流式细胞术检测凋亡的方法

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TUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)
检测方法：
固定：多聚甲醛(交联型)
洗细胞 固定细胞/组织
TUNEL/PI双染：
区分凋亡和非凋亡细胞 同时分析细胞周期 Apo-BrdU Kit TdT/BrdU 标记细胞 洗细胞 Anti-BrdU-FITC 染细胞 PI/Rnase处理 洗细胞 洗细胞 PI/Rnase处理 流式分析 流式分析 Apo-DIRECT Kit TdT/FITC-dUTP 标记细胞
加荧光标记的Annexin V和PI 室温、避光孵育5分钟 活细胞 早期凋亡细胞 流式细胞仪检测结果
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细胞膜事件—Annexin V
检测特点：
简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。
注意事项：
细胞制备(如贴壁细胞)或储存时细胞膜的破损会导致PS跨膜分布的改变，造成假阳性； 巨噬细胞或其他细胞吞饮凋亡小体时，Annexin V检测也会阳性。
洗细胞
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TUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)
注意事项：
成纤维细胞、上皮细胞凋亡时并不发生核小体间DNA的断裂(DNA仅断裂为50300kb的大片段即终止)，TUNEL法的灵敏度无法检测出
产品名称 ApoBrdU DNA Fragmentation Assay Kit ApoDirect DNA Fragmentation Assay Kit
产品编号 K401-60 K401-60
规 格 60 tests 60 tests
生产商 Biovision Biovision
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检测中面临的问题
多色流式分析试剂典范
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检测时面临的问题
1. 阳性和阴性质控：
产生误差的原因：
活化Caspase的检测
2. Caspase底物 D2R [(aspartyl)2-rhodamine 110，二门冬氨酰-罗丹明110] –Caspase通用底物
膜通透性高 D2R为非荧光物质 D2R被活化的Caspase剪切后，释放出Rhodamine110，发出绿色荧光
CaspSCREEN 凋亡检测试剂盒对凋亡的分析。
检测特点：
简单 高度敏感 快速(20分钟) 特异性高
加DTT和D2R 37oC 孵育10-20分钟 流式细胞仪分析(FL1通道)
Ex/Em=488/530nm
产品名称 CaspSCREENTM Caspase Screening Kit
产品编号 K200-25 K200-100
规 格 25 tests 100 tests
喜树碱(Campothecin)(2uM)诱导Jurkat 细胞4小时，收集细胞并用 CaspSCREEN Caspase Screening Kit(产品编号：K200-100)染 色，流式分析。
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活化Caspase的检测
2. Caspase底物 检测方法：
收集细胞并重悬于D2R Incubation Buffer(孵育液)中
生产商 Biovision Biovision
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细胞核事件
多色流式分析试剂典范
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亚二倍体峰(凋亡峰)
染料：PI(碘化丙啶)
凋亡细胞比例; 细胞周期分布; 凋亡发生的时相
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亚二倍体峰(凋亡峰)
染料—JC-1(5,5’ 6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)
亲脂性阳离子荧光染料 正常细胞—线粒体内多聚体---红色荧光(Ex:488nm, Em:580/590nm) 凋亡细胞—细胞质内单 体---绿色荧光(Ex:488nm, Em:510/527nm)
FITC(Rhodamine)-VAD-FMK(通用) FITC(Rhodamine)-VDVAD-FMK(Caspase-2) FITC(Rhodamine)-DEVD-FMK(Caspase-3) FITC(Rhodamine)-IETD-FMK(Caspase-8) FITC(Rhodamine)-LEHD-FMK(Caspase-9)
规格 25 tests/100tests 25 tests/100tests 25 tests/100tests 25 tests/100tests 25 tests/100tests
生产商 Biovision Biovision Biovision Biovision Biovision
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Biblioteka Baidu
注意事项：
重悬于孵育缓冲液中
最近研究发现，线粒体膜电位的崩 溃在有些细胞中并不是细胞色素c和 AIF释放的必需条件。
流式分析
FL1:凋亡细胞；FL2:正常细胞
产品名称 MitoCaptureTM Apoptosis Detection Kit
产品编号 K250-25 K250-100
规 格 25 tests 100 tests
膜内----磷脂酰丝氨酸(PS) 膜外----磷脂酰胆碱、鞘磷脂
凋亡细胞(Apoptotic Cell):
膜内----磷脂酰丝氨酸(PS) 膜外----磷脂酰胆碱、鞘磷脂、PS
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细胞膜事件—Annexin V
检测方法：
独立的核 膜破损严重的细胞 晚期凋亡细胞
坏死细胞
收集细胞并重悬于Binding Buffer(结合液)中
注意事项：
固定：乙醇，不能用多聚甲醛。联科公司即将引进小片段DNA高效抽提试剂盒。
对照
(未诱导凋亡)
凋亡
(常规方法抽提)
凋亡
(高效抽提)
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亚二倍体峰(凋亡峰)
注意事项：
试剂的选择---不能用抽提细胞核的试剂：
BD公司的Cycletest Plus DNA Reagent Kit (用去污剂Spermine tetrahydrochloride破膜) Beckman Coulter公司的DNA-Prep Reagent System (用DNA-Prep LPR破膜) 凋亡细胞的核碎片被误认为多个凋亡细胞； 进行有丝分裂的标本破膜后释放出的多个染色体或其聚集体被误认为多个凋亡细胞； 细胞辐射等造成的微核体也可被误认为多个凋亡细胞。
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流式检测细胞凋亡几种方法的比较
2005 年 10月 合肥
多色流式分析试剂典范
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凋亡简介 细胞膜事件 线粒体事件 Caspase事件 细胞核事件 检测中面临的问题
多色流式分析试剂典范
细胞凋亡时活化Caspase-3的检测。
Jurkat 细胞无诱导(A)或用喜树碱诱导6h后，使用CaspGLOWTM FITC Caspase3 Staining Kit(产品编号：K183-100)检测活化的Caspase-3。
检测原理：
荧光标记的Caspase抑制性底物被凋亡细胞 摄取并结合，而正常细胞不能结合该底物。 因此洗涤后，凋亡细胞可检测到荧光，正常 细胞则不能。
喜树碱(CPT)诱导HL-60细胞凋亡， 3小时 后用JC-1检测线粒体膜电位的改变。可见， 凋亡细胞红色荧光降低。
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线粒体膜电位(△Ψm)的崩溃
检测方法：
收集细胞于MitoCapture溶液(含JC-1)中 37oC孵育15-20分钟 离心、去上清
检测特点：
简便； 快速
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活化Caspase的检测
1. 荧光标记的Caspase抑制性底物 注意事项：
荧光标记的Caspase抑制性底物的特异性不够高，在凋亡细胞中可能也会与Caspase 以外的蛋白结合。适用于区分凋亡和坏死的细胞。
产品名称 CaspGLOWTM Green(Red) Multi-Caspase Staning Kit CaspGLOWTM Green(Red) Caspase-2 Staning Kit CaspGLOWTM Green(Red) Caspase-3 Staning Kit CaspGLOWTM Green(Red) Caspase-8 Staning Kit CaspGLOWTM Green(Red) Caspase-9 Staning Kit
非典型性凋亡 操作不当 TUNEL实验时TdT酶因保存不当而失活；染色时出现错误。
解决方法：
设立阳性质控 设立阴性质控 自己制备质控细胞或由公司提供(如TUNEL法试剂盒内包含了阳性和阴性质控细胞)
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检测时面临的问题
2. 凋亡假阳性：
产生原因：
PS的外翻使得凋亡细胞和凋亡小体很容易被邻近的细胞所吸附并被吞噬 吞噬细胞 并非仅为专职的吞噬细胞(如单核和粒细胞)，成纤维细胞或上皮细胞也具吞噬作用。 尤其是实体瘤，常可见在凋亡细胞周围的肿瘤和非肿瘤细胞中有含有凋亡小体的吞噬体。 邻近细胞吞噬凋亡细胞后的残留物中即包含了变化的细胞膜、断裂DNA等凋亡特征物。 即使很轻微的处理，如胰酶消化、机械振荡、细胞刮取等，均会造成PS的外翻。
注意事项：
BrdUTP的掺入率显著高于dUTP，因此检测灵敏度高；而且经济。
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TUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)
凋亡细胞
凋亡细胞
用树碱(CPT)诱导HL-60细胞凋亡，0、120和150分钟时用TUNEL(BrdUTP)/PI双染法检测DNA断裂，同时分析细胞周期。可见凋亡随着诱导时 间的增加而增多，且可知凋亡发生的时相。
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线粒体事件
多色流式分析试剂典范
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线粒体膜电位(△Ψm)的崩溃
发生在凋亡的早期 可能与细胞色素c和AIF的释放相关， 在存在活化Caspase的细胞中持续 一段时间后恢复正常
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线粒体膜电位(△Ψm)的崩溃
核染色质凝缩
★ 线粒体膜电位丧失
凋 亡 启 动
★ 细胞膜PS外翻
凋 亡 小 体 形 成
激 活
★ 核碎片形成
★DNA被切割成低分子量片段
细胞内酸化
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细胞膜事件
多色流式分析试剂典范
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细胞膜事件—Annexin V
正常细胞(Normal Cell):
若凋亡发生在G2, M或S期晚期，DNA含量可能会等同于G0期或S期早期，导致检 测失败； 现有DNA分析软件(Modfit/MultiCycle)的缺陷。
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TUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)
检测原理：
TdT + dUTP/BrdUTP
荧光标记的dUTP /BrdUTP抗体
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凋亡简介
多色流式分析试剂典范
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凋亡与坏死
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凋亡的途径
外源性途径
内源性途径
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凋亡启动
细 胞 内
凋亡早期
凋亡中期
脱水致细胞皱缩
凋亡晚期
Ca2+ 动 员 ★ Caspase
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活化Caspase的检测
1. 荧光标记的Caspase抑制性底物 检测方法：
诱导细胞凋亡
检测特点：
简单； 灵敏
加入荧光标记的抑制性底物 (如FITC-VAD-FMK等) 37oC孵育0.5-1小时 离心、洗涤2次
快速(0.5-1小时)
重悬细胞、流式分析
FITC:FL1；Rhodamine:FL2
生产商 Biovision Biovision
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Caspase事件
多色流式分析试剂典范
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活化Caspase的检测
1. 荧光标记的Caspase抑制性底物 荧光标记的Caspase抑制性底物
膜通透性高；不可逆结合
例证：
化疗后患者骨髓中的非凋亡细胞，主要是单核和巨噬细胞中可发现大量的凋亡小体，且 TUNEL法检测时强阳性。 Bedner E., Li X., et al. 1999. Cytometry 29:191-196