实验专题模块二基质金属明胶酶与肿瘤的关系ppt课件
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本专题实验中，我们将用明胶酶谱法检测一系列肿瘤 患者以及对照正常人血清中MMP-2与MMP-9的活性， 以探讨其在肿瘤患者血清中的表达水平，从而加深同 学们对肿瘤侵袭转移过程的认识。
实验 酶谱法分析食管癌中MMP-2与MMP-9活性
一、实验目的
掌握酶谱法测定MMP-2与MMP-9活性的原理 熟悉酶谱法操作技术 了解测定MMP-2与MMP-9活性的意义
MMP-9又称为明胶酶B，其基因位于染色体20q12-q13，主 要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产生。以 前酶原（相对分子质量为78～82Da）的形式合成，后经裂解 掉19个氨基酸的信号肽，再糖基化而转变成相对分子质量为 95Da的酶原形式，酶原降解掉N端73个氨基酸产生此酶的活 化形式（相对分子质量为84kDa）。
“快慢离子”理论：
电泳开始时，样品在浓缩胶pH=6.8，甘氨酸电离较小，甘氨 酸根离子带电最少，移动最慢，是“慢离子”。而HCl完全解离 成氯离子，氯离子移动最快，是“快离子”。蛋白速度居中。
催化剂
+
丙烯酰胺
甲叉双丙烯酰胺
聚丙烯酰胺
聚丙烯酰胺凝胶特性
在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中
不溶 对pH和温度变化较稳定 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，
则样品分离重复性好 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度
（一） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
电泳 带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极 作定向移动的现象称为电泳。
ν质点移动速度，q质点所带净电荷量，E为电场强度，r为质点半径， η为介质粘度。
聚丙烯酰氨凝胶电泳 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺 在催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。过 硫酸铵的催化作用需要TEMED的帮助。
2.不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度以及电 位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应 ，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及 分辨率均较前者佳。
不连续系统的特点：
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液 为pH6.7的Tris-HC1
3）极少数肿瘤细胞在循环系统中存活，形成癌栓，随血流、 淋巴流迁移到另一远隔部位或器官；
4）肿瘤细胞与靶器官的毛细血管壁发生黏附，穿出血管形 成微小转移灶，细胞增殖并产生新的血管，形成与原发肿 瘤性质一致的继发瘤，肿瘤细胞可以发生二次侵袭和转移。
肿瘤细胞的侵袭移动
A
C
B
D
肿瘤细胞侵袭是指肿瘤细胞粘附并穿越细胞外基质，包括三 个重要的步骤：粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，细胞 经缺口移动。
实验专题模块二 基质金属明胶酶与肿瘤的关系
肿瘤转移（Tumor Metastasis）是指肿瘤细胞脱离原发生长
部位，通过各种途径的转运，在机体内远离原发部位的器 官/组织继续增殖生长，形成转移瘤的过程。 大体包括以下步骤：
1）原发灶肿瘤细胞大量增殖，新生血管生长； 2）肿瘤细胞从原发灶脱落，侵袭细胞外基质与基底膜，进 而侵入血管、淋巴管或体腔。在这过程中，肿瘤细胞会分 泌包括基质金属蛋白酶在内的多种酶类；
肿瘤细胞对周围组织和血管的侵袭是肿瘤细胞转移的关键步 骤。
转移的肿瘤细胞在原灶外存活和增殖，这是癌症对人类生命 的最大威胁。
MMP-2又称为明胶酶A，其基因位于人类染色体16q21，主 要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生。以相对分子质量为 72kDa的酶原形式分泌后，N端裂解掉80个氨基酸成为相对 分子质量为66Da或62Da而被激活为活化型MMP-2；
SDS及其作用 SDS，即十二烷基磺酸钠
SDS具有亲脂的长尾和亲水性头（带负电） SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构 给蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩
盖了，因而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用 如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的SDS，则蛋白质
分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的相对分子质量大小
SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳可用于测定相对分子质量大小
电泳时，需要注意凝胶网孔大小对分析的影响。凝胶浓度 越大，网孔越小，影响大分子的移动；凝胶浓度越小网孔 越大，对小分子的分子筛效应越小。
相对分子质量范围
适宜的凝胶浓度(%)
蛋白质
104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 5×105
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液 为pH8.9 Tris-HC1
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体 系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连 续性，这是样品浓缩的主要因素
浓缩胶的作用是把加入的样品浓缩至一个狭窄的区带
20-30 15-20 10-15 5-10
2-5
核 酸(DNA/RNA)
104
ຫໍສະໝຸດ Baidu
15-20
104–105
5-10
105-2×106
2-2.6
按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连 续系统和不连续系统两大类：
1.连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗 粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应分离。
二、背景与原理
酶谱法是酶活性的测定方法之一。
酶活性的大小通常由酶降解底物的速度与程 度决定。
酶谱法将酶的底物均匀地铺在聚丙烯酰胺凝 胶内，先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳分离，然后创造酶作用的适宜环境，使酶 恢复活性，在凝胶上降解底物。该凝胶通过 染色，可呈现酶作用的痕迹。比较不同样品 该痕迹的大小，可知酶活性的差异。
，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和
电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳 等有更高的分辨率
聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构。聚丙烯酰 胺凝胶电泳具有分子筛效应。蛋白质在该电 泳中保持完整的状态，依三种因素分开：蛋 白大小、形状和电荷。
实验 酶谱法分析食管癌中MMP-2与MMP-9活性
一、实验目的
掌握酶谱法测定MMP-2与MMP-9活性的原理 熟悉酶谱法操作技术 了解测定MMP-2与MMP-9活性的意义
MMP-9又称为明胶酶B，其基因位于染色体20q12-q13，主 要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产生。以 前酶原（相对分子质量为78～82Da）的形式合成，后经裂解 掉19个氨基酸的信号肽，再糖基化而转变成相对分子质量为 95Da的酶原形式，酶原降解掉N端73个氨基酸产生此酶的活 化形式（相对分子质量为84kDa）。
“快慢离子”理论：
电泳开始时，样品在浓缩胶pH=6.8，甘氨酸电离较小，甘氨 酸根离子带电最少，移动最慢，是“慢离子”。而HCl完全解离 成氯离子，氯离子移动最快，是“快离子”。蛋白速度居中。
催化剂
+
丙烯酰胺
甲叉双丙烯酰胺
聚丙烯酰胺
聚丙烯酰胺凝胶特性
在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中
不溶 对pH和温度变化较稳定 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，
则样品分离重复性好 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度
（一） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
电泳 带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极 作定向移动的现象称为电泳。
ν质点移动速度，q质点所带净电荷量，E为电场强度，r为质点半径， η为介质粘度。
聚丙烯酰氨凝胶电泳 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺 在催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。过 硫酸铵的催化作用需要TEMED的帮助。
2.不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度以及电 位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应 ，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及 分辨率均较前者佳。
不连续系统的特点：
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液 为pH6.7的Tris-HC1
3）极少数肿瘤细胞在循环系统中存活，形成癌栓，随血流、 淋巴流迁移到另一远隔部位或器官；
4）肿瘤细胞与靶器官的毛细血管壁发生黏附，穿出血管形 成微小转移灶，细胞增殖并产生新的血管，形成与原发肿 瘤性质一致的继发瘤，肿瘤细胞可以发生二次侵袭和转移。
肿瘤细胞的侵袭移动
A
C
B
D
肿瘤细胞侵袭是指肿瘤细胞粘附并穿越细胞外基质，包括三 个重要的步骤：粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，细胞 经缺口移动。
实验专题模块二 基质金属明胶酶与肿瘤的关系
肿瘤转移（Tumor Metastasis）是指肿瘤细胞脱离原发生长
部位，通过各种途径的转运，在机体内远离原发部位的器 官/组织继续增殖生长，形成转移瘤的过程。 大体包括以下步骤：
1）原发灶肿瘤细胞大量增殖，新生血管生长； 2）肿瘤细胞从原发灶脱落，侵袭细胞外基质与基底膜，进 而侵入血管、淋巴管或体腔。在这过程中，肿瘤细胞会分 泌包括基质金属蛋白酶在内的多种酶类；
肿瘤细胞对周围组织和血管的侵袭是肿瘤细胞转移的关键步 骤。
转移的肿瘤细胞在原灶外存活和增殖，这是癌症对人类生命 的最大威胁。
MMP-2又称为明胶酶A，其基因位于人类染色体16q21，主 要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生。以相对分子质量为 72kDa的酶原形式分泌后，N端裂解掉80个氨基酸成为相对 分子质量为66Da或62Da而被激活为活化型MMP-2；
SDS及其作用 SDS，即十二烷基磺酸钠
SDS具有亲脂的长尾和亲水性头（带负电） SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构 给蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩
盖了，因而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用 如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的SDS，则蛋白质
分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的相对分子质量大小
SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳可用于测定相对分子质量大小
电泳时，需要注意凝胶网孔大小对分析的影响。凝胶浓度 越大，网孔越小，影响大分子的移动；凝胶浓度越小网孔 越大，对小分子的分子筛效应越小。
相对分子质量范围
适宜的凝胶浓度(%)
蛋白质
104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 5×105
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液 为pH8.9 Tris-HC1
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体 系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连 续性，这是样品浓缩的主要因素
浓缩胶的作用是把加入的样品浓缩至一个狭窄的区带
20-30 15-20 10-15 5-10
2-5
核 酸(DNA/RNA)
104
ຫໍສະໝຸດ Baidu
15-20
104–105
5-10
105-2×106
2-2.6
按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连 续系统和不连续系统两大类：
1.连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗 粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应分离。
二、背景与原理
酶谱法是酶活性的测定方法之一。
酶活性的大小通常由酶降解底物的速度与程 度决定。
酶谱法将酶的底物均匀地铺在聚丙烯酰胺凝 胶内，先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳分离，然后创造酶作用的适宜环境，使酶 恢复活性，在凝胶上降解底物。该凝胶通过 染色，可呈现酶作用的痕迹。比较不同样品 该痕迹的大小，可知酶活性的差异。
，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和
电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳 等有更高的分辨率
聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构。聚丙烯酰 胺凝胶电泳具有分子筛效应。蛋白质在该电 泳中保持完整的状态，依三种因素分开：蛋 白大小、形状和电荷。