微生物菌种高通量筛选技术及装置-储炬
运用高通量筛选技术优化红霉素A发酵的合成培养基
运用高通量筛选技术优化红霉素A发酵的合成培养基廖建国;洪铭;储炬【摘要】目的设计并优化出一种适用于红霉素发酵的合成培养基.方法利用单因素缺失实验设计来减少培养基组分,然后利用Plackett-Burman实验设计来优化组分浓度.上述实验都是采用高通量方法进行的.结果最初选取了38种与生长和次级代谢相关的物质;然后通过2次单因素缺失实验将培养基组分减少到了19种;最后通过Plackett-Burman实验对19种组分的浓度进行了进一步优化,确定各物质的浓度.5L罐发酵结果表明本研究获得的优化后合成培养基生成的红霉素A产量是采用现有文献报道合成培养基得到红霉素A产量的13.6倍.结论高通量筛选技术是一种快速有效的筛选方法,该方法适合于优化培养基的组分.采用本论文中得到合成培养基可以对红色糖多孢菌的胞内代谢特征和红霉素A合成的关键代谢因素进行深入分析,利用这些代谢特点和影响代谢的关键因素,本文可以更加理性地对红霉素A的发酵过程进行调控,进而提高工业红霉素A产量并降低生产成本.%Objective To design and optimize a synthetic medium for the production of erythromycin A.Methods Single factor deletion experiments were employed to reduce the components of the medium,then Plackett-Burman experiment was carried out to optimize the concentration of each component.All experiments were carried out by a high throughput method.Results The initial medium consists of 38 component related to cell growth and secondary metabolism.Two sequential single factor deletion experiments were conducted,and the number of component was reduced to 19.At last the Plackett-Burman experiment was carried out to optimize the final concentration of these components.The titer was 13.6times higher using this optimized recipe than that of using original medium formula.Conclusion High through-put method is very efficient for synthetic medium optimization.In this study,we have a deeper understanding of the metabolism of the cell and the process of erythromycin production,thus it will help us promote the erythromycin A production and lower the costs.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2018(043)001【总页数】8页(P51-58)【关键词】高通量筛选;单因素缺失实验;红霉素A;红色糖多孢菌;合成培养基【作者】廖建国;洪铭;储炬【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237【正文语种】中文【中图分类】R945红霉素A主要是由红色糖多孢菌合成的，是一种广谱大环内酯类抗生素，它主要被用于治疗革兰阳性菌引起的疾病。
比浊法测定红霉素生物效价及其高通量测定方法探讨
ｃ ，ａ ｃ ｒ ｔ，ｃ ｓ ｅ ｅ ｔ ｅ ａ ｄ ｃ ｕ ｄ ｂ ｐ ｌ ｄ ｉ ａ ｃ ｄ ｆｓ ｅ ｔ ｃ ｔ ｎ ａ ａｙ ｉ． ｙ ｃ ｕ ａｅ ｏ ｔ ｆ ｃ ｉ ｏ ｌ ｅ ａ ｐ ｉ ｎ ｂ ｔｈ ａ ａ ｔ ｄ ｎ ｉ ａ ｉ ｎ ｓｓ — ｖ ｎ ｅ ｎ ｉ ｉ ｆ ｏ ｌ １ Ｙ ｏＲＤＳ Ｗ Ｅ ｙ ｈ ｏ ｃｎ ｒ ｔ ｒ ｍｙ ｉ ； Ｈｉｈ ｔ ｒｕ ｈ ｕ ； Ｂｉｌｇ ｃ ｌ ａ ｕ ； Ｔ ｒ ｉｉ ｔ ｃ ｍｅ ｈ ｄ ｇ ｈ ｏ ｇ ｐ ｔ ｏ ｏ ｉａ ｌ ｅ ｖ ｕ ｂｄ ｍｅｒ ｔ ｏ ｉ
ｔ ｅ ｉｄ ｃ ｔｏ ａ ｔｒｕ ｈ ｎ ｉ ａｉｎ ｂ ｃｅ ｍ． Ｔｈ ｕ ｔ ｒ ｒ ｔ ｓ ｗｅ ｅ ｄ ｔ ｒ ｎ ｄ ｂ ｎ ＥＬＩ Ａ ａ ｅ ． Ｔｈ ｉ ｍ ｆｅ ｙｈ ｏ ｃｎ ｗｅ ｅ ｉ ｅ ｃ ｌｕ ｅ ｂ ｈ ｅｅ ｍｉ ｅ ｙ ａ ｏ ｒ Ｓ Ｒｅ ｄ ｒ ｅ ｔｔ ｅ ｏ ｒｔ ｒ ｍｙ ｉ ｒ ｃ ｌｕ ａｅ ａ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｌ ｔ ｎ ｈｐ ｗｉｈ ｔ ｅ ａ ｏ ｂ ｎ ｅ Ｔ ｅ ｕ ｔ ｒ ｏ ａｅ ｔ ｈ ｔｏ ｔ ｉｅ ｙ ｉ ｈ ｂｔｏ ａｃ ｌｔｄ ｂ ｓ ｄ ｏ ｈ ｅａｉ ｓ ｉ ｔ ｈ ｂｓ ｒ ｅ ｃ ． ｈｅ ｒ ｓ ｌｓ ｗｅ ｅ ｃ ｍｐ ｒ ｄ ｗｉ ｔａ ｂａｎ ｄ ｂ ｎ ｉ ｉ ｎ ｏ ｈ ｉ ｚ ｎ ｎ ｒ ｄ ｔ ｎ ｌｔ ｒ ｉ ｉ ｔｉ ｔ ｏ ｓ ｈ ｅ Ｉ ｔｂｌｓ ｅ ｔ ｏ ａ ｈ ｈ ａ ｔｒｓｉ ｓｏ ｐ ｅ ｉ ｅ ｓ ｏ ｅ ａ ｄ ｔａ ｉｉ ａ ｕ ｂ ｄ ｍｅｒｃ ｍｅ ｈ ｄ ．Ｔ ￣ ａ ｉｈ ｄ ｍｅｈ ｄ ｈ ｓｔ ｅ ｃ ａ ｃ ｅ ｉｔ ｆｓ ｅ ｄ ｎ ｓ ，ｈｉｈ ｅ ｆ ｉｎ ｏ ｓ ｒ ｃ ｇ ｆｃｅ — ｉ
食用菌类栽培中的微生物菌种筛选技术
食用菌类栽培中的微生物菌种筛选技术食用菌是一类富含营养且具有医疗保健价值的食材，近年来在市场上越来越受欢迎。
为了提高食用菌的产量和品质，研究者们致力于开发出更有效的栽培技术。
其中，微生物菌种筛选技术成为了一项重要研究内容。
本文将介绍食用菌类栽培中的微生物菌种筛选技术，并探讨其在食用菌产业中的应用前景。
一、微生物菌种筛选技术的背景随着科学技术的不断进步，人们对微生物的认识也越发深入。
微生物是一类微小而多样的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。
其中，菌种的选择在食用菌类栽培中起到至关重要的作用。
传统的菌种筛选方法耗时、耗力，且效果难以保证，因此研究者们开始尝试利用新的技术手段来优化筛选过程。
二、微生物菌种筛选技术的原理和方法1. 基于遗传学的筛选方法基于遗传学的筛选方法是一种常用且可靠的技术手段。
通过分析菌种的遗传信息，研究者可以了解菌株间的差异，并据此选择适合的菌种用于食用菌的栽培。
这种方法的优势在于能够大规模筛选，并且可以针对不同的菌种进行定制化的研究。
2. 基于代谢产物的筛选方法微生物生长过程中会产生大量的代谢产物，其中一些物质对食用菌的生长和发育具有促进作用。
通过分析菌种产生的代谢产物，可以筛选出具有潜力的菌株。
这种方法需要借助先进的分析仪器和技术，但其结果往往准确可靠。
3. 基于功能基因的筛选方法功能基因是微生物体内执行特定功能的基因，菌种的特殊功能与其基因组密切相关。
通过研究菌种的功能基因组，可以筛选出适用于食用菌生长的菌株。
这种方法在分子生物学和基因工程领域得到广泛应用，通过改变菌株的基因组，可以调控食用菌的生长和产量。
三、微生物菌种筛选技术在食用菌产业中的应用前景微生物菌种筛选技术在食用菌产业中具有广阔的应用前景。
首先，利用微生物菌种筛选技术可以优化食用菌的栽培条件，提高产量和品质。
其次，通过筛选出具有抗病性和适应性的菌种，可以提高食用菌的抗病能力，降低病害发生的风险。
此外，微生物菌种筛选技术还可以改良菌种的生长速度和发育周期，提高菌株的适应性和竞争力。
微生物菌种常规保藏技术规程来源ACCC样本
国家自然科技资源平台微生物菌种常规保藏技术规程（试行）《自然科技资源收集、整顿、保存技术规程研究与制定》项目组二〇〇四年十二月十日目次前言 (2)引言 (3)1范畴 (4)2定义 (4)3基本原则 (5)4办法 (5)附录 A 定期移植保藏法 (6)附录 B 液体石蜡保藏法 (9)附录 C 沙土管保藏法 (11)参照文献 (13)前言本规范由国家自然科技资源平台建设项目提出。
本规范起草单位: 中华人民共和国农业科学院土壤肥料研究所、中华人民共和国食品发酵工业研究院、中华人民共和国兽医药物监察所、中华人民共和国科学院微生物研究所、中华人民共和国林业科学研究院森林保护研究所、中华人民共和国药物生物制品检定所、中华人民共和国医学科学院医药生物技术研究所。
本规范重要起草人: 程池、李金霞、胡海蓉、姜瑞波、顾金刚、周宇光、朴春根、叶强、张月琴、陈敏等。
引言微生物菌种常规保藏是一类重要基本操作技术, 广泛应用于科学研究、教学及生物技术产业, 是保护微生物菌种资源重要手段, 是科研教学及生物技术产业正常运转重要保障。
本规程涉及定期移植保藏法、液体石蜡保藏法和沙土管保藏法三种惯用微生物菌种保藏办法。
制定本规程是为了规范微生物菌种常规保藏技术操作, 加强管理, 以达到保护微生物菌种资源, 运用微生物菌种资源及实现资源共享目。
微生物菌种常规保藏技术规程1范畴本规程规定了微生物菌种常规保藏技术基本原则和办法。
本规程合用于微生物菌种常规保藏工作。
2定义本规程采用下列定义。
2.1微生物菌种资源 microorganism resources指可培养有一定科学意义、具备实际或潜在实用价值古菌、细菌、真菌、病毒、细胞株等及其有关信息数据。
2.2菌种保藏 culture preservation是指将微生物菌种用各种适当办法妥善保藏, 避免死亡、污染, 保持其原有性状基本稳定。
2.3定期移植保藏法 subculturing亦称传代培养保藏法, 涉及斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
微生物菌种高通量筛选技术及装置-储炬
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
固液分离 萃取 脱水 反应
专用深孔板 离心机
2、微型化样品前处理
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础 多通道可调深孔板取样适配器
5、带在线传感器微型反应器研制
800 700 600 500 400 300 200 100
5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
工艺
放大
自动细菌平板稀释仪
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
保藏 活化
初筛 复筛 前处理 检测
工艺
放大
挑4600个克隆/小时
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
保藏 活化
培养
初筛 复筛 工艺 放大 前处理 检测
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
★Stacking Unit 堆叠速率：可调，与输送机自动配合。 堆叠高度：2 - 15板平皿，可调 堆叠桌面：500 ´ 500 mm可扩充 尺寸重量：81cm(L)*49cm(D)*45cm(H),13kg
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
保藏 活化
初筛 复筛 前处理 检测
特异性模型 筛选量
突变仅是前提 筛选才是关键
一、高通量筛选在微生物育种中的重要意义
3、我国菌种筛选技术和装备现状与国际菌种筛选技术存 在相当大差距
我国：传统方法，筛选模式式半个世纪没有明显改进
国际：高通量筛选技术(High throughput screening,HTS)
Traditional screening Flask/tube (single) Volume (10-50 ml)
微生物菌种筛选技术方法研究进展
土 壤 (Soils), 2021, 53(2): 236–242①基金项目：国家自然科学基金项目(41771294)资助。
* 通讯作者作者简介：荣楠(1996—)，女，湖南永州人，硕士研究生，主要从事土壤微生物研究。
DOI: 10.13758/ki.tr.2021.02.003荣楠, 李备, 唐昊冶, 等. 微生物菌种筛选技术方法研究进展. 土壤, 2021, 53(2): 236–242.微生物菌种筛选技术方法研究进展①荣 楠1，李 备2,3，唐昊冶1，林先贵1，冯有智1*(1中国科学院南京土壤研究所，南京 210008；2中国科学院长春光学精密机械与物理研究所，长春 130033；3长春长光辰英生物科学仪器有限公司，长春 130033)摘 要：微生物菌种筛选能帮助人类全面认识地球环境中微生物群落的组成与功能，具有重要的科研价值、生态环境与社会经济效益。
传统的菌种筛选方法过程繁琐、费时费力。
近期新兴的现代菌种筛选方法因其操作简便快捷而成为当前的国际研究热点。
本文综合国内外相关研究进展，重点介绍了传统菌种筛选方法和以基于光学镊子结合拉曼光谱的细胞分选技术、荧光活化细胞分选法、基于激光诱导向前转移技术的细胞分选技术、基于原位培养的细胞分离技术为代表的现代菌种筛选方法的优缺点，并进一步对微生物菌种筛选技术的未来发展做出了初步的展望。
关键词：微生物；菌种筛选；平板筛选；光学镊子；拉曼光谱；流式细胞仪；激光诱导向前转移技术；原位培养 中图分类号：X171；X172 文献标志码：AAdvances in Strain Isolating Technique and Method for MicroorganismsRONG Nan 1, LI Bei 2,3, TANG Haoye 1, LIN Xiangui 1, FENG Youzhi 1*(1 Institute of Soil Science , Chinese Academy of Sciences , Nanjing 210008, China ; 2 Changchun Institute of Optics , Fine Mechanics and Physics , Chinese Academy of Sciences , Changchun 130033, China ; 3 HOOKE Instruments Ltd ., Changchun 130033, China )Abstract: Microbial strain screening can greatly help understand the roles of Earth’s microbiome, and thus has the highscientific merit, as well as the associated ecological and social economic benefits. Although the traditional methods are feasible, their processes for screening strains are tedious and time consuming. Alternatively, the modern screening techniques recently have become a hot spot in worldwide due to the features of convenience and high throughput etc. In this paper, current domestic and international research advances on microbial strain screening, such as laser tweezers and Raman spectroscopy, flow cytometry, laser-induced forward transfer and in situ cultivation were briefly introduced by comparing their advantages and disadvantages against those of traditional methods. Then the prospects of these techniques and methods in future were forecasted.Key words: Microorganism; Strain screening; Plate screening; Laser tweezers; Raman spectroscopy; Flow cytometer;Laser-induced forward transfer; In situ cultivation完整地认识地球微生物群落在生物圈和人类健康中的作用，是解决21世纪人类社会从能源、传染病到农业等诸多领域所面临许多难题的关键[1-3]。
【CN209816144U】一种用于菌群最可能数检测的即用型培养装置【专利】
( 12 )实 用新型专利
(21)申请号 201920177524 .6
(10)授权公告号 CN 209816144 U (45)授权公告日 2019.12.20 ( ESM )同样的发明创造已同日申请发明专利
(22)申请日 2019 .01 .31
(73)专利权人 济南市疾病预防控制中心 地址 250021 山东省济南市槐荫区纬六路 二号
2
CN 209816144 U
说 明 书
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一种用于菌群最可能数检测的即用型培养装置
技术领域 [0001] 本公开属于菌群检测装置领域，具体涉及一种用于菌群最可能数检测的即用型培 养装置。
背景技术 [0002] 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然 被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技 术。 [0003] 水、食品、化妆品和公共场所等公共产品的卫生微生物指标中大肠菌群、耐热大肠 菌群(粪大肠菌群)及大肠埃希氏菌检测包括多管发酵最可能数(MPN)法、滤膜法、平板计数 法、酶底物法等。而其中多管发酵最可能数(MPN)法以其技术难度低、试剂成本低、检测范围 宽等优点获得了广泛应用，特别是在小型实验室应用中优势突出。在我国《GB/T5750 .122006生活饮 用水标准检验方法微生物指标》中 总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希氏 菌 的检验 ，《GB 4789 .3-2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》，《GB 4789 .38-2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数》《，GB/T 18204 .102000游泳池水微生物检验方法大肠菌群测定》《，水和废水监测分析方法(第四版)》中水中 总大肠菌群的 测定和水中粪大肠菌群的 测定等中多管发酵最可能数 (MPN) 法均为第一法 ； 在《化妆品安全技术规范(2015版)》中粪大肠菌群检验《，GB 4789 .39-2013 食品安全国家 标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数》《，GB/T 18204 .4-2013公共场所卫生检验方法第 四部分：公共用品用具微生物》中大肠菌群多管发酵法《，GB-18466-2005医疗机构水污染物 排放标准》附录A(规范性附录)医疗机构污水和污泥中粪大肠菌群的检验方法中多管发酵 最可能数(MPN)法等中均为唯一方法。 [0004] 多管发酵最可能数(MPN)法的基本实验流程包括初发酵、平板分离和复发酵，不同 样本 和不同 检 测项目 具体流程会有一定差异。初发酵 ：以 大肠菌群能发酵乳糖产酸产气的 生化特征为基础 ，利 用内置小倒管 (倒置杜汉氏 管) 的 含乳糖类培养基 (如乳糖蛋白 胨培养 基、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖胆盐发酵培养基 (含中 和剂) 、煌绿乳糖胆盐肉 汤、月桂基硫 酸盐胰蛋白 胨肉 汤 (LST) 、乳糖肉 汤、现隐肉 汤等) 培养受试样本 ，按预定温度 ，培养到预定 时间后观察产酸产气现象。然后初发酵阳性管划线于伊红美蓝琼脂等平板进行平板分离。 平板上大肠菌群产生带或不带金属光泽的深紫黑色、紫黑色、淡紫红色(中心较深)等的菌 落。复发酵试验 ：以 上阳性菌落再次 进行发酵试验 确认阳性结果。部分 项目 流程有一定 调 整 ，如水中耐热大肠菌群会涉及两步初发酵 ，但无复发酵 ；食品中大肠菌群检 测、水中粪大 肠菌群检测等无平板分离过程；食品中大肠埃希氏菌检测复发酵在平板分离之前进行等。 [0005] 目前多管发酵最可能数(MPN)法初发酵和复发酵过程均以装有含乳糖类培养基和 内置小倒管的试管为发酵培养装置，本装置技术简单，成本较低。但发明人发现在使用过程 中往往需要实验人员自行配制液体培养基后分装于耐高压灭菌条件的玻璃试管或塑料试 管中 ，经高压灭菌和去除小倒管中气体后使 用。或者培养基生产商按上述步骤制造 ，或者配
优化易错PCR条件以提高毕赤酵母GAP启动子文库突变效率
优化易错PCR条件以提高毕赤酵母GAP启动子文库突变效率秦秀林;钱江潮;储炬【摘要】高效的随机突变策略对于构建含有丰富突变体的启动子文库至关重要。
为了建立一个突变率适中并能获得较多有益突变子的易错PCR（error-prone PCR，EP-PCR）条件，实现毕赤酵母GAP启动子的高效突变，对EP-PCR反应条件进行了优化。
考察了模板浓度、反应循环数和Mg2+浓度对EP-PCR的产物得率和突变率的影响后，确定了适于GAP启动子突变的EP-PCR条件：模板浓度、反应循环数和Mg2+浓度分别为1 ng/μL、25和10 mmol/L。
优化EP-PCR条件后，GAP启动子突变率为1.1%，连续进行3轮EP-PCR后突变率可达到4.0%。
利用优化后EP-PCR对GAP启动子进行随机突变，筛选了250个突变子，获得5个启动子强度高于野生型GAP启动子的突变体，有益突变达到了2%，可用于构建GAP启动子文库。
%The first important step toward a successful preparation of large and diverse promoter library with desired complexity, is to select a suitable mutagenesis strategy. To generate a promoter library of GAP promoter(pGAP)variants, mutations were introduced using error-prone PCR. After optimization of the conditions for EP-PCR random mutagenes, high mutation(error rate 1.1%)frequence was obtained using 1 ng/μL template and 10 mmol/L Mg2+, in combination with 25 thermal cycles. To increase mutational diversity and reach an appropriate error rate, three consecutive rounds of EP-PCR were carried out under the same conditions. After random sequencing of 10 clones from each round, an overall range of mutation rates from 1.1%to 4.0%was observed. Then, 250clones containing pGAP variants were screened using the highthroughput screening approach in 48-deep-well plates. Among them, 5 mutants exhibited higher fluorescent intensity compared to the wild-type promoter.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】7页(P211-217)【关键词】易错PCR;突变效率;随机突变;毕赤酵母;GAP启动子【作者】秦秀林;钱江潮;储炬【作者单位】广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237【正文语种】中文利用易错PCR（Error prone PCR，EP-PCR）或DNA改组（DNA shuffling）等基因突变技术对基因启动子区进行改造构建启动子文库，并已在原核和真核微生物的代谢工程、功能基因组学和合成生物学中得到了成功应用［1-3］。
一种高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法[发明专利]
![一种高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/30f33ba8be1e650e53ea99dc.png)
专利名称：一种高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法
专利类型：发明专利
发明人：田锡炜,张一凡,杭海峰,王永红,储炬,夏建业,庄英萍申请号：CN202010936756.2
申请日：20200908
公开号：CN111849852A
公开日：
20201030
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种高光学纯L‑乳酸工程菌的构建方法，包括多个步骤，本发明选取拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei NCBIO01)作为出发菌株，参照其全基因组序列，基于CRISPR/Cas9基因编辑方法构建了pNcasA‑△ldhD敲除质粒，无痕敲除D‑乳酸脱氢酶(ldhD)的同时过表达一个L‑乳酸脱氢酶基因(ldhL)，得到一株高光学纯L‑乳酸工程菌，使其L‑乳酸光学纯度从原来的95.6％提高到99％以上，并且生产速率达到5.5g/L/h以上，成为潜在的工业L‑乳酸高效生产菌株。
申请人：华东理工大学,华东理工大学青岛创新研究院
地址：200237 上海市徐汇区梅陇路130号
国籍：CN
代理机构：上海翼胜专利商标事务所(普通合伙)
代理人：翟羽
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南昌链霉菌生物合成梅岭霉素种子制备优化
南昌链霉菌生物合成梅岭霉素种子制备优化陈斌;庄英萍;郭美锦;储炬;张嗣良【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2003(028)011【摘要】以参数相关理论为指导,优化南昌链霉菌生物合成梅岭霉素种子制备工艺.结果表明,培养 20～ 35 h后, pH 7.30～ 7.50,总糖 < 0.35%, pmv > 10%,溶磷 < 100 μ g/ml,菌丝分化启动有利于提高梅岭霉素的发酵效价.【总页数】4页(P641-644)【作者】陈斌;庄英萍;郭美锦;储炬;张嗣良【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室国家,生化工程技术研究中心,上海,200237;西北大学化学工程系,西安,710069;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室国家,生化工程技术研究中心,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室国家,生化工程技术研究中心,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室国家,生化工程技术研究中心,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室国家,生化工程技术研究中心,上海,200237【正文语种】中文【中图分类】R978.1+5【相关文献】1.白色链霉菌JA3453中垩唑霉素生物合成基因簇甲氧丙二酰ACP生物合成基因ozmF的遗传分析 [J], 赵春华;宋丹凤;周秀芬;沈奔;邓子新2.侧链前体3,3-二甲基丙烯酸对梅岭霉素生物合成的影响 [J], 王平;庄英萍;储炬;张嗣良3.高效液相色谱法同时检测南昌霉素和梅岭霉素 [J], 孙宇晖;周秀芬;涂国全;邓子新4.南昌链霉菌中南昌霉素生物合成基因簇的克隆分析及其药物创新潜力 [J], 孙宇晖;刘隽;涂国全;周秀芬;邓子新;5.厦门霉素生物合成基因簇在白色链霉菌及吸水链霉菌FR-008中的异源表达 [J], 张金龙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
红霉素产生菌S.erytheara的基因改造进展
红霉素产生菌S.erytheara的基因改造进展窦海青;陈勇;储炬;庄英萍;张嗣良;张超【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2010(035)008【摘要】红霉素产生菌基因工程改造发展迅速,不仅合成了100多种红霉素结构类似物,而且在提高红霉素产量方面也取得了重要进展.随红霉素产生菌S.erythraea 基因组序列的公布,使基因工程改造红霉素产生菌成为研究的热点.本文综述了采用基因工程手段对红霉素途径中的代谢节点、后修饰酶和聚酮合成酶基因改造的进展.【总页数】4页(P567-570)【作者】窦海青;陈勇;储炬;庄英萍;张嗣良;张超【作者单位】上海市科学技术奖励中心,上海,200235;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237【正文语种】中文【中图分类】R978.1【相关文献】1.红霉素产生菌的诱变和筛选 [J], 王颖2.红霉素产生菌的诱变及培养基优化研究 [J], 左勇;李杨;任永利;鞠帅;谢晖;祁峰3.用近紫外线和氯化锂复合选育柔红霉素产生菌——天蓝淡红链霉菌(S.Coeruleorubidus)高产株的研究 [J], 蒋世春;吴振倡;许玉丽;金红日4.柔红霉素产生菌Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482中dnmV基因的克隆及阻断 [J], 尚珂;谢丽萍;胡又佳;朱春宝;朱宝泉5.代谢工程研究及其在柔红霉素产生菌中的应用 [J], 胡又佳;朱春宝;朱宝泉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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菌种高通量筛选技术
技术路线组成
高通量 前处理技术
高通量分析 检测技术
高通量数据 管理技术
高通量 培养技术
菌种高通量 筛选技术
菌种库 管理技术
高通量液体 处理技术
高通量 转接种技术
高通量克隆 制备技术
菌种高通量筛选技术
分高菌通析种量测资培试源养
通量匹配
限制瓶颈在不断克服和转移
菌种高通量筛选技术
) 菌种高通量筛选技术是一整套高通 量技术的有机整合和合理匹配
D
1.2531 1.3213 1.2577 1.1912 1.0782 1.0589
E
1.2734 1.3073 1.2507 1.2695 1.0468 1.0515
F
1.2567 1.2302 1.2583 1.2445 1.0794 1.0307
G
1.2618 1.2471 1.2718 1.2552 1.0351 0.9434
高通量培养 24孔
技术
48孔
固体培养和菌种保藏
96孔
装液量： 500 —2000 ul
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
可灭菌、 重复使用寿命长、 成本低、 易清洗、 能统一标准、 防交叉污染、 透气性好、 防止水分蒸发
孔板盖
简易接种装置和无菌板盖
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
Screen 20-50/week/lab Manual
Laborious Series
High throughput screening Microtiter plate (12、24、48、
96、384、1536) Volume (10-500 ul)
Screen 1000-10000/week/lab
2500 2000 1500 1000 500
0 1
效价
7
C1
C7
总糖
总糖值
12
10
摇瓶
8
圆柱小瓶
6
12孔板
4
2
0
1
2
3
4
5
菌株
值
还原糖
氮
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1
2
3
4
5
140
120
100
microplate
80
flask
60
40
20
0
1
2
3
4
5
天数
microplate flask
天数
microplate flask
主要解决了微型化培养中的如下问题 供氧 蒸发 无菌 混合 装量
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
pH
供氧能力分析：KLa测定
8.5
8
24孔板 500ml三角瓶
7.5
500ml三角瓶
7
48孔板
6.5
96孔板
6
5.5
5
4.5
4 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
内容提纲
高通量筛选在微生物育种中的重要意义 菌种高通量筛选技术国际进展
国家生化工程中心(上海)的高通量筛选工作 基础
三、国家生化工程中心(上海)的高通量筛选工作基础
微型化 高通量
标准化
Scale up
多尺度菌种表型研究
Scale down
对高通量筛选技术存在认识上的误区
仅注重培养环节高通量，忽略其他步骤匹配和瓶颈的转移 问题 认为微型化只要按比例缩小即可，忽略参数相关性问题 对操作条件的平行性没有足够的认识 对标准化重于最优化的认识不足 高通量筛选是提高成功几率的一种技术手段
自动化
微型化
高通量
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
保藏 活化
初筛 复筛 前处理 检测
工艺
放大
自动灭菌培养基制备机
全自动培养基分装系统
750皿/h
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
保藏 活化
初筛 复筛 前处理 检测
工艺
放大
Filling Unit 分装速率：400 - 1200 dishes/hr 分装量：4 - 45 ml/0.5 - 0.6 sec 平动规格：直径92 - 98 mm可调 高度15 - 21 mm可调 灭菌方式：253.7 nm 紫外线灭菌 尺寸重量：45 cm(L)*30 cm(D)*61cm(H),15 kg
保藏 活化
培养基分装
初筛 复筛 前处理 检测
工艺
放大
二、菌种高通量筛选技术国际进展
12个，30ml
在线多参数测量 微反应器
24个，1ml
24个，5ml
2056 valves , 256 compartments containing bacterial expressing an enzyme
二、菌种高通量筛选技术国际进展
Time(h)
比较24、48、96孔培养 板和500ml三角瓶的 供氧能力
500m 500m 24孔 48孔 96孔
L
L
板
板
板
微孔几何构造与KLa的关系
time 11
12
11
17
28
Kla h-1 25.3 23.1 25．3 16.3 9.9
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
蒸发与交叉污染问题
1、菌种发酵水平是企业产品市场竞争力的体现之一
1、菌种是发酵技术的源头 2、菌种是发酵技术的核心之核心 3、菌种提高不增加设备材料投入
一、高通量筛选在微生物育种中的重要意义
2、育种工作中两大任务：突变与筛选
变异菌种库 筛选目标株
自然选育 人工诱变 推理选育 杂交育种 基因工程 代谢工程 各种组学 系统生物学 合成生物学
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
流场特性
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
OTR 与混合
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
以高耗氧长周期培养微生物为研究 对象，研究微型化培养中技术问题
（头孢菌素C, 红霉素生产菌）
三、国家生化工程中心的特异性模型 筛选量
突变仅是前提 筛选才是关键
一、高通量筛选在微生物育种中的重要意义
3、我国菌种筛选技术和装备现状与国际菌种筛选技术存 在相当大差距
我国：传统方法，筛选模式式半个世纪没有明显改进
国际：高通量筛选技术(High throughput screening,HTS)
Traditional screening Flask/tube (single) Volume (10-50 ml)
培养基
倒平板
出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
初筛 复筛 工艺 放大
保藏
前处理
活化
检测
二、菌种高通量筛选技术国际进展
¾ 微生物菌种筛选手段的发展趋势：
自动化 微型化 高通量
培养基灭菌、倒平板、挑取单菌落、分装发酵培养基、接种、培 养、抽提、参数分析和数据自动收集处理等过程
单元自动化与系统集成自动化
48孔板，培养四天后，不同孔径盖子与培养基蒸发关系
2mm
3mm
4mm
1
2
3
4
5
6
A
1.144 1.0782 1.0629 1.0845 1.0239 1.0094
B
1.2392 1.2355 1.2541 1.2839 1.0577 1.0494
C
1.2694 1.2542 1.2647 1.2515 1.0715 1.0340
56名科学家、10万份土样、历时1年 25%市场
¾ 1984年，Pfizer提出Automation Project. ¾ 1990年，在Nagoya, Japan实施
1万株份/周
我国菌种筛选技术和装备现状与国际菌种筛选技术存在 相当大差距
青霉素：5万——12万（国内）
案
8万——20万（国外）
天数
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
固液分离 萃取 脱水 反应
专用深孔板 离心机
2、微型化样品前处理
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础 多通道可调深孔板取样适配器
5、带在线传感器微型反应器研制
800 700 600 500 400 300 200 100
5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
红霉素：5000——8000/10000(国内)
例
10000——15000（国外）
阿维菌素：4000——8400（国内） 10000以上（国外）
二、菌种高通量筛选技术国际进展
高
通
自动化程度高、功能、进口设备
量 筛
500万元-5000万元
选
投
高通量是相对概念
入
结合国情，逐步推进，手动到自动
50万元-500万元
1、丝状、高耗氧微生物HTS培养技术
单次筛选通量从160株提高到最大12288株的高通量培养装置改造
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础 板数：8×8×2＝128
孔数：128×24＝3072 128×48＝6144 128×96＝12288
微孔板固定架
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
全国发酵工程技术与工艺装备科技创新与产业化 发展交流研讨会
微生物菌种高通量筛选技 术及装置研究
华东理工大学 国家生化工程技术研究中心(上海)
储炬 2013-3-24，上海