尿蛋白SDS_琼脂糖凝胶电泳实验方法建立及临床应用

大步,但实际效果如何还有待进一步的验证。

1992年英国国家生物标准及控制研究所(NI B2 SC)组织了9个国家的22个实验室进行协作,制备了编号为89/644的纤维蛋白原标准品,ICTH建议作为国际标准品向WH O推荐。

由于影响因素较多,纤维蛋白原标准品的使用只解决了纤维蛋白原测定标准化的一部分问题。

1992年NCC LS就APTT测定的暂行规范颁布了H292T文件。

到目前为止,ICSH和ICTH还未提出APTT测定标准化的方案。

(收稿日期:2004204211)(本文编辑:赵允文)中图分类号:R446.12+2 文献标识码:A尿蛋白S DS-琼脂糖凝胶电泳实验方法建立及临床应用吴惠毅1,孙召东1,刘安定2,仇为民1,祝捷凯3,杨新玲1(1.江苏连云港市第一人民医院检验科;2.蚌埠医学院检验系实习生,安徽蚌埠,233000;3.江苏大学医学技术学院实习生)摘要:目的　建立尿蛋白十二烷基磺酸钠(S DS)-琼脂糖凝胶(AGE)电泳方法。

方法　分别对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四种琼脂糖、不同的缓冲对、电压和电泳时间进行实验,确定最佳的分离条件,建立测定方法并应用于临床。

检测临床尿蛋白阳性标本57份。

结果　当Ⅳ型琼脂糖凝胶浓度为40g/L,S DS含量为0.1%,在pH7.0的AMP-咪唑-HCl缓冲体系下进行电泳,可以有效的将尿蛋白按分子量大小进行分离。

57份临床尿蛋白阳性标本电泳结果表明,生理性蛋白尿24例、中、高分子5例、小分子1例和混合型17例。

结论　本法具有分离效果好、操作简便、灵敏度高、成本低廉等优点,可以将尿蛋白按分子量大小分为小分子、中分子以及混合型,对肾脏疾病的受损部位和损伤程度的判断具有较高的价值,适于基层实验室的常规开展。

关键词:尿蛋白;琼脂糖凝胶电泳;十二烷基磺酸钠 蛋白尿是肾脏疾病的重要的临床表现之一,正确判断蛋白尿性质、来源及损伤的程度对指导临床治疗具有重要的意义。

S DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS-PAGE)[1]由于其具有分子筛作用,可以将蛋白质按分子量大小进行分离,是临床用于分析尿蛋白较为理想的方法,但其操作繁琐,需预浓缩尿液,技术要求高,检测时间长,不能满足临床常规大批量标本检测。

Bricon等[2]报道应用十二烷基磺酸钠-琼脂糖凝胶电泳(S DS-AGE)法分离尿蛋白获得与S DS-PAGE同样的结果,且操作简单、快速、尿标本不需要预浓缩,可以有效地将尿蛋白按分子量大小分为低分子、中分子、高分子。

法国Sebia公司相继推出商品化试剂盒,现已在国内许多大医院使用[3,4],但其价格昂贵,难以在国内广泛推广应用。

我们在Bricon报道的基础上,通过大量的实验,摸索出最佳分离条件,并依此建立了适合于国内常规开展的尿蛋白S DS-AGE方法,经临床应用结果满意,现报道如下。

1　材料与方法1.1　仪器　DYY2电泳槽(北京六一仪器厂), ECP3000电泳仪(北京六一仪器厂)1.2　试剂1.2.1　琼脂糖凝胶缓冲液　称取S DS1.0g,22氨基22甲基21,32丙二醇(AMP)3.5g,咪唑1.7g,硼酸0123g,加蒸馏水溶解,混匀后用HCl调节至pH7.0,定容至1000ml。

1.2.2　电极缓冲液　称取S DS1.0g,AMP3.5g,咪唑3.4g,硼酸0.23g,加蒸馏水溶解,用1.0m ol/L HCl 调整至pH7.0,定容至1000ml。

1.2.3　染色液　1.5g考马斯亮蓝R250溶于227ml 甲醇,加46ml冰醋酸,用蒸馏水定容至500ml,混合后滤纸过滤。

1.2.4　脱色液　112ml甲醇,加28ml冰醋酸,加蒸馏水至500ml。

1.2.5　标本处理液　1.0g S DS溶于100ml凝胶缓冲液,再加入2ml巯基乙醇。

1.2.6　40g/L琼脂糖凝胶　4.0g琼脂糖Ⅳ(S olon Industrial Parkway・S olon,Ohio US A),加入凝胶缓冲液100ml,加热溶解,贮存于冰箱备用。

1.2.7　2%溴酚蓝溶液　2.0g溴酚蓝溶于100ml 95%乙醇。

1.3　临床标本　57例蛋白尿标本来自我院门诊及住院病人,其中男性31例,女性16例,年龄14-62岁。

对照组来自我院健康体检中心。

留取晨尿10ml,2500rpm离心5min备用。

1.4　方法1.4.1　凝胶板的制备　超薄琼脂糖凝胶板制备按文献[5]报道的方法进行,所不同的是在制备好的琼脂糖凝胶板上用自制打槽器打一5mm×1.2mm加样槽。

1.4.2　标本处理　80μl标本加入20μl标本处理液,再加入少量2%溴酚蓝,旋转混匀。

如蛋白浓度大于2g/L,应先用生理盐水稀释至2g/L后,再加样本处理液。

1.4.3　加样　用微量加样器加5μl处理好的标本液于加样槽中。

1.4.4　电泳　加好样的凝胶板放入电泳槽,盐桥为六层滤纸,60V恒压,电泳30min。

1.4.5　干燥　取下凝胶板,用电吹风吹干。

1.4.6　染色　吹干的凝胶板放入染色液中染色30 min。

1.6.7　脱色　取出凝胶板,放入脱色液中,脱色至背景无色。

2　结　果2.1　琼脂糖凝胶的选择　分别应用不同浓度的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四种类型琼脂糖凝胶进行蛋白电泳,观察在不同浓度条件下尿蛋白的分离效果,尿蛋白阳性标本经Sebie公司S DS-AGE结果证实,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三种琼脂糖对高分子蛋白的分离效果较差,即不能有效地将中高分子蛋白分离;而Ⅳ型琼脂糖可以将蛋白有效的地分为低、中、高分子量蛋白,且分离效果满意。

琼脂糖的浓度对琼脂糖凝胶分离蛋白的效果也有较大的影响,实验中发现,分离效果随着琼脂糖凝胶浓度的增加而增加,当其浓度≥40g/L时,分离效果最佳,结果见封3图6,但随着琼脂糖凝胶浓度的加大,制板难度也随之增加,因此我们最终选择Ⅳ型琼脂糖,其浓度为40g/L。

2.2　缓冲液的选择　将MOPS、T ris、T rince、AMP、咪唑分别与HCl组成缓冲对,然后进行实验,结果表明,均达不到理想的分离效果;我们进行了缓冲对之间的组合实验,结果发现,在AMP-咪唑-HCl缓冲体系中,在pH为7.0时蛋白质分离效果最佳。

2.3　电压、电泳时间选择　分别在不同的电压条件下进行电泳实验,结果表明,电压越高,电泳速度越快,但随之产热也越多,经过多次实验,我们发现在60V恒压条件下,电泳30分钟即可达到满意分离效果。

2.4　S DS浓度的影响　我们分别将样本处理液中的S DS配置成0.55%～2.0%浓度,缓冲液中S DS 配置成0.05%～1.0%浓度,然后进行实验,结果表明,样本处理液中S DS浓度为1.0%时效果最好,当其浓度达2.0%时,虽然对分离效果无影响,但影响染色结果,大分子量蛋白着色明显变浅。

缓冲液中S DS最佳浓度为0.10%。

2.5　与Sebia检测试盒比较　应用我们建立的方法与法国Sebia试剂盒同时检测临床不同类型的蛋白尿阳性标本,结果,除在电泳速度略慢于Sebia法外,检测结果两法完全一致。

2.6　临床应用　应用我们建立的方法,检测尿蛋白阳性标本57例,10例健康成年人,结果见表1。

而10例健康成年人仅见微弱白蛋白区带。

表1　57例尿蛋白阳性标本电泳结果蛋白尿类型例数百分率(%)生理性蛋白尿2442.1中、高分子58.8小分子1119.3小分子、中分子、高分子1729.83　讨　论琼脂糖是一种链状多糖物质,可形成高筛网状结构,对物质进行分离。

琼脂糖的类型很多,不同类型的琼脂糖有不同的理化性质,如强度、电渗流等,因此,不同类型的琼脂糖适合于不同物质的分离。

琼脂糖凝胶电泳技术由于其分辨率好、灵敏度高、结果易于保存等优点,在国外已经得到广泛应用。

我们曾报道应用琼脂凝胶电泳[6,7]分析尿蛋白,可将尿蛋白分为白蛋白、α1、α2、β、γ五条区带。

S DS-AGE之所以能将蛋白质按分子大小排列,是因为S DS是一种阴离子表面活性剂,当其浓度达到蛋白质量的5～10倍时,与还原剂共同作用,能使蛋白质分子内的氢键及二硫键断裂,解离成单独的亚基,亚基与S DS充分结合形成带负电荷的亚基-S DS胶束,所带的电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而消除了不同分子之间原有的电荷差异[2]。

实践中我们发现,不仅琼脂糖类型对分离效果有影响,而且凝胶的浓度也是决定分离成败的重要因素之一。

本文实验表明,在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四种琼脂糖中,以40g/LⅣ型琼脂糖分离效果最好,可以将尿蛋白按低、中、高分子量进行有效分离。

缓冲溶液、pH、电压等是影响S DS-AGE电泳的重要因素。

Bricon等[2]报道S DS-AGE法在中性pH条件下进行,缓冲液为咪唑-HCl,我们对其进行了多次重复实验,未能重复实验结果,出现中高分子蛋白分离不开,区带较宽。

我们重新选择了缓冲系统,尝试了MOPS、T ris、T rince、AMP-HCl缓冲系统,并进行了不同的配对实验,结果表明,在咪唑-HCl缓冲体系中加入AMP及硼酸,可有效地提高分离效果。

临床应用结果表明,本法可将尿蛋白按其分子量大小分为低分子、中分子、高分子,10例健康成年人仅见到微弱白蛋白区带,对肾脏疾病的诊断、鉴别诊断、指导治疗和判断预后具有重要的价值,且方法操作简单、快速、不需要特殊的仪器设备、成本低廉,检测结果与法国Sebia试剂盒一致,我们在实验中采用超薄琼脂糖凝胶制备技术,具有较高的测定灵敏度,凝胶板易于保存,可以满足于临床常规批量检测要求。

参考文献:[1]M iltenyi M,Tulassay T,T ausz T,et al.Urinary protein patterns for dif2ferential diagnosis of glomerular of nong omerular hematuria[J].Clin Nephrol,1984,22(5):105-108.[2]Le Bricon T,Erilich D,Beng ou fa D,et al.S odium dodecyl sulfate2a2garose gel electrophoresis of urinary proteins:application to multiple myeloam[J].Clinical Chem istry,1998,44(6):1191-1197.[3]沈　霞,张敏华,汪　萍,等.非浓缩尿蛋白电泳的临床应用[J].中华医学检验杂志,2001,24(5):266-268.[4]陈　立,庄叶萍.S DS-AGE非浓缩尿蛋白电泳的建立和应用[J].天津医科大学学报,2002,8(1):109-110.[5]赵绍林,吴惠毅.超薄琼脂糖凝胶板简易制备技术[J].临床检验杂志(待发表).[6]吴惠毅,王学珍.尿蛋白琼脂糖电泳法[J].中华医学检验,1988,11(5):285-287.[7]陈　晋,吴惠毅,沈来龙,等.尿蛋白超薄琼脂糖凝胶电泳[J].临床检验杂志,1994,12(3):158.Experimental Study on Sodium Dodecy1Sulfate2agarose G elE lectrophoresis of U rinary Protein and Clinical ApplicationW U Hui2yi,S UN Z ao2dong,LI U An2ding,et al(Department of Clinical laboratory,The first people’s hospital of Lianyungang, Lianyungang,222002,China)Abstract:Objective　T o establish an electrophoresis method of S odium dodecy1sulfate2agarose gel electrophoresis(S DS2AGE)to separte the urine protein.Methods　have tried different m odel agarose,different king of bu ffer,different electric v oltage and time in electrophoresis, in order to obtain the best separation condition,and then be used.The method is used for determining57positive urine protein sam ples.R e2 sults　When theⅣagarose gel concentration is40g/L,the S DS content is0.1%and the AMP2Imidazole2HCl electrode bu ffer is in pH7. 0,the urine sam ples can be separated effectively by m olecular weight.The results of57urine sam ples can be divided into24m oderate m olecu2 lar protein,5m oderate and high m olecular protein,11low mlecular protein,17mixed m olecular protein respectively.Conclusion　The cost of this method is low,m ore sim ple and highly sensitive.The urine protein can be divided by m olecular weight into m oderate m olecular protein, m oderate and high m olecular protein,low m olecular protein and mixed protein,which have great value in judging the damaged part and degree of the kidney.I t is suitbale for the grass2roots laboratory to carry out as a routine.K ey w ords:urine protein;agarose gel electrophoresis;S DS(收稿日期:2004209221)(本文编辑:赵允文)浙江省临床检验管理与技术规范征订通知各医疗机构:《浙江省医疗机构管理与诊疗规范丛书》之《浙江省临床检验管理与技术规范》分册由浙江省卫生厅组织省各质控中心有关专家编写。