电泳分离法左瑾瑜.共25页文档
22.电泳分离法
CH2-CH2 NH (CH2-CH2 NH )n 2-CH2 N CH CH2 CH2
CH2
CH2 COOH
加成度不同的混 合物，分子量大 小不同，胺基和 羧基的比例不同 。
COOH
两性电解质载体是IEF-PAGE中最关键的试剂， 它直接影响pH梯度的形成及蛋白质的聚焦。
因此，要选用优质两性电解质载体，在凝胶中， 其终浓度一般为1％～2％。
3、点样
4、安装装置
5、电泳：电场强度为10~25V/cm,0.5~2h.
6、显色:染色、漂洗、检测
醋酸纤维素薄膜电泳装置
醋酸纤维素薄膜电泳的应用：
医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，
其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电
泳分辨率高。
特点：由于介质的孔径度大，没有分子筛效 应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。
2、影响迁移率(电泳淌度)的因素
1）．电场强度 是指每厘米的电位降，也称电位梯度
(电势梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。根据 电场强度的不同，电泳可分为两种。
(1)常压(100～500 V)电泳 其电场强度为2～10 V／cm。 分离时间较长，从数小时到数十小时，适合于分离蛋白质 等大分子物质。 (2)高压(2000～10000 V)电泳 其电场强度为50～200V／ cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、 多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。
目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密 切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中 必不可少的手段。
22.2 电泳过程基础
一、电泳过程原理 1、自由溶液中的电泳过程 当一个球形带电颗粒在黏性介质中受到电场的作用而迁 移时，所受的作用包括电场力和摩擦阻力。在自由溶液 中摩擦阻力服从Stocks定律。当电场力与摩擦阻力达 qE 到平衡时颗粒做恒速迁移，从而导出：v 从上式可知，颗粒电泳迁移速度v与电场强度E和带电 颗粒的净电荷量q成正比，而与颗粒半径r和介质黏度η 成反比。 带电颗粒在电场中迁移速的不同是电泳分离的基础。
电泳法纯化分离蛋白质流程
电泳法纯化分离蛋白质流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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电泳分离法左瑾瑜
在CZE缓冲液中加入可微观分相的高分子离 PICEC 子 OTCEC ACE CGE 使用固定相涂层毛细管 在CZE缓冲液中加入亲和作用试剂 管内填充凝胶介质，用CZE缓冲液
•谢谢大家
•以阳离子分离为例：
A+ B+ L+
C+ L+ T+ A+ B+ C+ T+ 低 浓 度 区
高 浓 度 区
•等速电泳中，可以根据任何一条区带中的电场强度来确定某种离子 的存在，根据区带的宽度来确定某种离子的相对含量。 •等速电泳既可以用于离子性物质的制备，也可以用于离子的定性和 定量分析。 •等速电泳分离效率高，速度快，选择性好，易于自动化，一些复杂 样品甚至可以不经前处理直接进行分离分析。 •电解质溶液的选择：1、应使待分离的有效离子淌度差异尽可能大； 2、根据样品的性质和基体情况，还要考虑前导电解质PH值、与目标 离子带相反电荷的缓冲配对离子、溶剂、其他添加剂等。
Fra bibliotek9.2.2电解分离法的分类和应用
•1、控制电位电解分离法 •2、控制电流电解分离法 •3、汞阴极电解分离法 •4、内电解分离法
9.3 电泳分离法
9.3.1分离原理
•电泳是在电场作用下，电解质溶液中的带电粒子向两级作定向移动的一种电迁 移现象。 •分离依据：带电粒子在 上的差别。 •在电场强度为E的电场强度下带电荷Q的粒子的迁移率μ可写成
•4、电泳时间 •电泳时间愈长，离子迁移距离愈大，一般情况下对分离是有利的。但 是，随着离子迁移距离的增加，电泳带的宽度也会增加，对分离是不 利的。分离性质相似的元素，单靠增加电泳时间收效不大。 按分离原理分类
等点聚焦电泳、双向电泳、蛋白质印记电泳、毛细管电泳
电泳法纯化分离蛋白质流程
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9.6 电泳分离法
两种离子在 t 时间内迁移的距离差
V sA A t L
V sB B t L V V Δs sA sB ( A B ) t Δ t L L
Δμ、t 、V / L三者的值越大，分离的越完全。 影响分离的因素？
2013-5-22
影响带电粒子分离程度的因素
（3）外加电位梯度
在L一定时，两电极间的电压越高，分离所需时间越
短，分离也越完全。
但是，在增大电压的同时产生更多的焦耳热，使介质
温度升高，扩散加剧等影响,带来不利影响。电压要适当！
（4）电泳时间
电泳时间越长，离子迁移距离越大，对分离有利。 但是，同样产生扩散加剧等影响。电泳时间要适当！
第九章 分析测定中常 用的分离方法
第六节 电泳 分离法
9.6.1 电泳分离法的 原理
9.6.2 电泳分离法的 分类 9.6.3 电泳分离法的 应用
2013-5-22
电泳分离法
1937年，Tiselius(瑞典科学家)将蛋白质混合液放在两 段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次 将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋 白。获1948年诺贝尔化学奖。 电泳(Electrophoresis)是带电离子 在电场作用下发生迁移的过程。利用 电泳现象对某些化学或生物化学物质 进行分离分析的技术叫电泳技术或电 泳法。
2013-5-22
9.6.1 电泳分离法的基本原理
电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子 具有不同的迁移速率。迁移速率与哪些因素有关？ 带电球形粒子在单位电场（1V/cm)下的泳动速率
E Q 6 π r
s/t sL E V / L Vt
电泳分离法左瑾瑜.PPT25页
电泳分离法左瑾瑜.
1、 舟 遥 遥 以 轻飏， 风飘飘 而吹衣 。 2、 秋 菊 有 佳 色，裛 露掇其 英。 3、 日 月 掷 人 去，有 志不获 骋。 4、 未 言 心 相 醉，不 再接杯 酒。 5、 黄 发 垂 髫 ，并怡 然自乐 。
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
第八章电泳分离技术
现在学习的是第23页，共78页
第三节 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯 基乙醇，则生物大分子的迁移率主要取决于它 的分子量，而与原来所带电荷、分子形状无关 。
现在学习的是第24页，共78页
3.1 基本原理： 1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远
聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明 ，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电 渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。
PAGE按凝胶的形状可分为：圆盘状电泳
垂直或平板状电泳
现在学习的是第9页，共78页
CH2=C H C=
ONH
CH2= CHC=O
NH
2
丙烯酰胺(Acr)
CH2 NH
Aprotinin
6500
现在学习的是第38页，共78页
10 凝胶（脱色之后）结果分析
1、计算迁移率（Rm值）：
蛋白样品距加样端迁移距离(cm)
相对迁移率=
溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)
2、绘制标准曲线：以标准蛋白亚基的Rm值为横坐标， 以相应分子量的对数值为纵坐标，即可绘制出测定蛋 白质分子量的标准的线图。
7. 剥 胶
注意保持胶的完整性。
现在学习的是第36页，共78页
8 染色
1.染色液：
考马思亮蓝G-250 1.0克
甲醇
450ml
冰醋酸
100ml
加H2O 到
9 脱色
1000ml
1.脱色液：
甲醇
100ml
冰醋酸
100ml
加H2O 到
1000ml
现在学习的是第37页，共78页
电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片
电化学分离法
2.高效毛细管电泳的基本理论
ⅳ）阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细
管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。
第三十五页，共103页。
第三十六页，共103页。
2.高效毛细管电泳的基本理论
ⅴ）温度的影响
毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。 温度变化来自于“焦耳热”；
聚四氟乙烯（Polytetrafluoroethene，一般称作 “不粘涂层”；是一种使用了氟取代聚乙烯中所有 氢原子的人工合成高分子材料。
这种材料具有抗酸抗碱、抗各种有机溶剂的特 点，几乎不溶于所有的溶剂。同时，聚四氟乙烯具 有耐高温的特点，它的摩擦系数极低，所以可作润 滑作用之余，亦成为了水管内层的理想涂料。
实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 ν电渗流 = Lef/teo
Lef —毛细管有效长度； teo—电渗流标记物（中性物质） 的迁移时间。
第二十二页，共103页。
2.高效毛细管电泳的基本理论
3）HPCE中电渗流的方向
电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；
（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中 的流速；
（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；
在HPCE中，控制电渗流非常重要。
第二十六页，共103页。
第二十七页，共103页。
第二十八页，共103页。
电渗在电泳分离中扮演着重要角色，是伴随电泳产生 的一种电动现象。多数情况下，电渗流速度是电泳速度的5-7
4）应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材
第六章电化学分离法
一、电泳分离法的原理
2）电解质溶液的组成 据（6－1）式，溶液组成不同，粘度不同，导致
迁移率不同。另外，电解质组成不同，有时会改变 测定物的电荷及半径，从而导致迁移率不同。
一、电泳分离法的原理
3）外加电位梯度
电位梯度是指每厘米的平均电位降，即V/L，当L一 定时，加在两电极间的电压越高，分离所需的时间越 短，分离越完全。
3）HPCE中电渗流的方向
电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；
2.高效毛细管电泳的基本理论
改变电渗流方向的方法： （1）毛细管改性 表面键合阳离子基团； （2）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英
最基本、应用广的分离模式；
4.高效毛细管电泳的分离模式
2）毛细管凝胶电泳（CGE） 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按 大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐， 分离效率高。 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关， CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序 的重要手段。
在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层 向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将 引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν 电渗流。
2.高效毛细管电泳的基本理论
2）HPCE中电渗流的大小
电渗流的大小用电渗流速度ν电渗流表示，取决于电 渗淌度μ和电场强度E。即
ν电渗流 = μ E 电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即
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36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
END
ห้องสมุดไป่ตู้
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃