微生物菌种高通量筛选技术及装置-储炬

三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
流场特性
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
OTR 与混合
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
以高耗氧长周期培养微生物为研究 对象，研究微型化培养中技术问题
（头孢菌素C, 红霉素生产菌）
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
微型化
高通量
标准化
过程参数检测（重复性）
二、菌种高通量筛选技术国际进展
系统集成自动化
左图4.9×2.3×2.2 m，整个箱体有温湿度控制，箱体内， 条形码阅读器、盖板站、封板器、液体处理装置、摇床、 光度计、离心机、冷藏室等。平行地实现样品准备、运行、 监控768个（16个48孔板）。
高通量筛选技术的起源及应用
¾ 1929，1940s-1950s ¾ Pfizer公司：土霉素的发现
化学效价高通量分析路线
开发了可以与自动化液体处理工作站相匹配的微量化化学分 析路线，筛选通量更高，样品检测体积更小，反应体积从 20ml降到500ul，检测体积从5ml降到100ul，分析时间更 短，1小时之内完成上千份样品分析。&
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
例子:红霉素效价分 析
保藏 活化
培养基分装
初筛 复筛 前处理 检测
工艺
放大
二、菌种高通量筛选技术国际进展
12个，30ml
在线多参数测量 微反应器
24个，1ml
24个，5ml
2056 valves , 256 compartments containing bacterial expressing an enzyme
二、菌种高通量筛选技术国际进展
pH Fig.3 Linear Fit of Data from MPN405
OD
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
3、高通量（微型化）抗生素效价分析方法
生物效价高通量分析方法建立
基于比浊法原理设计生物效价高通量分析方法，使分析时间 从20多小时缩短到4小时，分析样品量从1ml降到10ul，鉴定 菌培养基从30ml降到90ul，一次检测样品数量可达到成百上 千份，而且仅需1人操作，传统生物效价分析，每天每人分 析样品数量50份左右。&
自动化
微型化
高通量
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
保藏 活化
初筛 复筛 前处理 检测
工艺
放大
自动灭菌培养基制备机
全自动培养基分装系统
750皿/h
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
保藏 活化
初筛 复筛 前处理 检测
工艺
放大
Filling Unit 分装速率：400 - 1200 dishes/hr 分装量：4 - 45 ml/0.5 - 0.6 sec 平动规格：直径92 - 98 mm可调 高度15 - 21 mm可调 灭菌方式：253.7 nm 紫外线灭菌 尺寸重量：45 cm(L)*30 cm(D)*61cm(H),15 kg
天数
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
固液分离 萃取 脱水 反应
专用深孔板 离心机
2、微型化样品前处理
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础 多通道可调深孔板取样适配器
5、带在线传感器微型反应器研制
800 700 600 500 400 300 200 Βιβλιοθήκη Baidu00
5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
56名科学家、10万份土样、历时1年 25%市场
¾ 1984年，Pfizer提出Automation Project. ¾ 1990年，在Nagoya, Japan实施
1万株份/周
我国菌种筛选技术和装备现状与国际菌种筛选技术存在 相当大差距
青霉素：5万——12万（国内）
案
8万——20万（国外）
培养基
倒平板
出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
初筛 复筛 工艺 放大
保藏
前处理
活化
检测
二、菌种高通量筛选技术国际进展
¾ 微生物菌种筛选手段的发展趋势：
自动化 微型化 高通量
培养基灭菌、倒平板、挑取单菌落、分装发酵培养基、接种、培 养、抽提、参数分析和数据自动收集处理等过程
单元自动化与系统集成自动化
主要解决了微型化培养中的如下问题 供氧 蒸发 无菌 混合 装量
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
pH
供氧能力分析：KLa测定
8.5
8
24孔板 500ml三角瓶
7.5
500ml三角瓶
7
48孔板
6.5
96孔板
6
5.5
5
4.5
4 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
Screen 20-50/week/lab Manual
Laborious Series
High throughput screening Microtiter plate (12、24、48、
96、384、1536) Volume (10-500 ul)
Screen 1000-10000/week/lab
1、丝状、高耗氧微生物HTS培养技术
单次筛选通量从160株提高到最大12288株的高通量培养装置改造
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础 板数：8×8×2＝128
孔数：128×24＝3072 128×48＝6144 128×96＝12288
微孔板固定架
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
2500 2000 1500 1000 500
0 1
效价
7
C1
C7
总糖
总糖值
12
10
摇瓶
8
圆柱小瓶
6
12孔板
4
2
0
1
2
3
4
5
菌株
值
还原糖
氮
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1
2
3
4
5
140
120
100
microplate
80
flask
60
40
20
0
1
2
3
4
5
天数
microplate flask
天数
microplate flask
D
1.2531 1.3213 1.2577 1.1912 1.0782 1.0589
E
1.2734 1.3073 1.2507 1.2695 1.0468 1.0515
F
1.2567 1.2302 1.2583 1.2445 1.0794 1.0307
G
1.2618 1.2471 1.2718 1.2552 1.0351 0.9434
保藏 活化
培养基分装
初筛 复筛 前处理 检测
工艺
放大
传统方法
传统方法
培养基
倒平板
出发株 诱变等 10-2倍/m稀释in 涂平板 单菌落 接种
保藏
活化
初筛 复筛 前处理 检测
工艺
放大
1/15-30min
高通量方法 （96、384、1536）/min
二、菌种高通量筛选技术国际进展
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
工艺
放大
自动细菌平板稀释仪
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
保藏 活化
初筛 复筛 前处理 检测
工艺
放大
挑4600个克隆/小时
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
保藏 活化
培养
初筛 复筛 工艺 放大 前处理 检测
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
全国发酵工程技术与工艺装备科技创新与产业化 发展交流研讨会
微生物菌种高通量筛选技 术及装置研究
华东理工大学 国家生化工程技术研究中心(上海)
储炬 2013-3-24，上海
内容提纲
高通量筛选在微生物育种中的重要意义 菌种高通量筛选技术国际进展 国家生化工程中心高通量筛选工作基础
一、高通量筛选在微生物育种中的重要意义
H
1.1985 1.1809 1.1578 1.1959 0.9361 0.8578
蒸发量 13%
13%
14.6% 14.3% 27%
28.6%
对比：50/500 ml摇瓶,6天后蒸发量:平均:13.4%,范围: 10.3- 16.2% 结论：采用孔径为2mm的孔板盖可以达到允许的蒸发要求
值
值
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础 高通量（微型化）过程生理参数分析
特异性模型 筛选量
突变仅是前提 筛选才是关键
一、高通量筛选在微生物育种中的重要意义
3、我国菌种筛选技术和装备现状与国际菌种筛选技术存 在相当大差距
我国：传统方法，筛选模式式半个世纪没有明显改进
国际：高通量筛选技术(High throughput screening,HTS)
Traditional screening Flask/tube (single) Volume (10-50 ml)
菌种高通量筛选技术
技术路线组成
高通量 前处理技术
高通量分析 检测技术
高通量数据 管理技术
高通量 培养技术
菌种高通量 筛选技术
菌种库 管理技术
高通量液体 处理技术
高通量 转接种技术
高通量克隆 制备技术
菌种高通量筛选技术
分高菌通析种量测资培试源养
通量匹配
限制瓶颈在不断克服和转移
菌种高通量筛选技术
) 菌种高通量筛选技术是一整套高通 量技术的有机整合和合理匹配
48孔板，培养四天后，不同孔径盖子与培养基蒸发关系
2mm
3mm
4mm
1
2
3
4
5
6
A
1.144 1.0782 1.0629 1.0845 1.0239 1.0094
B
1.2392 1.2355 1.2541 1.2839 1.0577 1.0494
C
1.2694 1.2542 1.2647 1.2515 1.0715 1.0340
★Stacking Unit 堆叠速率：可调，与输送机自动配合。 堆叠高度：2 - 15板平皿，可调 堆叠桌面：500 ´ 500 mm可扩充 尺寸重量：81cm(L)*49cm(D)*45cm(H),13kg
培养基 倒平板 出发株 诱变等 10倍稀释 涂平板 单菌落 接种
保藏 活化
初筛 复筛 前处理 检测
目标：全自动专用装置和技术路线开发
近期：以手动/半自动方式、低成本技术 路线，为自动化技术作准备
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
培养 高通量（微型化）培养技术 前处理 高通量（微型化）样品处理方法
效价分析 高通量（微型化）产物分析方法 生理参数 高通量（微型化）过程生理参数分析
分析
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
Automatic
Laborsaving
Parallel
内容提纲
高通量筛选在微生物育种中的重要意义
菌种高通量筛选技术国际进展
国家生化工程中心高通量筛选工作基础
高通量筛选装置
1
3
2
1 微孔板式反应器 2 微流控式芯片实验室 3 摇瓶形式的微型反应器
二、菌种高通量筛选技术国际进展
¾ 微生物菌种筛选一般流程
Time(h)
比较24、48、96孔培养 板和500ml三角瓶的 供氧能力
500m 500m 24孔 48孔 96孔
L
L
板
板
板
微孔几何构造与KLa的关系
time 11
12
11
17
28
Kla h-1 25.3 23.1 25．3 16.3 9.9
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
蒸发与交叉污染问题
内容提纲
高通量筛选在微生物育种中的重要意义 菌种高通量筛选技术国际进展
国家生化工程中心(上海)的高通量筛选工作 基础
三、国家生化工程中心(上海)的高通量筛选工作基础
微型化 高通量
标准化
Scale up
多尺度菌种表型研究
Scale down
对高通量筛选技术存在认识上的误区
仅注重培养环节高通量，忽略其他步骤匹配和瓶颈的转移 问题 认为微型化只要按比例缩小即可，忽略参数相关性问题 对操作条件的平行性没有足够的认识 对标准化重于最优化的认识不足 高通量筛选是提高成功几率的一种技术手段
高通量培养 24孔
技术
48孔
固体培养和菌种保藏
96孔
装液量： 500 —2000 ul
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
可灭菌、 重复使用寿命长、 成本低、 易清洗、 能统一标准、 防交叉污染、 透气性好、 防止水分蒸发
孔板盖
简易接种装置和无菌板盖
三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础
红霉素：5000——8000/10000(国内)
例
10000——15000（国外）
阿维菌素：4000——8400（国内） 10000以上（国外）
二、菌种高通量筛选技术国际进展
高
通
自动化程度高、功能、进口设备
量 筛
500万元-5000万元
选
投
高通量是相对概念
入
结合国情，逐步推进，手动到自动
50万元-500万元
1、菌种发酵水平是企业产品市场竞争力的体现之一
1、菌种是发酵技术的源头 2、菌种是发酵技术的核心之核心 3、菌种提高不增加设备材料投入
一、高通量筛选在微生物育种中的重要意义
2、育种工作中两大任务：突变与筛选
变异菌种库 筛选目标株
自然选育 人工诱变 推理选育 杂交育种 基因工程 代谢工程 各种组学 系统生物学 合成生物学