由化学合成基因组控制的细菌细胞的产生

由化学合成基因组控制的细菌细胞的产生

我们报道了从数字化基因组序列信息开始的1.08 -巨碱基对支原体JCVI- Sy1.0基因组的设计、合成和组装，并将其移植到摩羯座受体细胞中，以产生仅由合成物控制的新分枝杆菌细胞。IC染色体细胞中唯一的DNA是设计的合成DNA序列，包括“水印”序列和其他设计的基因缺失和多态性，以及在构建过程中获得的突变。新的细胞具有预期的表型特性并且能够连续自我复制。

在1977，Sanger和同事确定了噬菌体X174（1）的完整遗传序列，第一个DNA基因组被完全测序。十八年后，在1995，我们的团队是一个自我复制的细菌的第一个完整的基因序列，Haemophilus influenzae（2）。从这些早期的研究中，读取一系列物种的遗传顺序是指数增加的。在过去的25年中，快速数字化基因组信息的能力已经增加了八个数量级（3）。努力理解所有这些新的基因组信息已经产生了许多新的计算和实验范式，叶图遗传学知识仍然非常有限。没有一个单一的细胞系统具有不同的生物学作用。即使在简单的细菌细胞中，染色体是否包含完整的遗传图谱？Ifso，CabaCeMuleGeEngEngt系统是通过化学合成来复制的，只从计算机中包含的数字化DNA序列开始？我们对合成大的DNA分子和染色体的兴趣是在15年前的努力中完成的。这项工作在1995开始，我们测序的生殖支原体基因组，一个细菌的最小补充基因的任何已知的生物体能够独立生长在实验室。生殖支原体485个蛋白编码基因中有100以上在一次中断（4～6）时是可有可无的。

我们开发了一种组装ValalsiZEdTeStudioEngRelayNeDaMnAlgules的策略，使我们能够从化学合成DN6AcDNA平均四个阶段组装一个合成的生殖生殖器基因组。这是通过体外酶法和酿酒酵母体内重组的组合来完成的。整个合成基因组[582970碱基对（BP）]被稳定地生长为酵母着丝粒质粒（YCP）（7）。在受体细胞中移植和表达化学合成染色体。我们需要改进从酵母中提取完整染色体的方法。我们还需要学习如何将这些基因组移植到受体细菌细胞中，以建立只由合成基因组控制的细胞。因为生殖腺具有极慢的生长速率，我们转向两个生长较快的支原体菌种，M.蕈蚊亚种CabrI（GM12）作为供体，以及毛蕊苔藓亚种卡氏菌（CK）作为受体。为了建立从酵母中移植合成基因组的条件和程序，我们开发了将细菌染色体作为酵母着丝粒质粒的方法，包括一个天然的分枝杆菌基因组（8, 9）。然而，最初尝试从酵母中提取M.蕈原体基因组并将其移植到M.capricolum中失败。我们发现供体和受体支原体有一个共同的限制系统。供体基因组在原生M.蕈状细胞中甲基化，因此在从本地供体细胞（10）移植过程中免受限制。然而，在酵母中生长的细菌基因组是未甲基化的，因此不受受体细胞的单一限制系统的保护。通过用纯化的甲基化酶甲基化供体DNA，我们克服了这种限制性障碍。

粗蕈菌或摩羯提取物，或单纯破坏细胞限制系统（8）。我们现在已经结合了我们以前建立的所有程序，并报告了合成、组装、克隆和成功移植1.08MBP M.蕈菌JCVI- Sy1.0基因组，以创建由该合成基因组控制的新细胞。M.McRIDs JCVI- Sy1.0基因组的设计是基于两个实验室菌株的高度精确的基因组序列。GM12（8，9，11）。另一种是通过在酵母中克隆和设计的基因组的构建而产生的菌株，YCPMYC1.1-DyTydiiIrS [GunBayAccess Cop161668 ]（8）。Thisproject 严重依赖于这些序列的精确性。虽然我们相信两个已完成的M.蕈菌基因组序列是可靠的，但有95个位点存在差异。我们开始设计基因序列，然后两个序列都完成。因此，基于CP01621序列（11）的大部分设计和合成。当它完成时，我们选择了成功地移植的基因组序列（CP01668）作为我们的设计参考（除了我们保留完整的IIIIIRS基因）。P0.01668和以前合成的盒式磁带之间的所有生物差异均经校正（11）。在我们的合成基因组（JCVI-CY1.0）和天然（非合成）基因组（YCPMYMC1.1）之间，我们已经在酵母中克隆并用作酵母基因组移植的标准（8）。为了进一步区分基因和非甾体化合物，WestDigig4 FrimeMax序列（图1）替换了一个或多个

区域中的盒，实验证明[水印1（1246 bp）和2（1081 bp）]或预测（水印3（1109 bp）和4（1222 bp））不干扰CE。这些水印在限制其翻译成肽的同时，编码唯一的标识符。表S1列出了基因和自然标准之间的差异。图S2显示了M.蕈蚊JCVI-Sy1.0 GenoMe.CaseTeTeand装配的图，图中S2显示了中间分枝、水印、缺失、插入和基因的分枝杆菌JCVI CY1.0，并且移植的支原体克隆SmiMCP23 5-1的序列已提交给GenBank（A）。CP9002027）。合成基因组组装策略。所设计的盒式磁带一般为1080 bp，与相邻的盒式磁带重叠80 bp（11）。它们都是通过化学组装产生的。

蓝鹭（Bothle，华盛顿）合成的寡核苷酸。每个盒都是单独合成的，并由制造商进行序列验证。TaaIDIn构建过程、DNA盒和组装中间体被设计成在其末端不包含I限制位点，并在载体元素的存在下重组，允许生长和选择。AST（7, 11）。分层策略被设计成在1078个1-KB 盒（图1）（12, 13）中通过在酵母中的转化和同源重组在三个阶段中组装基因组。组装10 kb 合成中间体。在第一阶段，将盒和载体重组并转移到大肠杆菌中。

大肠杆菌（11）。然后从单个大肠杆菌克隆和DigestDeStReCon中分离质粒DNA，其中含有10kb插入物。一个成功的10 kb组件被表示（图2a）。通常，通过筛选10个酵母克隆可以获得至少一个10 kb的组装片段。然而，成功率从10变化到100%。所有的第一级中间体都进行了测序。111个程序集中的十九个包含错误。选择交替克隆，序列验证，并转移到下一个组装阶段（11）。组装100 kb合成中间体。将相应的克隆载体转化为酵母。

产品为100kb半中间体（11）。我们的结果表明，这些产物不能稳定地保持在大肠杆菌中，因此重组DnAdHaTeO从东提取。对选定的酵母克隆进行多重聚合酶链反应（图S3和表S2）。因为每一个10 kb的组装中间体都是由一对引物在这一分析中所代表的，所有的扩增子都表明组装了100 kb的中间体。一般来说，筛选出的25%个或更多克隆含有完整组装所需的扩增子。选择其中一个克隆进行进一步筛选。在琼脂糖凝胶上提取圆形质粒DNA，并在琼脂糖凝胶上进行大小测定，成功的第二阶段序列长度为105 kb（图2b）。当多重PCR扩增后，通常产生一个第二阶段的合成中间体。然而，在一些情况下，发生了小的衰变。在其他实例中，组装了多个10kb片段，从而产生了更大的第二级组装中间体。幸运的是，这些差异可以很容易地检测到琼脂糖凝胶前完整基因组组装。全基因组组装为了装配的最终阶段，需要分离11个第二级组件（11）中的每一个的微克量。如报道（14），可在碱性裂解过程中从酵母球粒中分离出第二阶段组件的大小的圆形质粒。为了进一步纯化11个组装中间体，他们用核酸外切酶处理，并通过阴离子交换柱。用Nyfield分析技术（图2C）消化了总质粒DNA（1/100）的一小部分，该方法每400毫升酵母培养物（1011个细胞）产生1毫克的每一个组件。上述方法不能完全去除所有的线性酵母染色体DNA，我们发现，这可以大大降低酵母转化率和组装效率。为了进一步富集11个圆形组装中间体，每个组件的200 ng样品汇集并与熔融琼脂糖混合。随着琼脂糖的固化，纤维穿过并“圈闭”环状DNA（15）。然后，通过电泳将未捕获的线性DNA从琼脂糖塞中分离出来，从而富集被捕获的圆形分子。用不I的方法对11个组装中间体进行了筛选，使插入物得以释放。随后，从琼脂糖塞中提取片段，通过FIGE（图2D）分析，并转化为酵母球状体（11）。在组装的这第三个阶段和最后阶段，不需要附加的载体序列，因为酵母克隆元件已经存在于组装811-900中。

为了筛选完整的基因组，用11对引物进行多重PCR，设计用于跨越11100个KB组装结中的每一个（表S3）。在筛选的48个菌落中，从一个克隆中提取的DNA（SMMYCP23）产生了11个扩增子。野生型阳性对照（YCPMYC1.1）的PCR产生了11个扩增子的不可区分的集合（图3A）。为了进一步证明Assithith.McDimes基因组的完整组装，从琼脂糖塞中分离出酵母DNA，并进行两个限制性分析：ASCⅠ和BssH II（11）。由于这些限制位点是在四个水系序列中的三个，所以这种消化的选择产生不同于天然分枝杆菌基因组的限制性模式（图）。1和3b）。SmiMCP23 5的克隆产生了限制性的模式，期望合成完整的基因组（图3C）。综合性