发酵罐灭菌

发酵罐操作与灭菌技术

常用的灭菌技术一般分为；物理灭菌和化学灭菌。物理灭菌又包括湿热灭菌、干热灭菌、射线灭菌法和过滤灭菌等。而化学灭菌主要是使用化学试剂（如甲醛、苯酚、新洁尔灭、过氧乙酸、高锰酸钾等）进行某些容器或物料以及无菌区域的灭菌。在生物发酵方面，常用的设备是机械搅拌式发酵，其杀菌效果的好坏直接影响到发酵是否能正常进行。由于工业操作的特点，发酵罐灭

菌普遍采用湿热灭菌法。

一．小型发酵罐操作和酵母菌培养

实验室所使用的小型通气搅拌发酵罐具有体积小，耗电少，不宜染菌，单位时间、单位体积的生产力高，代谢放出热量易于移去，操作控制和维修方便等特点，因此能较好的满足微生物的生长和代谢的需要。

1.设备和材料

1L发酵罐、5L发酵罐、50L发酵罐、一套空气除菌系统、供检查无菌用的肉汤培养基和装置。

2.发酵罐操作步骤

2.1发酵罐的清洗

发酵罐使用前后都应认真清洗，特别是前后两次培养采用不同的菌株时，更应注意清洗和杀菌工作。

发酵罐内可进行清洗的任何部分都应认真清洗，否则都可能成为杂菌的滋生地。易被忽略而不能充分清洗的地方有喷嘴角内部与取样管内以及罐顶等处。

2.2 种子培养基及培养条件

蛋白胨10g，葡萄糖40g，蒸馏水100ml，pH自然。500ml三角瓶装液量100ml，115℃，灭菌20min。

培养条件：用接种环从保存斜面中接一环至三角瓶中，150r/min，28℃，摇瓶培养48h。

2.3 发酵罐的组装工作

① 连接好冷却水管。若采用自来水冷却，连接部要充分牢固，并且注意连接管管径与自来水管管径一致，尽可能采用耐压管。

②由于通入的空气有一定压力，应注意连接压缩空气的管子应能承受一定压力。

③安装pH及溶解氧等检测装置，注意各接线口不要出现差错。由于操作过程要和水打交道，故线路连接一定要注意安全，要特别注意防止漏电。

2.4 发酵罐灭菌

① 排气管为玻璃管，内装有棉花，以保证蒸汽能自由出入发酵罐，同时不会出现染菌现象。

② 取样口上连接一段硅胶管，在硅胶管上安装节流夹，以防止培养基在灭菌是流出。

③ 装入发酵罐溶积60%的培养基（成分同种子培养基）后，将发酵罐放入灭菌釜内，在115℃下，灭菌20min。当灭菌完成后，温度降到60℃以下时，打开灭菌釜，确认发酵罐上所连接的管路完好后，将罐去除。尽快将通气管接好，确认排气口正常后，以0.3-0.5L/min通入空气。接通冷却水管路，开搅拌在低速下进行培养基的冷却。

2.5 取样与分析方法

自培养操作开始起，每3h取一次样。取样时，将取样管口流出的最初15ml左右

下测定吸光度。所得数值培养液作为废液，取随后流出的培养液10ml，在OD

505

基于已制得的菌体量与吸光度之间的曲线，换算出菌体浓度。

二发酵菌的空消技术

1 发酵罐的清洗

打开罐底排污阀，用冷水冲洗罐壁，如壁内壁有沉积物，操作人员必须下罐进行人工铲除，否则易包藏杂菌成为污染源。进罐清洗必须两人进行，一人进罐清洗，一人在外监护。同时与罐体相连的取样管道，进料管道，排污管道及有关阀门都要通水冲洗干净，最好通以沸水，以提高洗涤效率，洗完后盖上入孔盖。

① 发酵罐空消操作

② 打开罐顶各排汽阀，开三路进汽（罐底、风管、取样管）。

③ 开始时，蒸汽以下进上出为主，蒸汽由罐底和风管进入，由罐顶所有排汽阀排出冷空气。在蒸汽排出时，即关闭各阀门，稍开排汽阀，当罐压上升到

1.5-

2.5kgf/cm2(1kgf/cm2=98.0665kpa)时，开罐顶各排汽阀，排汽历时

15-20min，蒸汽改为上进下出为主，即关闭底部蒸汽阀，关小进风管汽阀，蒸汽主要从取样管进，连消进料管进入，空消过程中蒸汽应将两只大罐间倒种管道、压料进风管道、接种管道以及各排汽阀打开，排汽消毒（两个冲视镜阀开启短暂时间即可）。

① 待蒸汽压力上升到1kgf/cm2以后，温度115℃，调节进汽阀和排汽阀大小，维持罐压1kgf/cm2，60min；1.2-1.51kgf/cm2，45min;1.5-2.01kgf/cm2,30min。

② 保压时间到，关蒸汽阀，排汽到罐压为0kgf/cm2，，待进料。

③ 分过滤器灭菌

开启使用时，用从空气压站出来的常温空气对分过滤器吹风24h左右，检查无菌，即可使用。以后如果不使用，也必须保持分过滤器通常温空气，以免染菌。

三发酵罐的实消技术

1 进料

空消完毕，开始进料，进料约2/3体积时，开搅拌。由于加热时物料糊化膨胀，故先不定容。当温度达到70℃时定容。

2 液化

底路直接进蒸汽加热至75℃左右，关蒸汽，加入用50℃水调匀的α-淀粉酶，严防酶结块，根据生产需要，调整加入量，从进风管通入少量空气，翻腾

10-15min，关闭进气。

3 实消

用水冲洗入孔盖，盖好盖子进行实消，先将蒸汽管道内的残存水放完，然后通三路蒸汽，一路罐底，一路进风管，一路取样管，同时打开罐顶所有排汽阀门，小旋塞及压力表下的排汽旋塞，让蒸汽排出，先大后小，待罐压上升到1.2 kgf/cm2，温度121℃时，逐步关小各排汽阀门，保温保压25-30min。

保压时间到，关蒸汽，此时应即从分过滤器进无菌空气，开排气阀，关闭罐顶的所有阀门，开冷却水对发酵罐进行降温，待温度冷至35℃左右进行接种。