2015版药典菌种传代 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书
2015版中国药典(新)
凡例
原辅料
制剂中使用的辅料和生产中所用的原材料，其质量控制
应符合“生物制品生产用原材料及辅料质量控制规程”及 本版药典（二部和三部）的相关规定;
生产用培养基不得含有可能引起人体不良反应的物质，
生产过程使用的过滤介质，应为无石棉的介质
凡例
• 精确度可根据数值的有效数位来确定，如称取 “2g” ，
氧化的有机物，按规定制备各自的标准溶液，在总有机碳 测定仪上分别测定相应的响应值，以考察所采用技术的氧 化能力和仪器的系统适用性。
• 采用每升含总有机碳低于0.10mg，电导率低
1.0us/cm(25℃)的高纯水作为空白对照。
• 纯化水和注射用水总有机碳（TOC)限度为不得过0.5mg/L
，即≤500ppb。
中国药典2015版培训
2018年7月
中国药品标准体系
◇省级地方药品标准 各省（自治区、直辖市）中药材药品标准 中药饮片炮制规范
◇药品注册标准 国产药品YB、进口药品J
◇药品国家标准 中国药典、局（部）版标准
药典的定义
•药 典
系国家对所编纂制定的药品标准的统一 集成并对其中共性要求给予统一的规定。
• 室温（25℃），纯化水电导率限度为5.1 μS/cm，注射用
水电导率限度为1.3 μS/cm。
检测方法通则
总有机碳(TOC)测定法
• 检査制药用水中有机碳总量，用以间接控制水中的有机物
含量。制药用水中的有机物质一般来自水源、供水系统（ 包括净化、贮存和输送系统）以及水系统中菌膜的生长。
• 通常采用蔗糖作为易氧化的有机物、1，4-对苯醌作为难
灭菌物品而言，绝对无菌既无法保证也无法用试验来证实。
• 一批物品的无菌特性只能相对的通过物品中活微生物的概
2010中国药典二部附录XI_J
中国药典2010年版二部附录XI J微生物限度检查法微生物限度检査法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除另有规定外，本检査法中细菌及控制菌培养温度为30〜35°C;霉菌、酵母菌培养温度为23〜28°C，检验结果以lg、lml、10g、10ml或10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
检验量检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2»贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g或10ml用于阳性对照试验）。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加人检验用培养基，不得超过1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1. 液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。
油剂可加人适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2. 固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g ，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。
菌种传代操作规程
菌种传代操作规程 Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】G M P管理文件一、目的：为使菌种传代操作规范化、制度化，故建立此规程二、适用范围：菌种传代须按本规程执行。
三、责任者：微生物限度检查化验员，质量检测中心主任。
四、正文：1、培养基的制备按微生物限度检查用稀释剂、培养基配制操作规程及斜面配制操作规程配制好相应培养基。
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌、用胰酪大豆胨琼脂斜面培养基，白色念珠球菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基，制备好的培养基预培养48小时后，确认无菌落生长方可使用。
2.菌种传代菌种传代前应准备好适于该菌种生长的培养基和培养设备，所有操作均应在符合生物安全保护的生物安全柜内进行。
点燃酒精灯，在火焰上部操作，将原有的菌种斜面（简称菌种管）与待接种的新鲜斜面培养基（简称接种管）持在左手拇指、食指及中指之间，菌种管在前，接种管在后，使试管内斜面向上，两支试管口平齐，应斜持试管呈45°角，以免管底凝集水浸湿培养基表面。
用右手在火焰旁转动两支试管胶塞，以便接种时易于拨取。
再用右手持接种环的柄端，垂直或稍斜地把接种环在火焰上灼烧。
将接种环烧红约30s，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，以彻底灭菌。
用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间，在火焰旁分别拔除两支试管的胶塞，持住。
在将试管口在火焰上通过以杀灭管口的细菌，但勿烧的过热，将烧灼的接种基上，如有溶印则表明接种环未冷却，待冷后，再从斜面上挑取少许菌苔。
取出时接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管，在斜面上由下而上划“Z”字型曲线，当接种完毕，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁塞上胶塞，不要将管口离开火焰旁去迎接右手的胶塞。
最后将接种环烧灼灭菌放置备用。
3.培养将以上接种好的各菌管放入相应温度的培养箱内，白色念珠菌放入23-28℃培养箱内培养24-48h，黑曲霉放入23-28℃培养箱内培养5-7天，其它菌种放入30-35℃培养箱内培养18-24小时。
微生物检验之2015药典与2010药典区别
28
三. 设备要求
微生物实验室应配备与检验能力和工作量相适应的仪器设备，其类 型、测量范围和准确度等级应满足检验所采用标准的要求。
设备的安装和布局：便于操作，易于维护、清洁和校准，并保持清
洁和良好的工作状态。
标识：每台仪器、设备应有唯一标识。 合格证书：仪器设备应有合格证书。 SOP：仪器设备完成相应的检定、校准、验证、确定其性能，并形
（删除2010药典“无菌检查法”对人员要求 “无菌检查人员必须具 备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训” ）
15
二. 环境要求
应具有进行微生物检测所需的适宜、充分的设施条件， 实验环境应保证不影响检验结果的准确性。
工作区域与办公区域应分开。
微生物实验室应专用，并与其他领域 分开尤其是生产
对环境洁净度的确认，只做原则性规定，不涉及具体标准。（ 9205）
对在无菌检查法和微生物计数法等微生物检验中涉及的生物安全实验
室的环境要求，不在强制性附录中规定，在9203中予以规定（病原微 生物的分离鉴定应在二级生物安全实验室进行）。
GMP规范：“无菌检测室是否符合要求，并与生产的产品和生产能
力相适应”。
国食药监械[2011]54号:“关于实施《医疗器械生产质量管理规范
（试行）》及其配套文件有关问题的通知 ”中：“四、医疗器械生 产企业的无菌检测实验室原则上应设3间万级下的局部百级洁净室， 用作无菌室、阳性对照室和微生物限度室。无菌检测实验室原则上 应当和洁净生产区分开设臵，有独立的区域、单独的空调送风系统 和专用的人流物流通道及实验准备区等”。
2010版中国药典培训回答（第4部分：菌种传代与特定菌检测）
2010版中国药典培训回答（第4部分：菌种传代与特定菌检测）2010版中国药典培训回答（第4部分：菌种传代与特定菌检测）广东省药检所对《中国药典》2010版微生物专题培训班的有关问题解答答案。
1.以第五代菌做阳性对照，实验过程中的接种按药典应该也算传代，那是否算是第六代菌呢？答：依然算第五代(接种的菌株算第5代，培养后算第6代)答：其实验结果是算哪一代菌的？答：见上题2.药典规定只能传代五次，此次实验结果是否有效？答：有效3.现在有无对照菌种可以购买？联络电话？答：省药检所业务科销售药典规定的标准菌株，为第二代甘油冻存管，电话：020-********4.菌种发放单应包括什么信息？答：根据自己工作的需要，大致包括：菌种名称，编号，来源，接收日期，接收人等。
5.如何检查黑曲霉孢子悬浮液孢子含量为50~100个／ml。
铜绿假单胞菌单菌如果用甘油冷冻管，也是低温，是否也会影响它的活性？应如何保存？答：可用玫瑰红钠琼脂培养基或改良马丁琼脂来确定黑曲霉孢子悬浮液。
铜绿假单胞菌应使用最终甘油浓度为20%的甘油冻存管保存，保存在-30℃或更低温度，则可保持其活性。
若是斜面或营养肉汤，建议室温保存。
6.工作菌株，25℃下可连续使用一周，这里的工作菌株是指原液还是制备好的菌悬液。
为何工作菌株不低温存放，而是25℃？答：首先要说明，所有的操作应按药典要求来操作，这里的工作菌株指原液，工作菌株建议在2-8℃保存，但要注意的是，铜绿假单胞菌的工作菌液不能低温保存，低温会损伤其活性。
由于笔误，写成了25℃，请更正为2-8℃。
7.简单方便的厌氧培养方案？答：硫乙醇酸盐培养基；固体培养基的话可考虑使用一次性厌氧袋。
8.甘油冻存管一定要－30℃吗？0℃以下不可以吗？答：详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页。
我们的甘油冻存管保存在-30℃。
8.三糖铁斜面穿刺会断层，这是为什么？答：产气菌产气使培养基断层，或培养基本身质量问题。
菌种的复苏传代及保存标准程序
菌种的复苏传代及保存标准程序目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。
范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。
职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。
内容：菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。
操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。
1.菌种的复苏1.1冻干菌种的复苏检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。
使用前需将其复苏。
1.1.1准备：①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。
②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。
③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。
1.1.2操作：1.1.2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。
1.1.2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。
1.1.2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。
1.1.2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。
1.1.2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。
用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。
1.1.2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。
1.1.2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。
如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。
1.2 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。
菌种传代操作规程(1)
GMP 【2 】治理文件一、目标：为使菌种传代操作规范化.轨制化,故树立此规程二、实用规模：菌种传代须按本规程履行.三、义务者：微生物限度检讨化验员,质量检测中间主任.四、正文：1.造就基的制备按微生物限度检讨用稀释剂.造就基配制操作规程及斜面配制操作规程配制好响应造就基.大肠埃希菌.金黄色葡萄球菌.铜绿假单胞菌.枯草芽孢杆菌.沙门菌.用胰酪大豆胨琼脂斜面造就基,白色念珠球菌.黑曲霉用沙氏葡萄糖琼脂斜面造就基,制备好的造就基预造就48小时后,确认无菌落发展方可应用.2.菌种传代2.1菌种传代前应预备好适于该菌种发展的造就基和造就装备,所有操作均应在相符生物安全破坏的生物安全柜内进行.2.2点燃酒精灯,在火焰上部操作,将原有的菌种斜面（简称菌种管）与待接种的新颖斜面造就基（简称接种管）持在左手拇指.食指及中指之间,菌种管在前,接种管在后,使试管内斜面向上,两支试管口平齐,应斜持试管呈45°角,以免管底凝聚水浸湿造就基表面.用右手在火焰旁迁移转变两支试管胶塞,以便接种时易于拨取.再用右手持接种环的柄端,垂直或稍斜地把接种环在火焰上灼烧.将接种环烧红约30s,随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼,以彻底灭菌.用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间,在火焰旁分离拔除两支试管的胶塞,持住.在将试管口在火焰上经由过程以杀灭管口的细菌,但勿烧的过热,将烧灼的接种环插入菌种管内,先接触无菌苔发展的造就基上,若有溶印则表明接种环未冷却,待冷后,再从斜面上挑取少许菌苔.掏出时接种环不能经由过程分焰,应在火焰旁敏捷插入接种管,在斜面上由下而上划“Z”字型曲线,当接种完毕,立刻将管口经由过程分焰灭菌,右手到火焰旁塞上胶塞,不要将管口分开仗焰旁去迎接右手的胶塞.最后将接种环烧灼灭菌放置备用.3.造就将以上接种好的各菌管放入响应温度的造就箱内,白色念珠菌放入23-28℃造就箱内造就24-48h,黑曲霉放入23-28℃造就箱内造就5-7天,其它菌种放入30-35℃造就箱内造就18-24小时.4.保存除铜绿假单胞菌需室温保存外,将其它传代造就后的菌种应放入4-6℃的冰箱冷藏保存.根据：《中国药典》2015版及中国药品磨练标准操作规范。
菌种传代.
1. 目的建立菌种的传代、保藏及菌液制备的操作规程。
2. 范围适用于质检中心菌种的传代、保藏及菌液制备。
3. 责任人实验室检定菌保管员、检验中心主任。
4. 内容4.1 标准菌种的概念及其管理4.1.1标准菌种是指由国家授权机构制备的具有稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌种。
我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供。
4.2 菌种代号的意义4.2.1国内药品微生物检验所用的菌种代号是：CMCC（F）或 CMCC（B）CMCC ——中国医学菌种保藏中心；B ——代表细菌， F ——代表真菌。
4.2.2 菌种的名称▪铜绿假单胞菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］▪生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］▪大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２］▪金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］▪枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］▪白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］▪黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］4.3 标准菌种的保藏形式我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。
在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。
4.4 培养基的选择细菌一般用营养琼脂培养基，特别指出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基进行传代，真菌一般用改良马丁培养基。
4.5 菌种的传代4.5.1 菌种的复苏4.5.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml 滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台。
4.5.1.2先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。
点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。
4.5.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养22~24 h。
菌种传代操作规程(1)知识讲解
菌种传代操作规程(1)GMP管理文件一、目的：为使菌种传代操作规范化、制度化，故建立此规程二、适用范围：菌种传代须按本规程执行。
三、责任者：微生物限度检查化验员，质量检测中心主任。
四、正文：1、培养基的制备按微生物限度检查用稀释剂、培养基配制操作规程及斜面配制操作规程配制好相应培养基。
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌、用胰酪大豆胨琼脂斜面培养基，白色念珠球菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基，制备好的培养基预培养48小时后，确认无菌落生长方可使用。
2.菌种传代2.1菌种传代前应准备好适于该菌种生长的培养基和培养设备，所有操作均应在符合生物安全保护的生物安全柜内进行。
2.2点燃酒精灯，在火焰上部操作，将原有的菌种斜面（简称菌种管）与待接种的新鲜斜面培养基（简称接种管）持在左手拇指、食指及中指之间，菌种管在前，接种管在后，使试管内斜面向上，两支试管口平齐，应斜持试管呈45°角，以免管底凝集水浸湿培养基表面。
用右手在火焰旁转动两支试管胶塞，以便接种时易于拨取。
再用右手持接种环的柄端，垂直或稍斜地把接种环在火焰上灼烧。
将接种环烧红约30s，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，以彻底灭菌。
用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间，在火焰旁分别拔除两支试管的胶塞，持住。
在将试管口在火焰上通过以杀灭管口的细菌，但勿烧的过热，将烧灼的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，如有溶印则表明接种环未冷却，待冷后，再从斜面上挑取少许菌苔。
取出时接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管，在斜面上由下而上划“Z”字型曲线，当接种完毕，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁塞上胶塞，不要将管口离开火焰旁去迎接右手的胶塞。
最后将接种环烧灼灭菌放置备用。
3.培养将以上接种好的各菌管放入相应温度的培养箱内，白色念珠菌放入23-28℃培养箱内培养24-48h，黑曲霉放入23-28℃培养箱内培养5-7天，其它菌种放入30-35℃培养箱内培养18-24小时。
2010版《中国药典》菌种的传代与保藏
大肠杆菌斜面
金黄色葡萄球菌斜面
生孢梭菌 需气菌、厌气菌培养基
白色念珠菌 真菌培养基
各类菌种保藏条件及时间
菌种 培 养 基 一般多用于营养琼脂 或根据菌种规定选用 培养基
保存温 度
传 种 时 间
细菌
4~6℃
芽 孢 杆 菌 3~6 个 月 ， 其它细菌每个月
酵母菌
一般用麦芽汁琼脂或 麦芽汁酵母膏琼脂 一 般 用 PDA 琼 脂 、 蔡 氏琼脂或麦芽汁琼脂 等
•
堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼 脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环 伸入管内至琼脂斜面的低部，由底向上，将接 种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜 面的表面上。 • 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵 上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼 灭菌。 • 将已接种毕的细菌管置35~37℃培养22~24 小时，霉菌管一般置20~25℃霉菌培养箱内培 养7日。取出后放人冰箱保存，一般 3个月转 种一次。
1.琼脂斜面低温保存法
（1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接 种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上， 按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把 培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养 基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏 管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱 中保藏。每隔 2~3个月移种一次，继续进行保 藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可 保藏半年 ~ 一年。有的甚至更长时间。 （2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。
菌种
菌种 工作菌种培养 基 营养琼脂斜面 营养琼脂斜面 营养琼脂斜面 营养琼脂斜面
硫乙醇酸盐培养 基
菌悬液
对照菌液
0.9% 氯 化 钠 溶 液
0.9% 氯 化 钠 溶 液 0.9% 氯 化 钠 溶 液 0.9% 氯 化 钠 溶 液 0.9% 氯 化 钠 溶 液 0.9% 氯 化 钠 溶 液
《中国药典》2015年版微生物基本知识
供试品检查部分-计数标准
2010版
无规定
2015版
增加： 各品种项下要求执行的微生物限度标准解释如下： 101cfu为可接受的最大限度为20； 102cfu为可接受的最大限度为200； 103cfu为可接受的最大限度为2000；以此类推。 若供试品的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的检查结果均符 合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不 符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。
不含中和剂及灭活剂的相应稀释液 替代供试液，按试验组操作。 中和剂、灭活剂及表面活性剂的稀 释液中加入规定量菌液
接种和稀释
消除供试品的抑菌活性的方法
（1）增加稀释剂和培养基的用量； （2）加入中和剂或灭活剂； （3）采用薄膜过滤法和冲洗； （4）综合上述措施。
●根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响
2015版
若因沙氏葡萄糖琼脂培养基 上生长的细菌使霉菌及酵母 菌的计数结果不符合微生物 限度要求，可使用含抗生素 （如氯霉素、庆大霉素）的 沙氏葡萄糖琼脂培养基或选 择性培养基（如玫瑰红钠琼 脂培养基）进行霉菌和酵母 菌总数测定。使用选择性培 养基时，应进行培养基适用 性检查。如采用MPN法，测 定结果为需氧菌总数。
微生物检查体系的调整
2010版
分类依据 质控分类 检验体系 项目1 按微生物类别分 细菌、真菌 选择培养、或者人为区分 细菌数 营养琼脂
2015版
按营养条件分 需气、厌气菌 直接与培养条件对应 需氧菌总数 胰酪大豆胨琼脂 （TSA）
项目2
霉菌及酵母菌总数 玫瑰红钠琼脂
容易造成漏检
霉菌及酵母菌总数 沙氏葡萄糖琼脂 （SDA)
供试品检查部分-结果判断
2010版
菌种的传代和培养、检查和复壮、管理
菌种的传代和培养、检查和复壮、管理一、传代和培养工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代，（从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0代）防止过度的传代造成菌种变异。
1代是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。
必要时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。
细菌的接种、分离和培养常用培养基种类：斜面培养基、半固体培养基、液体培养基、平板培养基。
接种方法：涂布法、划线法、穿刺法、直接加入法等分离：为了获得纯菌种（株），采用的将细菌分离成单个细胞，使其独立分裂繁殖形成单个菌落的操作技术。
分离一般采用平板培养基。
分离方法主要有分段划线法、连续划线法、涂布分离法、倾注分离法等。
培养：接种后的培养基，根据不同微生物生长条件的要求，将培养基放在适宜微生物生长的环境中（温度、湿度、氧气等），使其生长繁殖的过程。
需气菌培养法和厌氧培养法。
培养后微生物的生长判断固体培养基液体培养基二、菌种的检查与复壮菌种的衰退：菌种经过长期人工传代培养或保藏，由自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。
控制菌种的衰退方法1,控制传代次数尽量避免不必要的接种和传代，降低突变几率。
采用良好的传代保藏方法。
《中国药典》2010年版规定，传代次数不得超过5代。
2,创造适宜的培养条件3,用不同类型的细胞进行传代4,采用有效的保藏方法定期检查主要检查项目：菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、生化特性及血清学检查。
菌种的复壮：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性的过程验室主要采用分离纯化的方法。
三、菌种的管理1、使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的条件和设备。
菌种应由专人负责管理，管理人员应具有微生物专业知识和技术水平，并应具有较强的责任心。
2、实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度；包括：每支菌种标注名称、标准号、接种日期、传代次数、进出、收集、贮藏、保存、确认试验以及销毁的记录、标准菌种的申购记录、从标准菌株到工作菌株操作记录，如菌种定期转种传代，鉴定（纯度、特性）、培养基和培养条件、菌种保存的位置和条件及其它需要的程序。
2015版药典菌种传代 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书
2015版药典菌种传代中国药典2010年版二部及菌种使用说明书导读:就爱阅读网友为您分享以下“中国药典2010年版二部及菌种使用说明书”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持!依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心(China Medical culture collection ,CMCC)提供的冷冻干燥菌种(0代)或由上级药检部门已接种好的菌种斜面(3代)。
黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。
中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签1CMCC(B)代表细菌(bacteria),CMCC(F)代表真菌(fungi)每种菌具有固定的代号。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括:菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于,20?，有效期为三年。
从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面(3代)应检查菌种管是否完好。
储存于2, 8 ?，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂:接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基2改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.3.3操作步骤:a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
菌种传代.
1. 目的建立菌种的传代、保藏及菌液制备的操作规程。
2. 范围适用于质检中心菌种的传代、保藏及菌液制备。
3. 责任人实验室检定菌保管员、检验中心主任。
4. 内容4.1 标准菌种的概念及其管理4.1.1标准菌种是指由国家授权机构制备的具有稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌种。
我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供。
4.2 菌种代号的意义4.2.1国内药品微生物检验所用的菌种代号是：CMCC（F）或 CMCC（B）CMCC ——中国医学菌种保藏中心；B ——代表细菌， F ——代表真菌。
4.2.2 菌种的名称▪铜绿假单胞菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］▪生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］▪大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２］▪金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］▪枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］▪白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］▪黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］4.3 标准菌种的保藏形式我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。
在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。
4.4 培养基的选择细菌一般用营养琼脂培养基，特别指出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基进行传代，真菌一般用改良马丁培养基。
4.5 菌种的传代4.5.1 菌种的复苏4.5.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml 滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台。
4.5.1.2先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。
点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。
4.5.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养22~24 h。
《中国药典》2015年版微生物基本知识
微生物计数用培养基
2010版
2015版
1、营养琼脂用于细菌计数
2、玫瑰红钠用于霉菌和酵母菌计数
3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂用于酵 母菌计数
4、菌液制备用稀释液：0.9％氯化钠 溶液
1、胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤用于需氧 菌总数测定
2、沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数测定
▷ 活动区域的合理规划及区分，提高微生物实验操作的安全性和可靠 性。
控制菌项目变化
培养基体系 明显变化
无明显变化
2010版
大肠菌群 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
2015版
耐胆盐革兰阴性菌 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
《非无菌产品微生物限度检查： 微生物计数法》
试验菌
2010版
2015版
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、
白色念珠菌、黑曲霉
白色念珠菌、黑曲霉
(1)胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞 菌、白色念珠菌、黑曲霉。
(2)胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆 菌。
培养条件
2010版
2015版
细菌数：营养琼脂 30℃~35℃ 3天
霉菌及酵母菌数：玫瑰 红钠琼脂 23℃~28℃ 5天
需氧菌总数（TAMC）： 胰酪大豆胨琼脂
30℃~35℃ 3~5天
霉菌及酵母菌总数 （TYMC)：沙氏葡萄糖 琼脂
20℃~25℃ 5~7天
结果判断
计数方法
《中国药典》菌种的传代与保藏
酵母菌
一般用麦芽汁琼脂或 麦芽汁酵母膏琼脂
4~6℃
一般4~6个月
丝状真 菌
一 般 用 PDA 琼 脂 、 蔡 氏琼脂或麦芽汁琼脂 等
4~6℃
精品课件
每4个月移植一次 （每于推广；一
般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微 生物都适用。
缺点是——保藏期太短；传代次 数多，易发生变异及污染。
▪ 适用范围：适用于保 藏部分霉菌，酵母菌 和放线菌，对细菌保 藏效果较差。
精品课件
液体石蜡对各类菌种保藏效果
菌
种 菌株数
细菌
87
霉菌
586
酵母菌
400
放线菌
380
保存时间 （年）
5 5 2 4
存活率 （%）
20.9 83.6 88.9 91.3
精品课件
（3）特点： 本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，
若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进 行移种。
精品课件
1.琼脂斜面低温保存法
▪ （1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接 种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上， 按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把 培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养 基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏 管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱 中保藏。每隔 2~3个月移种一次，继续进行保 藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可 保藏半年 ~ 一年。有的甚至更长时间。
▪ （2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。
精品课件
大肠杆菌斜面 斜面
金黄色葡萄球菌
精品课件
生孢梭菌 白色念珠菌 需气菌、厌气菌培养基
真菌培养基
精品课件
各类菌种保藏条件及时间
中国药典2015版微生物检测所用菌种和培养基
肠道菌计数和肠杆菌科鉴别
10
麦康凯液体培养基
肠道致病菌的增菌培养
11
麦康凯琼脂培养基
肠道致病菌的选择性分离、培养
12
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
沙门氏菌、志贺氏菌的选择性分离培养
13
三糖铁琼脂培养基（TSI）
肠杆菌糖发酵及硫化氢反
14
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（十六烷基三甲基溴化铵培养基）
绿脓杆菌的选择性分离培养
15
甘露醇氯化钠琼脂培养基 （甘露醇盐琼脂培养基）
金黄色葡萄球菌选择性分离培养
16
哥伦比亚琼脂培养基
梭菌的选择性分离培养
17
梭菌增菌培养基
梭菌增菌培养
18
沙门菌增菌液体培养基
药品或生物制品中沙门氏菌选择性增菌
19
念珠菌显色培养基
念珠菌分离和鉴定
1.3抗生素检定培养基
编号
名称
用途
多粘菌素 B 效价测定
15
制霉素检定培养基
制霉素效价测定
16
麦迪/麦白霉素检定培养基
麦迪（白）霉素效价测定
17
阿奇霉素检定培养基
阿奇霉素效价测定
18
生芽孢琼脂斜面培养基
快速生芽孢
1.4支原体检查
编号
名称
用途
1
支原体半流体培养基
生物制品无菌试验，检查支原体
2
精氨酸支原体肉汤基础培养基
培养支原体
3
肺炎支原体肉汤基础培养基
制备药品制品的稀释液或冲洗液
9
PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液
制备药品制品的稀释液或冲洗液2.2ຫໍສະໝຸດ 生物限度检查编号名称
中国药典版微生物检测所用菌种和培养基说课讲解
霉菌、酵母菌计数
6
玫瑰红钠琼脂培养基
霉菌、酵母菌计数
7
硫乙醇酸盐流体培养基
药品、生物制品无菌试验，和需氧菌、厌氧菌的培养
8
肠道菌增菌液体培养基
耐胆盐革兰氏阴性菌的增菌培养多
用于检验食物和动物饲料中的肠杆菌
9
紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基
肠道菌计数和肠杆菌科鉴别
10
麦康凯液体培养基
苯唑青霉素等抗生素检定
4
抗生素检定I（PH7.8 - 8.0）
链霉素等抗生素检定
5
抗生素检定II（PH6.5 - 6.6）
四环素等抗生素效价测定
6
抗生素检定II（PH7.8 - 8.0）
林可霉素等抗生素效价
7
抗生素检定III
藤黄八叠球菌菌悬液制备
8
抗生素检定IV
两性霉素效价测定
9
抗生素检定V
培养啤酒酵母菌菌种
阿奇霉素效价测定
18
生芽孢琼脂斜面培养基
快速生芽孢
1.4支原体检查
编号
名称
用途
1
支原体半流体培养基
生物制品无菌试验，检查支原体
2
精氨酸支原体肉汤基础培养基
培养支原体
3
肺炎支原体肉汤基础培养基
分离肺炎支原体
4
支原体琼脂基础培养基
支原体分离培养
5
解脲支原体肉汤基础培养基
分离培养解脲支原体
中国药典2015版微生物检测所用菌种和培养基
一、菌株
编号
名称
用途
1
金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003
2
铜绿假单胞菌CMCC(B) 10104
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程
菌种管理制度1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。
3、定义➢标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
➢传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
➢工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
➢菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
4、职责4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。
4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
5、规程5.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。
5.2菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。
5.3菌种的保存5.3.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。
保存时间根据菌种种类而不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2015版药典菌种传代中国药典2010年版二部及菌种使用
说明书
导读:就爱阅读网友为您分享以下“中国药典2010年版二部及菌种使用说明书”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持!
依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书
1.标准菌的来源
标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心(China Medical culture collection ,CMCC)提供的冷冻干燥菌种(0代)或由上级药检部门已接种好的菌种斜面(3代)。
黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。
中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签
1
CMCC(B)代表细菌(bacteria),CMCC(F)代表真菌(fungi)每种菌具有固定的代号。
2.标准菌的验收
从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括:菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于,20?，有效期为三年。
从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面(3代)应检查菌种管是否完好。
储存于2, 8 ?，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备
3.1物品及试剂:接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球
3.2培养基
2
改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.
液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.
营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.
3.3操作步骤:
a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开(开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂)。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5,0.8 ml 到安瓿中。
e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌
3
种和液体培养基充分混合并完全溶解。
f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度(细菌培养温度30,35?，培养18,24小时;真菌培养温度23,28?，培养3,5天。
观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长;若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1,2滴滴在改良马丁琼
脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23,28?培养5,7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。
确认后用含有0.05%(ml/ml)的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。
i.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。
以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。
每个菌
4
种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。
其余作为储备管。
黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。
以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。
制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。
其余作为储备管。
将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。
内容包括:菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
j(储备菌种管制备成功，储存于,20?，有效期为三年。
3.4菌种确认
用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。
然后在30,35?下培养2,3天;同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23,28?下培养7天;培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。
3.5污染处理
5
假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。
将此被污染了的培养物灭菌处理。
可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。
并重新制备储备菌种管
3.6菌种的传代与保藏
将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种。
菌种的传代次数(自原始菌种冻干粉起)不得超过5代。
菌种的传代保藏过程
3.3项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。
传第三代时取1支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。
此时，工作用菌种为第3代。
工作用菌种，分为两类:一类用于定期传代(W3)，一类用于实验用(S3)。
定期传代用菌的传代其操作步骤如下(斜面接种法):
6
(1)从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。
(2)将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。
(3)关闭紫外灯。
点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。
(4)右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌
苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。
(5)塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面(或改良马丁琼脂斜面)一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向
7
上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。
(6)取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。
(7)将已接种好的细菌管置30,35?细菌培养箱培养22 ,24h，真菌管置23,28?真菌培养箱最多培养7天。
8。