________________

________________________________________________________________。

(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________(填“正确”或“不正确”)。

解析：(1)牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。若要完成步骤②，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。(2)该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。(3)若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，导致实验变量不唯一，不能确定实验组平板上的菌落是否仅由教室内不同高度空气中的微生物形成，因此不能求出实验组的菌落平均数。

答案：(1)牛肉膏、蛋白胨琼脂(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间

(3)污染不正确

4．(2016·全国卷Ⅲ)某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：

(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是

_________________________________________________________________

_________________________________________________________________

________________________________________________________________。

(2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有________________和________________。分离纯化时应挑选出____________的菌落作为候选菌。

(3)乳酸菌在－20 ℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的________(填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”)。

解析：(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释，这样既可避免杂菌污染，又可将乳酸菌分散成单个细胞，以便在培养基表面形成单个菌落。(2)乳酸的积累影响乳酸菌的增殖，加入碳酸钙可以中和乳酸菌代谢(无氧呼吸)过程中产生的乳酸，另外，乳酸和碳酸钙反应，进而导致碳酸钙分解形成透明圈，有利于乳酸菌的鉴别和分离。(3)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在3 mL的甘油瓶中，装入1 mL甘油后灭菌。将1 mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20 ℃的冷冻箱中保存。

答案：(1)无菌水泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落(2)鉴别乳酸菌中和产生的乳酸(或酸) 具有透明圈(3)甘油