第三讲(1) 限制性酶切方式及连接
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限制酶切方式及连接
1 限制酶切的方式
1.1 单酶切
1.2 双酶切 1.3 部分酶切 1.4 完全酶切
1限制酶切的方式
1.1 单酶切 若DNA样品是环状DNA分子，产生与识 别序列（n）相同的DNA片段数。 若DNA样品是L—DNA片段，完全酶切产 生n+1个DNA片段，其中有两个片段的一端 仍保留原来的末端。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
T4 DNA ligase
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
T4 DNA ligase
连接类型： DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA dsDNA互补黏性末端或平末端 注意：使用时一定要对反应体系进行优化。
E.coli DNA ligase 催化dsDNA片段互补黏性末端之间的连 接； 对于dsDNA片段平末端之间的连接效率 较低。 注意：使用时一定要对反应体系进行优化。
双酶切可以在不同的反应系统中进行。 A 需要较低盐浓度的酶先切割，然后升高盐浓 度，另一个酶切割； B 最适反应温度较低的酶先切割，然后升高温 度，另一个酶切割； C 第一个酶切割后，经凝胶电泳回收DNA， 再选用合适反应系统，进行第二个酶的切割。
D 双酶切在同一个反应系统中。
假如： 第二个酶热稳定性强。 如何操作？
DNA ligase 催化的连接反应特点： 1 必须在一条 DNA链的3‘末端有一个游离的羟 基，另一条链的5‘末端有一个磷酸基团。 2 连接反应中需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助 因子和激活因子。 3 不能连接两条单链DNA分子或环化的单链 DNA分子，被连接的必须是双螺旋的一部分。 4 只封闭双螺旋DNA骨架上的缺口。
1 限制酶切的方式
1.3 部分酶切 指限制酶对其在DNA分子上的全部识别序 列进行不完全的切割。 用途：当某种限制酶的多个识别序列之中 有一个识别序列恰好在回收待用的DNA片段 上，若完全酶切，将此DNA片段从中切断。 为了解决这个问题，就需要用到部分酶切， 以满足实验的需要。
2 限制酶切后的连接
EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA ligase
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
重组体
具平末端DNA片段之间的连接
5‘CAAGCTCA3’ 3’GTTCGAGT5’ AluI
1限制酶切的方式
1.1 单酶切 酶切体系：
反应体系
13µL 2µL 4µL 1µL
ddH2O 10×buffer 底物DNA 限制酶 总体积：20µL
酶切步骤： ⑴加样； ⑵摇匀，短时离心； ⑶反应1—3h； ⑷反应终止。 65℃水浴10—15min
1限制酶切的方式
1.2 双酶切 用不同的限制酶切割同一DNA分子的方法。 环状DNA分子完全酶切的结果，产生DNA 片段数是两种限制酶识别序列数之和。 线性DNA分子完全酶切的结果，产生DNA 片段数是两种限制酶识别序列数加1.
5‘GGACTG-0H 3’CCTGACTTAA-P E.coR I 切割 P-AATTCTGCAA-3’ 0H-GACGTT-5’ E.coR I切割
DNA ligase 5‘GGACTGAATTCTGCAA-3’ 3’CCTGACTTAAGACGTT-5’ E.coR I 识别序列
结论： 待连接的两个DNA片段的末端如果是 用同一个酶切割的，连接后仍保留原限制 酶的识别序列。
AluI AGCT HindⅢ AAGCTT
结论： 如果两个DNA片段的末端是用同一种 酶切割后产生的，连接后的DNA分子仍 保留那种酶的识别序列，有的会出现另一 种新的限制酶识别序列。
思考题： 1 限制酶切的方式 2 限制酶切后的连接
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
载体自连
重组体
目的基因自连
不同限制酶切位点的连接
Eco 百度文库Ⅰ切割位点
GAATTC CTTAAG
Bg lⅡ切割位点
AGATCT TCTAGA
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
P-CTCA-3’ 5’CAAG-OH OH-GAGT5’ 3’GTTC-P
5’GTAGCTTA3’ 3’CATCGAAT5’ AluI
P-CTTA3’ 5’GTAG-OH OH-GAAT-5’ 3’CATC-P
T4 DNA ligase 5’CA AGCT TA-3’ 3’GT TCGA AT-5’
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
T4 DNA ligase
重组体
载体自连
目的基因 自连
为了得到更多的重组DNA分子，不 仅考虑反应体系中DNA末端的总浓度， 而且要考虑载体与插入片段的末端浓 度的比例。
2.3 DNA片段之间的连接 具互补黏性末端之间的连接 具平末端之间的连接
具互补黏性末端片段之间的连接
ds-DNA结构: 裂口, 缺口, 断口
3'HO P5' 3'HO P5'
裂口(gap)
缺口(nick)
断口(cut)
2.2 影响连接反应的因素 2.2.1 反应温度 黏性末端 4—15℃ 平末端 10—20℃ 2.2.2 连接酶浓度 黏性末端 0.1个单位 平末端 1-2个单位 2.2.3 ATP浓度 2.2.4 DNA片段末端
2.1 DNA ligase: 能催化dsDNA片段紧靠在一起的3‘羟基 末端与5’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键， 使两末端连接的一种核酸酶。
依据反应时需要能量辅助因子的不同分类： 依赖ATP的DNA ligase 依赖NAD+的DNA ligase 依据来源分： T4 DNA ligase E.coli DNA ligase 热稳定 DNA ligase
1 限制酶切的方式
1.1 单酶切
1.2 双酶切 1.3 部分酶切 1.4 完全酶切
1限制酶切的方式
1.1 单酶切 若DNA样品是环状DNA分子，产生与识 别序列（n）相同的DNA片段数。 若DNA样品是L—DNA片段，完全酶切产 生n+1个DNA片段，其中有两个片段的一端 仍保留原来的末端。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
T4 DNA ligase
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
T4 DNA ligase
连接类型： DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA dsDNA互补黏性末端或平末端 注意：使用时一定要对反应体系进行优化。
E.coli DNA ligase 催化dsDNA片段互补黏性末端之间的连 接； 对于dsDNA片段平末端之间的连接效率 较低。 注意：使用时一定要对反应体系进行优化。
双酶切可以在不同的反应系统中进行。 A 需要较低盐浓度的酶先切割，然后升高盐浓 度，另一个酶切割； B 最适反应温度较低的酶先切割，然后升高温 度，另一个酶切割； C 第一个酶切割后，经凝胶电泳回收DNA， 再选用合适反应系统，进行第二个酶的切割。
D 双酶切在同一个反应系统中。
假如： 第二个酶热稳定性强。 如何操作？
DNA ligase 催化的连接反应特点： 1 必须在一条 DNA链的3‘末端有一个游离的羟 基，另一条链的5‘末端有一个磷酸基团。 2 连接反应中需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助 因子和激活因子。 3 不能连接两条单链DNA分子或环化的单链 DNA分子，被连接的必须是双螺旋的一部分。 4 只封闭双螺旋DNA骨架上的缺口。
1 限制酶切的方式
1.3 部分酶切 指限制酶对其在DNA分子上的全部识别序 列进行不完全的切割。 用途：当某种限制酶的多个识别序列之中 有一个识别序列恰好在回收待用的DNA片段 上，若完全酶切，将此DNA片段从中切断。 为了解决这个问题，就需要用到部分酶切， 以满足实验的需要。
2 限制酶切后的连接
EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA ligase
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
重组体
具平末端DNA片段之间的连接
5‘CAAGCTCA3’ 3’GTTCGAGT5’ AluI
1限制酶切的方式
1.1 单酶切 酶切体系：
反应体系
13µL 2µL 4µL 1µL
ddH2O 10×buffer 底物DNA 限制酶 总体积：20µL
酶切步骤： ⑴加样； ⑵摇匀，短时离心； ⑶反应1—3h； ⑷反应终止。 65℃水浴10—15min
1限制酶切的方式
1.2 双酶切 用不同的限制酶切割同一DNA分子的方法。 环状DNA分子完全酶切的结果，产生DNA 片段数是两种限制酶识别序列数之和。 线性DNA分子完全酶切的结果，产生DNA 片段数是两种限制酶识别序列数加1.
5‘GGACTG-0H 3’CCTGACTTAA-P E.coR I 切割 P-AATTCTGCAA-3’ 0H-GACGTT-5’ E.coR I切割
DNA ligase 5‘GGACTGAATTCTGCAA-3’ 3’CCTGACTTAAGACGTT-5’ E.coR I 识别序列
结论： 待连接的两个DNA片段的末端如果是 用同一个酶切割的，连接后仍保留原限制 酶的识别序列。
AluI AGCT HindⅢ AAGCTT
结论： 如果两个DNA片段的末端是用同一种 酶切割后产生的，连接后的DNA分子仍 保留那种酶的识别序列，有的会出现另一 种新的限制酶识别序列。
思考题： 1 限制酶切的方式 2 限制酶切后的连接
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
载体自连
重组体
目的基因自连
不同限制酶切位点的连接
Eco 百度文库Ⅰ切割位点
GAATTC CTTAAG
Bg lⅡ切割位点
AGATCT TCTAGA
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
P-CTCA-3’ 5’CAAG-OH OH-GAGT5’ 3’GTTC-P
5’GTAGCTTA3’ 3’CATCGAAT5’ AluI
P-CTTA3’ 5’GTAG-OH OH-GAAT-5’ 3’CATC-P
T4 DNA ligase 5’CA AGCT TA-3’ 3’GT TCGA AT-5’
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
T4 DNA ligase
重组体
载体自连
目的基因 自连
为了得到更多的重组DNA分子，不 仅考虑反应体系中DNA末端的总浓度， 而且要考虑载体与插入片段的末端浓 度的比例。
2.3 DNA片段之间的连接 具互补黏性末端之间的连接 具平末端之间的连接
具互补黏性末端片段之间的连接
ds-DNA结构: 裂口, 缺口, 断口
3'HO P5' 3'HO P5'
裂口(gap)
缺口(nick)
断口(cut)
2.2 影响连接反应的因素 2.2.1 反应温度 黏性末端 4—15℃ 平末端 10—20℃ 2.2.2 连接酶浓度 黏性末端 0.1个单位 平末端 1-2个单位 2.2.3 ATP浓度 2.2.4 DNA片段末端
2.1 DNA ligase: 能催化dsDNA片段紧靠在一起的3‘羟基 末端与5’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键， 使两末端连接的一种核酸酶。
依据反应时需要能量辅助因子的不同分类： 依赖ATP的DNA ligase 依赖NAD+的DNA ligase 依据来源分： T4 DNA ligase E.coli DNA ligase 热稳定 DNA ligase