2015年分子生物学实验技能
分子生物学实验课：定量PCR-2015
荧光定量PCR原理－Ct值与模板起始量的关系
LogX0 ＝Log M －Ct Log（1＋e）
起始模板量越多，
Sample
Ck 104
Ck 102
荧光达到域值的循环数
越少，即Ct值越小。
Cycle number
Log模板起始浓度与 Ct值呈线性关系，根据 样品Ct值，就可以计算 出样品中所含的模板量
R
探针
延伸反应
R
R
每扩增一条 DNA分子，释 放一个荧光信 号，可以在循 环过程中任一 点检测荧光
TaqMan探针
实时荧光定量PCR的分类－－几种方法的比较
方法
SYBR Green 方法
TaqMan 方 法
优点 适用性广
灵敏 方便 便宜
特异性高
重复性好
缺点
适用范围
引物要求高
易出现非特异性 带
适合科研中对各种目的 基因定量分析，基因表 达量的研究，转基因重 组动植物的研究
绝对定量分析
拷贝数计算 拷贝数＝（质量÷分子量）×6.0×1023
倍比梯度稀释法 可用已知拷贝数的质粒DNA作为标准品，做
系列稀释 通常由5个点组成，使用的稀释系列最好每个
梯度选一个点.(1:10,1:100,1:1000,…)
绝对定量分析
R very close to 1(≥0.985) Eff.应介于90%～110%； Eff.过小：抑制因素、引物条件 Eff.过大：加样错误、探针降解
荧光定量PCR常用概念
Baseline（基线）
• Baseline(基线)：扩增曲线中的水平部分，在PCR开始几个循环内所发 散的荧光信号，这段时间内定量PCR仪器还未能检测到PCR产物的扩 增，缺省设置为3-15个循环的荧光信号。 （背景荧光信号)
分子生物学的实验技术与方法
分子生物学的实验技术与方法随着科技的不断发展，分子生物学在近年来成为一个极其活跃的领域，也受到越来越多人的关注。
分子生物学是研究生命体系结构、功能、全基因组组成等领域的学科，而分子生物学的实验技术与方法则是研究生命体系结构、功能、全基因组组成等领域的重要支撑。
1. 分子生物学实验技术与方法的概括分子生物学实验技术与方法是研究生命现象和机制的重要手段。
它包括了一系列的技术分析和方法，如基因测序技术、PCR技术、蛋白质组学、转染技术、组织培养技术、荧光技术等等。
其中，基因测序技术是目前最重要的技术之一。
它可以解析DNA序列中的各个碱基、基因等结构元素，为生物学研究提供了极为有利的手段。
PCR技术也是分子生物学实验技术中比较受欢迎的一种技术，它是一种快速检测DNA和RNA的方法，可以在很短的时间内扩增出多个相同的DNA片段或RNA片段，为分析和研究生物的基因、蛋白质等提供了便利。
此外，蛋白质组学是分子生物学研究中另一个重要的手段。
它可以帮助研究人员了解蛋白质的分子结构、功能和相互作用，是研究生物体内各种信号和代谢途径的重要方法。
2. 基因测序技术基因测序技术是分子生物学实验技术中的一项重要技术。
它是指通过一系列的实验步骤，将生物样品中的DNA分离开来，然后通过被称为“测序仪”的机器设备，解析出其DNA序列信息，最终得到一个完整的基因组序列。
基因测序技术的核心是测序仪，目前主要有Illumina、Pacific Biosciences等几种测序仪。
基因测序技术的应用范围非常广泛，如研究一个特定基因的结构和表达情况、找出某些基因存在的异常及其对人体健康的影响等。
当然，基因测序技术的应用不仅局限于科学方面，它还可以应用于医疗诊疗、个性化医学、疾病预防等多个领域。
3. PCR技术PCR技术是一种利用DNA聚合酶扩增DNA的特定技术。
这种技术可以在短时间内扩增出大量的DNA片段，达到检测目的。
PCR技术的核心是DNA聚合酶，通过PCR技术可以扩增任意长度的DNA片段，如检测特定的基因序列等。
第03章 分子生物学实验基本操作技术
第3章分子生物学实验基本操作技术这里的实验基本操作技术是指在分子生物学实验中使用范围最广、使用频率最高、几乎所有实验都要应用的技术。
器皿的清洗，试管、量筒（杯）、容量瓶、吸管及移液器、电子天平等量具的正确操作和使用、试剂配制等技术，应当都是基本操作技术，但这些内容已在分析化学、生物化学的实验课程中作了详细介绍。
本章主要介绍与分子生物学实验有关的除（灭）菌技术、无菌操作技术和微量操作技术。
3.1 除(灭)菌技术在进行分子生物学实验过程中，需要一个清洁的实验环境，所使用的器皿及溶液均需要进行除（灭）菌处理，一方面避免环境中微生物的污染，另一方面还可消除蛋白酶和核酸酶对实验的干扰和影响。
在进行微生物及细胞的纯培养时要求更高，不能有任何外来杂菌。
因此，对所有器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，保证工作顺利进行。
实验室常用的除灭菌方法主要有物理方法及化学方法两种。
物理方法包括用湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线、过滤、离心沉淀等方法除去微生物；化学方法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀死或抑制微生物。
根据被灭菌物品的材料性质和实验要求，可采取不同的消毒灭菌方法。
3.1.1 物理灭菌法（1）干热灭菌：干热灭菌包括火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。
火焰灼烧适用于金属用具，如接种环、接种针和手术器械等，玻璃器皿的口颈，如试管口和瓶口，玻璃棒等的灭菌处理。
这种方法灭菌迅速彻底。
热空气灭菌一般在烤箱中进行，利用高温干燥空气（160℃~170℃）加热灭菌1~2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。
干热消毒后的器皿干燥，易于保存。
缺点是干热传导慢，可能有冷空气存留于烤箱内，因此要求较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的。
应当注意，干烤灭菌完毕后不得马上将烤箱门打开，须等温度降至70℃以下时再开箱门，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。
在灭菌时，物品不能放的太挤。
灭菌的玻璃器皿中不可有水，有水的玻璃器皿在干热灭菌时容易炸裂。
分子生物学实验操作方法与技巧(2).ppt
溶液III的配制
• 溶液 III ：3 M 醋酸钾（KAc）缓冲液， pH 5.6。 5 M 冰醋酸。 • 配制：500 ml • 醋酸钾 147 g • 冰醋酸 57.5 ml • 加入300 ml去离子水后搅拌溶解。待醋酸 钾溶解后，再加去离子水将溶液定容至500 ml。高温高压（121˚C，20分钟）灭菌后， 4℃保存。
• 和表达载体pET32等）上。
• 生化试剂：一般多为分析纯，少数为化学纯。 • 水：最好的是超纯水，其次为三(双)蒸水，最差为去离子水，
一般很少用自来水。
• 高效酶类：限制酶，修饰酶，连接酶，Taq酶，pfu等。 • 经典的分子生物学工具书：分子克隆（目前出到第三版），
精编分子生物学实验指南（目前出到第四版）等。
价格昂贵，一般合成1kb基因约需花费5000-6000元，3-4星 期时间。
• （3）自己合成寡核苷酸引物并拼接：采用OE-PCR技
术，不需要原始材料，一般自己合成基因的费用约相当于专 业公司合成价格的三分之一至二分之一，所需时间视个人操 作技巧。
什么是质粒？
• 质粒是独立于染色体外的DNA分子，其大小范 围在１KB至２００KB以上不等。大多数来自 细菌细胞的质粒是双链、共价闭合的环状分 子，以超螺旋形式存在。 • 至少在实验室，大多数质粒是通过写信获取 而并不需要自己动手构建。所有的质粒，无 论来自于商家还是科技工作者，在用于实验 以前一定要进行验证（验证的方法一般为酶 切、电泳）！
分子生物学2015年硕士(1)
显色反应：探针直接标记酶或间接结合酶，酶在有特
异性底物存在的情况下，可发生显色反应。一般情况
下，大都是通过间接法结合酶。即探针标记了半抗原，
如地高辛或生物素，再抗地高辛的抗体或抗生物素蛋
白的配体（avidin）结合酶，酶在有底物存在的情况
下再发生显色反应。
即: A
B
C
酶+底物
显色
探 标记物 抗 针 (地高辛) 体
DNA变性时，在260nm处的紫外吸光度增加，这种现象又称 增色效应。当增色效应达到最大值的50%时温度，称熔解温度 （melting temperature Tm值），Tm值表明DNA溶液中一半的 DNA双链已解离为单链，也就是说，Tm值反映了DNA变性的程度 和难易，Tm值越大，变性越难，反之，变性容易。
• (2) siRNA途径
• (3) shRNA表达载体途径
• (2) siRNA途径: • 小干扰RNA，长21-23bp，双链。 • 作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA
介导的静默复合物(RISC)，siRNA的反义链引 导RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA ，最终导致特定基因表达的抑制。
• (3) siRNA浓度是否和脱靶效应相关？
• 以前认为高浓度会产生脱靶效应，实际上 低浓度同样会产生脱靶效应。
• (4) 转染试剂是否也会造成脱靶效应？
• 有人采用基因芯片检测对转染试剂造成的 细胞基因表达影响发现，某脂质体L2K可以 引发1908个基因的表达变化，既包括下调 ，也包括上调。如果恰好转染试剂本身会 导致某基因表达上调，可能出现转染siRNA 后该基因可能会出现表达不变甚至增强的 现象，从而出现假阴性现象，如果恰好转 染试剂本身会导致某基因表达下调，则会 出现假阳性现象。
分子生物学实用技术实验操作教程
实验一 CTAB法提取植物基因组总DNA及分析一、实验目的分离纯化植物DNA是植物分子生物学和基因工程的基本技术要求，CTAB法是提取植物基因组DNA的一种新型方法，可以抽提许多其它方法难以抽提的植物材料（如含多酚较多的植物材料、干燥后的茶叶、老树根等）中的DNA，得率高，质量好，用于PCR、Southern杂交、分子标记、DNA文库构建等。
二、基本原理植物材料在液氮中研磨可以迅速破坏其细胞壁，游离出细胞器和原生质，并防止DNA降解。
采用CTAB （十六烷基三甲基溴化胺，一种非离子型去污剂）抽提液抽提（65℃）上述研磨物，在高盐条件下不但溶解细胞膜相物质，而且CTAB与核酸形成可溶性的复合物，采用离心可以将变性的蛋白质和多酚、多糖等杂质（沉淀相）去除，水相中含有核酸与CTAB的复合物及其它可溶性的杂质。
直接向水相中加入异丙醇则导致核酸的沉淀，CTAB和其它多数杂质留于异丙醇与水的混合相中，吸出核酸沉淀团经过多次乙醇漂洗和沉淀、TE溶解得到DNA粗提物。
粗提的DNA一般可用于粗略PCR等。
用于精细PCR、Southern杂交和DNA文库构建的DNA则应进一步纯化。
用RNase水解RNA，用酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提去除蛋白杂质等，经乙醇沉淀后可获得较为纯净的植物总DNA。
三、实验材料甘蓝型油菜(Brassica napus L.)幼叶。
四、主要仪器设备及耗材Eppendorf 5804R低温离心机，Hettich Universal 32R低温离心机，Eppendorf Minispin离心机，Sanyo SIM-F124制冰机，TOMY SS-325自动灭菌锅，Millipore Elix纯水系统，Eppendorf research微量移液器系列，GingTian JA2003A电子天平，Satorius PB-10 pH计，HH·S21-4-S恒温水浴锅，UVP GDS8000自动高效紫外透视成像仪，DYY-8C型双稳定时电泳仪及水平电泳槽，Gene spec I快速核酸蛋白自动分析仪，长岭BCD-239家用冰箱，TNZ-30-50液氮生物容器及液氮，微波炉，研钵，离心管（15ml、1.5ml），枪头（10、200和1000μl），两面板，枪头盒，离心管盒（1.5ml）等。
分子生物学实验技术
138211050
马志刚
138311026
杨惠雯
1425郝杏飞
142511002
任 幸
142511003
宁 凤
142511004
朱泽森
142511005
吴文芳
142511008
刘靖疆
142511009
毕桃玲
142511010
彭元亮
分子生物学实验技术
时间：2015年6月22－26日（第二批）
分子生物学实验技术
时间：2015年6月15－19日（第一批）
地点：湘雅新校区后栋417实验室
146611019
葛小路
146611020
赛步青
146904006
王海潮
146911002
陈 明
146911010
周超文
146911011
杨玮春
146911016
吴 鑫
147211007
彭舟扬帆
147211012
蒋璐璐
148211265
胡腾惠
148311007
曹 赠
148311008
吴传聪
148311010
彭 晖
148311011
王 静
148311012
罗玲珑
148311013
袁玲芝
148311014
吴 帅
148311015
蒋小霞
148311016
舒志浩
148311017
贺 婷
148311018
雷 厉
148311019
地点：湘雅新校区后栋418实验室
148111003
谢波文
148111004
郑 珍
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术分子生物学实验技术专注于研究生物分子的结构、功能和相互作用。
通过分析和操作不同的生物分子，分子生物学实验技术可以为生物学研究提供有力的工具和方法。
本文将介绍分子生物学实验技术的一些常见方法和应用。
第一部分：DNA和RNA的分析与操作方法（1000字）在分子生物学研究中，DNA和RNA是最常见的研究对象之一。
了解DNA和RNA的序列、结构和相互作用对于我们理解生物基因组、遗传变异和蛋白质合成等过程至关重要。
以下是一些常见的DNA和RNA的分析与操作方法：1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种通过DNA的放大，使其达到可以检测的程度的技术。
它可以扩增DNA片段并产生大量的复制品。
PCR的优点是速度快、灵敏度高、操作简便。
这使得它在基因检测、基因组测序和遗传变异研究等领域得到广泛应用。
2. 基因克隆：基因克隆是指将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA 中，形成重组DNA分子的过程。
通过克隆，可以研究和操纵特定的DNA 序列，以确定其功能、表达和调控。
常用的克隆方法包括限制性内切酶消化和连接技术，例如使用DNA连接酶将DNA片段连接到载体上。
3. DNA测序：DNA测序是指确定DNA序列的过程。
它是研究基因组、疾病突变和基因功能的重要工具。
常见的DNA测序方法包括链终止法和碱基测序法。
链终止法使用有标记的二进制探针和DNA聚合酶，通过测量信号强度来确定DNA序列。
碱基测序法则通过测量不同碱基释放的荧光信号来确定DNA序列。
4. RNA干扰（RNAi）：RNA干扰是一种通过干扰RNA分子的转录和翻译过程来沉默特定基因表达的技术。
通过使用双链RNA或小分子RNA（siRNA）来介导干扰，可以选择性地抑制或沉默特定的基因，从而研究其功能和相互作用。
第二部分：蛋白质的分析与操作方法（1000字）蛋白质是生物体内最重要的功能分子之一。
了解蛋白质的结构、功能和相互作用对于研究生物学和疾病机制至关重要。
实验一、分子生物学的基本操作及常用仪器的介绍
一、实验目的
1、掌握分子生物学实验的基本方法和技能 2、熟悉分子生物学常见实验仪器的基本操作 3、了解分子生物学实验的特点 4、学会正确书写定量实验报告
二、分子生物学实验的特点 1、分子生物学实验主要应用化学原理和方法所设计 的科学实验，也渗进了一些相关学科的理论知识与 方法。 2、由于研究对象为生物体，所以标本的来源不易， 微量和定量是分子生物学实验的一大特点。 3、分子生物学实验往往涉及生物大分子和生物材料 的检测，因此取材常为生物体的组织器官，甚至是 活的生物体。所以很难保证样品、标本的无菌性， 要注意作好自身防护。 4、与临床医学关系密切
三、分子生物学实验室规则 1、实验室、实验桌凳勿乱涂写刻画；上课须统一穿白 大衣。这也是为了同学门自身的卫生与安全，因为实 验过程中会用到一些有毒或危险试剂等。 2、每次实验课前均要清点实验桌上自己面前的一套试 管架上各种仪器是否齐备，如有破损，及时提出更换。 3、实验过程中，注意节约药品试剂，节约水电。药品 试剂用后即盖上，废弃物品不能乱丢，需由值日生统 一收集。 4、实验课后均要将用过的仪器试管进行清洗，并整理 台面。
1、拿比色杯时，应取比色杯两毛面，用完后及时清洗 比色杯，避免用手指直接接触或用粗糙的纸擦拭透光 面，以免弄脏或磨毛。 2、向比色杯中倒液体时，注意勿过多或过少，一般占 2/3～3/4体积，以和槽架的横档持平为准。比色杯倒 完液后，用擦镜纸将外杯身液体擦干。（由下往上， 以免将杯口液体带出）。 3、不准将比色槽拿出。比色时不要将比色杯放置在仪 器上，以免液体漏出腐蚀仪器。
四、基本操作
（一）仪器的清洗 1、一般玻璃仪器：如试管烧杯量筒三角瓶等，先用自 来水洗刷，用毛刷沾少许肥皂粉或去污粉洗刷；再用自 来水反复冲洗，去尽肥皂水或去污粉直至无泡沫，最后 用蒸馏水淋洗2～3次，干燥备用。 2、做定量实验或要求严格时，除了用去污剂外，还需 以热洗液洗涤一次（或冷洗液浸泡过夜），而后再用蒸 馏水淋洗2～3遍。洗液由浓硫酸—重鉻酸钾—水按一定 比例根据不同需要配成。
分子生物学专家的100个分子生物学研究技巧
分子生物学专家的100个分子生物学研究技巧作为一名分子生物学专家，我们需要掌握一定的实验技巧和分析能力，在研究分子生物学方面，更需要具备敏锐的洞察力和严密的思维方式，以便从繁复的实验数据中汲取营养，发掘潜在的科学发现。
下面列出100个分子生物学研究技巧，从实验设计到数据分析，留给读者参考与思考。
1. 不断学习，了解最新的实验技巧和研究进展，关注科研领域的前沿知识；2. 对样品浓度、操作步骤、参数设置等细节进行严密的把控；3. 熟练掌握各种分子生物学实验，如PCR、Western blot、蛋白质组学、转染、流式细胞术等；4. 创建实验步骤清单，及时记录实验数据、结果和分析；5. 尽可能多地运用质控组和标准品，以保证实验的可重复性和准确性；6. 选择恰当的实验平台、荧光探针和检测系统；7. 在样品准备、采样、振荡时注意卫生和安全，确保工作环境清洁、整洁；8. 实验前认真规划实验流程，熟悉实验设备的使用，避免仪器操作不当而导致的实验失败；9. 在制备基因组库时，需要正确选取DNA质控珂片样板，避免出现异常结果；10. 预先选取符合样品要求的反应体系和实验方法；11. 实验中要注意样品和试剂的稳定性，确保实验前后的实验条件一致；12. 进行荧光定量PCR实验时，应该严格遵守标准反应系统的组成、使用步骤和反应条件；13. 定期维护实验设备，避免仪器的老化和故障；14. 对实验数据进行严格的分析和解读，从大量的数据中甄选有意义的信息；15. 在实验前进行实验流程图的绘制，明确实验下手的各个环节和时间节点；16. 在实验过程中做好实验记录和观察，记录好各种实验细节和现象；17. 对分子生物学实验常识和实验规范、标准要进行深入研究和掌握；18. 多方面的研究和比较不同的实验技术和实验方法，以优化自己的实验流程；19. 学会鉴别和分析仪器故障的原因和性质，及时维修和更换仪器；20. 尽可能多地使用生物信息学工具对实验结果进行预测、探讨和验证；21. 在实验数据分析阶段提高自身的数据处理技能和数据可视化能力；22. 在实验前下定决心和做好准备，及时调整自己的实验心态和实验压力水平；23. 学会寻找并参考同领域的综述文章和文献，及时了解分子生物学前沿研究进展和研究趋势；24. 详细阅读实验说明书和相关的文献资料，并充分准备实验所需的技术和设备；25. 在实验设计和样品准备阶段，应保持高度的创造性和数据保密性，避免实验失败或数据泄漏的风险；26. 选择恰当的实验对象和实验样品，避免实验数据的误导和偏差；27. 学会利用在线公共数据库和软件，及时获取分子生物学相关数据和信息；28. 在实验前进行充分的文献资料查阅，提高自身的学术水平和研究技能；29. 定期组织和参加学术活动和研究讨论会，不断提高自身的研究水平和研究技能；30. 学会利用可视化技术对分子生物学数据进行展示和表达。
分子生物学实验技术李帅
研究生课程考试卷学号、姓名： 20152522 李帅年级、专业： 2015级预防兽医学培养层次：硕士课程名称：分子生物学实验技术授课学时学分：考试成绩：授课或主讲教师签字：实验一、聚合酶链式反应（PCR ）一、实验目的及要求掌握PCR 扩增技术的原理及PCR 体系建立的基本操作。
二、实验原理Polymerase Chain Reaction 是模拟DNA 的复制过程，在体外特异性扩增DNA 片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA 。
三、试验材料与试剂DNA 模板引物 （primer ）:上游引物；下游引物dNTP: 4种脱氧核糖核苷酸 10* PCR 缓冲液 （buffer ） Taq DNA 聚合酶（Taq polymerase ）Taq PCR 反应试剂盒：dNTPs ；模板DNA ；引物；10×PCR buffer;Taq 酶；ddH 20四、实验步骤（1）反应体系的建立取0.2ml 的薄壁离心管，按下表加入试剂—稍混匀，短暂离心把溶液甩至管底。
（2）PCR 的变温程序（热循环反应） 94℃ 4 min 94℃ 40s50℃ 40s 30 Cycles 72℃ 1 min 72℃ 10min 4℃ forever设置PCR 反应的变温程序,把离心管放进PCR 仪进行扩增—反应结束后低温保存或检测。
（3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物取2-5ul 反应液，于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察结果。
成分 25uL 反应体系dNTP 0.5uL 模板 0.5uL 引物 0.5uL Buffer 2.5uL 酶 0.5uL 水20.5uL预混物五、结果与讨论扩增出目的条带。
六、分析1、PCR扩增的影响因素：退火温度，引物的质量，模板DNA的质量，聚合酶的量，Mg2+浓度2、Mg2＋作用：dNTP—Mg与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性，一般的情况下Mg 的浓度在0.5—5mM之间调整，在调整dNTPs浓度后要相应调整其浓度。
《分子生物学检验技术》课程标准
《分子生物学检验技术》课程标准课程编号：17050021总学时数：72学时（理论40课时，实验32）学分：4.5分一、课程性质、目的与要求分子生物学检验技术是医学检验的专业课之一。
本大纲为本科医学检验专业学生教学的指导性纲要，通过对该课程的学习，掌握分子生物学检验技术的基本内容（概念、术语、原理）、基本方法（PCR、核酸杂交、DNA重组、芯片技术等）以及在临床实验诊断中的应用。
对分子诊断学的发展动态有所了解。
二、本课程的基本内容第一章绪论2课时（一）教学目的与要求1、熟悉分子生物学检验技术的历史、发展趋势2、掌握基因、单基因遗传病和多基因遗传病的概念3、掌握分子生物学检验技术在临床实验诊断中的五个应用领域（二）教学的重点与难点1、重点：基因、单基因遗传病和多基因遗传病的概念2、难点：分子生物学检验技术在临床实验诊断中的应用（三）课时安排：2学时（四）主要内容第一节分子诊断学的概念、任务和特点（0.4）课时第二节分子诊断学的发展简史（0.3）课时第三节分子诊断的基本策略及其在医学中的应用（1）课时第四节展望（0.3）课时第二章基因与基因组 6课时(一）教学目的与要求1、掌握基因与基因组的概念2、熟悉基因组的结构特征3、掌握质粒的概念类型及一般性质4、掌握转位因子的概念、类型及转位的遗传效应5、熟悉DNA病毒基因组的总体特征6、掌握真核生物基因组的特点，包括细胞核基因组和细胞质基因组结构和功能，单顺反子、短列基因、多基因家族、多态性、基因重叠的概念，重复序列的分类7、掌握基因结构异常的概念、类型；掌握端粒的概念、结构特点及主要作用，端粒酶组成、特点和作用，端粒酶活性测定及其临床意义（二）教学的重点与难点1、重点：（1）生物基因组的结构特征；基因与基因组的概念（2）质粒的概念、类型及一般性质；单顺反子、短列基因、多基因家族、多态性、基因重叠的概念，重复序列的分类（3）基因结构异常的概念、类型；2、难点：转位因子的概念、类型及转位的遗传效应；多基因家族、多态性、基因重叠的概念，重复序列的分类（三）课时安排：6课时（四）主要内容第一节基因与基因组概论（1）课时1、基因的概念及其发展2、基因组与C值矛盾3、基因组学及其意义第二节真核生物基因组（2）课时1、真核生物基因组的结构与功能特点2、人类基因组计划3、人类基因组多样性第三节原核生物基因组（2）课时1、原核生物基因组的一般特点2、质粒3、转座基因第四节病毒基因组（1）课时1、病毒基因组的核酸类型2、病毒基因组的大小及碱基组成3、病毒基因组的结构与功能特点第三章分子克隆 6课时（一）教学目的与要求1、掌握常用的工具酶，熟悉DNA常用的重组载体2、了解DNA重组与鉴定，了解外源基因的蛋白表达3、掌握DNA序列测定的原理（二）教学的重点与难点1、重点：（1）常用的工具酶的用途（2）DNA序列测定的原理2、难点：（1）DNA序列测定的原理（2）DNA重组与鉴定，外源基因的蛋白表达（三）课时安排：6课时（四）主要内容第一节工具酶（2）课时1、限制性核酸内切酶2、DNA聚合酶3、DNA连接酶4、碱性磷酸酶5、T4多核苷酸激酶6、核酸酶S1第二节载体（1）课时1、克隆载体2、表达载体3、穿梭载体第三节分子克隆的基本步骤（2）课时1、目的基因的获取2、载体的选择3、目的基因和载体的连接4、将重组DNA导入受体细胞5、重组体的筛选和鉴定第四节克隆基因的表达（1）课时1、原核生物基因表达的特点2、真核生物基因表达的特点3、提高克隆基因表达效率的途径第四章核酸分子杂交技术 4课时（一）教学目的与要求1、掌握核酸分子杂交的基本原理2、掌握核酸杂交中的基本概念：探针、变性、复性、融解温度3、掌握核酸分子杂交技术的技术要点和影响杂交的主要因素4、了解核酸分子杂交的方法学评价及其应用（二）教学的重点与难点1、重点：（1）核酸分子杂交的基本原理（2）核酸杂交中的基本概念：探针、变性、复性、融解温度（3）核酸分子杂交技术的技术要点和影响杂交的主要因素2、难点：核酸分子杂交技术的技术要点和影响杂交的主要因素（三）课时安排：4课时（四）主要内容第一节核酸分子杂交的基本原理（1）课时1、核酸变性2、核酸复性第二节核酸探针（2课时）1、核酸探针的种类2、核酸探针的标记3、核酸探针的纯化4、核酸探针的检测第三节核酸分子杂交的影响因素（1）课时第四节核酸分子杂交的类型1、固相核酸分子杂交类型2、液相核酸分子杂交第五章核酸扩增技术 6课时（一）教学目的与要求1、掌握PCR、RT-PCR的基本原理，及PCR的反应体系和条件2、了解以PCR为基础的相关技术3、熟悉PCR产物的检测4、熟悉PCR技术在临床基因诊断中的应用（二）教学的重点与难点1、重点：（1）PCR、RT-PCR的基本原理，及PCR的反应体系和条件（2）PCR技术在临床基因诊断中的应用2、难点：PCR的反应体系和条件选择与控制（三）课时安排：6课时（四）主要内容第一节聚合酶链反应技术（2）课时1、PCR技术原理2、PCR反应体系及其优化3、扩增产物检测及分析4、常见问题原因分析与处理5、PCR衍生技术第二节荧光定量PCR技术（2）课时1、荧光定量PCR技术基本原理2、荧光定量PCR技术3、荧光定量PCR测定的数据处理4、实时荧光定量PCR技术的应用第三节其他扩增技术（1）课时1、基于转录扩增技术2、探针扩增技术3、信号扩增技术第四节临床基因扩增检验实验室的管理与质量控制（1）课时1、临床基因扩增实验室的管理与质量控制2、操作人员培训3、临床基因扩增实验室的规范化设置第六章 DNA序列测定 3课时（一）教学目的与要求1、掌握Sanger双脱氧链末端终止法的基本原理及反应条件2、熟悉化学降解法的基本原理3、了解其他测序方法（二）教学的重点与难点1、重点：（1）Sanger双脱氧链末端终止法基本原理（2）化学降解法的基本原理2、难点：Sanger双脱氧链末端终止法基本原理（三）课时安排：3课时（四）主要内容第一节Sanger双脱氧链末端终止法（2）课时1、测序原理2、测序体系3、方法特点第二节 Maxam-Gilbert化学降解法（1）课时1、测序原理2、测序体系3、方法特点第三节其他测序技术（自学）第四节自动化测序（自学）第八章生物芯片技术与应用 2课时（一）教学目的与要求1、掌握生物芯片的概念、分类2、熟悉DNA芯片的制备过程及应用3、了解蛋白质芯片和缩微芯片技术（二）教学的重点与难点1、重点：（1）生物芯片的概念、分类（2）DNA芯片的杂交与检测应用2、难点：DNA芯片的制备过程及检测原理（三）课时安排：2课时（四）主要内容第一节基因芯片（1）课时1、芯片微阵列制备2、样品的制备及标记3、样品与基因芯片的杂交4、杂交结果的检测及分析第二节蛋白质芯片（0.3）课时1、蛋白质芯片的原理2、蛋白质芯片的分类3、蛋白质芯片的制备及分析4、蛋白质芯片的应用第三节组织芯片（0.0.4）课时1、组织芯片的分类2、组织芯片的制备3、组织芯片的应用第四节液相芯片（0.3）课时1、液相芯片检测技术的原理及特点2、液相芯片检测技术的应用第章蛋白质组学技术3学时（一）教学目的与要求1、熟悉蛋白质组学研究基本技术2、熟悉蛋白质问相互作用的研究技术3、了解蛋白质组学的生物信息学分析（二）教学的重点与难点1、重点：（1）双向凝胶电泳技术、蛋白质芯片技术（2）酵母双杂交技术2、难点：酵母双杂交技术（三）课时安排：3课时（四）主要内容第一节蛋白质组学研究基本技术（1.5）课时1、双向凝胶电泳技术2、生物质谱技术3、蛋白质芯片技术4、蛋白质印迹法第二节蛋白质问相互作用的研究技术（1.0）课时1、酵母双杂交技术2、免疫共沉淀技术第三节蛋白质组学的生物信息学分析（0.5）课时1、蛋白质定性鉴定2、蛋白质翻译后修饰分析第三章核酸的分离与纯化 4课时（一）教学目的与要求1、掌握核酸的分离与纯化的设计、原则和保持核酸完整性的方法2、熟悉核酸分离与纯化的技术路线，核酸浓度、纯度和完整性的鉴定的原理与方法3、掌握DNA提取和纯化的方法原理及其应用4、熟悉质粒DNA抽提的方法及应用5、掌握总RNA的分离与纯化的方法原理及应用，mRNA的分离与纯化的方法原理（二）教学的重点与难点1、重点：（1）核酸的分离与纯化的设计、原则和保持核酸完整性的方法（2）核酸浓度、纯度和完整性鉴定的原理与方法（3）真核生物基因组DNA和mRNA的分离与纯化的方法原理2、难点：（1）保持核酸完整性的方法（2）质粒DNA的提取和RNA的分离与纯化（三）课时安排：4课时（四）主要内容第一节核酸的分离与纯化的设计、原则（1）课时第二节 DNA提取和纯化的方法原理及其应用（1）课时第三节质粒DNA抽提的方法及应用（1）课时第四节总RNA及mRNA的分离与纯化的方法原理（1）课时第十章感染性疾病的分子诊断 4课时（一）教学目的与要求1、掌握病毒的基因检测、细菌的基因检测、衣原体的基因检测、支原体的基因检测2、熟悉梅毒螺旋体的基因检测、真菌的基因检测（二）教学的重点与难点1、重点：（1）病毒的基因检测（2）细菌的基因检测（3）衣原体的基因检测、支原体的基因检测（4）梅毒螺旋体的基因检测2、难点：（1）病毒的基因检测与应用（2）细菌的基因检测与应用（三）课时安排：4课时（四）主要内容第一节病毒的基因检测（1）课时1、乙型肝炎病毒2、单纯疱疹病毒3、风疹病毒4、巨细胞病毒5、人类免疫缺陷病毒第二节细菌的基因检测（1）课时1、结核分支杆菌2、淋病奈瑟菌3、O157型大肠埃希菌4、幽门螺旋杆菌5、细菌耐药基因的检测第三节衣原体的基因检测（0.5）课时第四节支原体的基因检测（0.5）课时第五节梅毒螺旋体的基因检测（1）课时第六节原虫的基因检测（自学）第七节真菌的基因检测（自学）三、教学方法以教师讲授为主，辅以多媒体教学手段，并结合学生的练习与实验。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳学号：xxxxxxxx南⽅医科⼤学20X级硕⼠研究⽣分⼦⽣物学实验报告SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳作者：XXX学号：XXX班级：硕⼠X教班组号：第X（X）组专业： XXXXXXX2015年1⽉1⽇SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定蛋⽩质的分⼦量（南⽅医科⼤学20X级硕⼠X教班分⼦⽣物学实验第X⼤组第X⼩组）1.引⾔SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是⽬前分离蛋⽩质亚基并测定其分⼦量的常⽤⽅法，为检测电泳后凝胶中的蛋⽩质，⼀般使⽤考马斯亮蓝（CBB）染⾊。
该法是⼀种经济、快速、⽽且可重复的⽅法。
依据混合蛋⽩的分⼦量不同来进⾏分离的。
SDS是⼀种去垢剂，可与蛋⽩质的疏⽔部分相结合，破坏其折叠结构，并使其⼴泛存在于⼀个⼴泛均⼀的溶液中。
1.1聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理1.1.1性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化⽐较稳定，在很多溶剂中不溶，是⾮离⼦型的，没有吸附和电渗作⽤。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在⼴泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度⾼和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是⽤丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作⽤下聚合⽽成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是⽤化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采⽤过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要⼀种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基⼄⼆胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的⾃由基，后者⼜使单体形成⾃由基，从⽽引发聚合反应。
叔胺要处于⾃由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分⼦氧阻⽌链的延长，妨碍聚合作⽤；⼀些⾦属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1⼩时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
分子生物学实验基本技术
汇报人：
目录
分子生物学实验技 术概述
基因克隆和表达技 术
PCR技术和相关技 术
分子杂交和印迹技 术
基因编辑技术
蛋白质技术和蛋白 质组学
分子生物学实验技 术概述
添加标题
定义：分子生物学实验技术是指在分子水平上研究 生物现象和过程的技术，包括基因克隆、基因表达、 基因突变、基因重组等。
蛋白质组学在分子生物学实验中的应用：研究蛋 白质的功能、调控机制和疾病发生机制等
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汇报人：
PCR技术和相关技 术
原理：通过DNA复制技术，将DNA片段扩增 步骤：包括模板DNA的制备、引物的设计、反应体系的配置、PCR反应的进行等 应用：广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变检测等领域 相关技术：包括实时荧光定量PCR、多重PCR、巢式PCR等
原理：逆转录-聚合 酶链反应技术，将 RNA逆转录为cDNA， 再进行PCR扩增
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Northern印迹技术：用于检测RNA序列，通过电泳将RNA片段分离，然后用放射性标记的探 针进行杂交，最后通过放射自显影检测杂交信号。
添加标题
应用：Southern印迹和Northern印迹技术广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变检 测等领域。
添加标题
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
优缺点：Southern印迹技术灵敏度高，但操作复杂，耗时长；Northern印迹技术操作简单， 但灵敏度较低。
基因编辑技术
应用：广泛应用于基因功能 研究、疾病治疗等领域
原理：利用Cas9蛋白对DNA进 行切割，形成双链断裂，从而 实现基因编辑
优势：操作简便、高效、精 确，可应用于多种生物体
局限性：存在脱靶效应，可 能导致非目标基因的突变
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导实验1 总DNA提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。
由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。
同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。
本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。
[实验目的]学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。
学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。
[实验原理]植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。
本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。
CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。
植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。
核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。
纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。
[实验器材]1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料[实验试剂]1、3×CTAB buffer（pH8.0）100mM Tris25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% β-巯基乙醇2、TE缓冲液（pH8.0）10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95％乙醇5、液氮[实验步骤]1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。
分子生物学实验操作方法与技巧
完全得不到有价值的结果，那才是最大的时间浪费。
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三• ．实验记录
实验记录是研究工作的一项极其重要的内容，是工作的基础。 而多数青年人对此常常不够重视。我曾经有一个学生，有吸烟 的习惯，一次在去仪器室做实验时，发现忘记带记录本，就把 身上的烟盒拆了，把实验结果记录记在烟合的背面，随后就把 这张纸弄丢了，恰恰这一实验用了一个宝贵实验材料，因此重 复这一实验十分费力。当然，现在的仪器都与计算机连接，结 果都存储在计算机内，但随手抓一个纸片记录实验结果是绝对 不能允许的坏习惯。
可以是致命的错误，向你传授经验的人是不会代你负责的。与此有关的一条经验是， 论文中的引用文献必需自己核对过，转引自其他文献同样可能发生 错误。
和 精确度。对不同实验结果的精确度有不同的要求，要求过高是一种浪费，给人以杀鸡焉用
牛刀之讥，过低则不能满足需要。给出数据，也有类似问题。每一项测定都有一定的精确度， 如果一项测定的精确度为三位有效数字，则给出三位以上数字不仅是完全没有意义的，并且只 能说明作者完全缺乏有效数字的概念，这不仅适用于直接获得的初始数据，对从初始数据得出 的次级数据也同样适用。例如，对一组精确度为三位有效数字的测定结果予以平均，给出四位 以上的平均数计算结果，也只能表明作者的无知。
实验计划、实验结果与小结
• 一．计划
-引自邹承鲁的《我的科学之路》
• 二．实验工作 • 三．实验记录 • 四．实验结果 • 五．实验小结
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一．计划 • 在开始工作前，制定一个现实可行的研究计划是必要的。除课题计划外，
分子生物学基本操作
上清用等体积酚抽提1次， 12000 rpm离心 10min，小心地吸取上清。 上清再用等体积的酚：氯仿抽提1次， 12000 rpm离心10min，收集上清。 上清再用等体积的氯仿抽提1次，收集上清。 上清中加入等体积TE（稀释调整NaCl浓 度），0.6倍体积异丙醇沉淀，12000 rpm离 心10min，70%乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后 溶于100ul TER中，取1ul电泳检测，其余的20℃保存备用。
0.5-1.5ml管 15%40%体积时;试管30% 体积以下，
水浴
提前10-30分钟调好温度;稳定 后才能使用;
水位不可以低于水浴锅高度 的50% 用合适浮子; 定时; 使用后需要添水或换水 关闭电源
离心
离心前，如果需要预冷，至少预冷15分 钟。盖好管盖，充分混匀； 质量对称放置； 不合适的离心管应外套其他型号的管子； 如离心0.2管，最好是放在0.5管套1.5管中； 如短暂离心可以放在1.5管中； 盖上离心机的内盖 离心后，如果要移动，放在试管架上移 动，防止破坏液面； 短暂离心要在3000-8000rpm范围内；时 间应短于30秒； 如果离心机被有机试剂或其它样品污染 当事人应及时清理
细菌DNA的提取
环状双链DNA、不与组蛋白结合（古菌具 有组蛋白类蛋白）、基因总数水平一般为 103-104，一般情况下，一个细胞中只有一 条染色体或一套基因组。
The E. coli genome is a circular double-stranded molecule of DNA; this DNA molecule is 4,639,675 base pairs in length and encodes 4267 genes.
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术分子生物学实验技术分子生物学是生物学的一项重要分支，它研究细胞分子机制、基因调控、遗传信息的传递、处理和表达等。
分子生物学实验技术是对分子生物学研究进行实验室操作和检测的方法与技术。
本文将从基础实验技术、基因克隆技术、基因表达技术、基因分析技术四个方面深入介绍分子生物学实验技术的相关内容。
一、基础实验技术在分子生物学研究中，藏龙卧虎的实验技术为实验的准确性和精细度提供了保障。
以下是分子生物学实验室常用技术的简介：1、聚合酶链式反应PCR技术是分子生物学重要的实验技术，通过PCR技术，能够将极少量的DNA 扩增为大量的DNA。
PCR在分子生物学中有广泛应用，包括基因片段的克隆、置换突变、基因型检测、DNA 测序等诸多方面。
PCR反应需要引物和DNA模板，引物和模板配合的合理性是PCR反应的关键。
PCR反应具体操作时需要根据引物的长度、Tm值、模板浓度、扩增片段长度等因素，进行优化以达到最佳扩增效果。
2、蛋白质电泳蛋白质电泳是一种分离蛋白质的技术，可按照分子质量和电荷分离其中的成分。
蛋白质电泳具体操作时比较复杂，核心是电泳样品的制备和电泳条件的设置。
电泳样品的制备主要包括电泳缓冲液的配制、蛋白质提取、样品准备、蛋白质定量和蛋白质加样。
电泳条件的设置主要包括电泳槽的填充、初始电压、电泳时间、gel浓度等。
3、核酸电泳核酸电泳是一种分离核酸的技术，通过电泳将带负电的DNA/RNA片段从电泳起点移向电极终点，达到分离纯化的目的。
关键是电泳实验条件的设置，包括电泳缓冲液的配制、电泳时间、电压、电泳gel浓度和transfer buffer浓度等。
4、原位杂交法原位杂交法是研究DNA 和RNA 相互作用的一种方法。
该方法能够定量测定DNA或RNA与特定基因的结合能力，从而实现特定基因的检测与鉴定。
原位杂交方法的操作步骤主要包括制备标记探针、制备样品、加标记探针、定性分析、定量分析等。
此方法具有灵敏度高，特异性强等优点。
分子生物学实验技术方法
【实验技术方法】分子生物学技术(zt)分子生物学技术真核细胞DNA的制备与定量|质粒DNA的碱裂解法提取与纯化|λ噬菌体DNA提取|DNA分子的限制性内切酶消化|DNA片段回收与纯化|目的基因的亚克隆|PCR|引物参数计算|PCR产物的克隆|DNA序列测定|Southern 杂交|PCR-SSCP|细胞凋亡|RNA操作中的一般要求|RNA的制备|mRNA的分离与纯化|RT-PCR|Northern Blot|RPA|ddPCR|原位杂交|原核表达|蛋白SDS电泳|Western|表达蛋白的分离与纯化|表达蛋白的生物学活性的检测|真核转染真核细胞DNA的制备与定量制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K 消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4．20% SDS5．2mg/ml蛋白酶K6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。
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（分析酶切位点）
/
（CpG Island Searcher）
NCBI中基因序列查找
常见物种名称
Homo sapiens (人类) Sus scrofa (猪) Rattus norvegicus (大鼠) Mus musculus (小鼠) Bos taurus (牛)
DNA
DNA（Deoxyribonucleic acid ） : 脱氧核糖核酸,是染色体 的主要化学成分，同时也是组成基因的材料
DNA 双螺旋结构
1953年沃森和克里克提出了 DNA的双螺旋结构,开创了 分子生物学的新纪元。并
在此基础上提出的中心法
则，描述了遗传信息从基 因到蛋白质结构的流动
A-T
分子生物主要研究内容
核酸的分子生物学 蛋白质的分子
核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要 作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（molecular genetics）是其主要组成部分。由于从上世纪50年代以来的迅
The boundary of TSARG4 gene exons and introns
Exon
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Exon size(bp)
？
59 75 67 62 50 35 109 79 116
5′splice acceptor
Intron size(bp)
3′splice donor
胚胎移植前遗传学诊断（PGD）
从发育到4-8细胞的胚胎中，取出一个细胞进行 细胞遗传学或分子遗传学检查，再将检查正常的 胚胎放到子宫中，以达到优生优育的目的。
二、基本的生物信息分析技术
生物信息学（Bioinformatics）是一门数学、统计、计算机与生 物医学交叉结合的新兴学科,它已广泛地渗透到医学的各个研 究领域中，成为生物医学发展不可缺少的重要 工具。 随着人 类基因组计划的快速发展，生物信息学技术在人类疾病与功 能基因的发现与识别、基因与蛋白质的表达与功能研究方面 都发挥着关键的作用。生物信息学技术在基于基因与蛋白质
基因外显子、内含子
TAA TGA ATG TAG
5'
基因一般结构
3'
外显子：出现在成熟mRNA分子中的基因序列。
内含子：不出现在成熟mRNA分子中的基因序列。
2.蛋白质的分子生物学
蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子 ──蛋白质的结构与功能。
蛋白质是一种复杂的有机化合物 ,是由氨基酸分子呈线 性排列所形成，相邻氨基酸残基的羧基和氨基通过肽键 连接在一起。
质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分
化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。 信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导 与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种 途径间的网络控制系统。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述 核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领 域之一。
特殊结构, T－ DNA 上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生 长素与分裂素 )
RNA
RNA (RiboNucleic Acid)：核糖核酸，是由至少几十个核糖 核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得 名,简称RNA。
RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。
GACCCCGGAGgtgaggatgg
tcatccccagGATTGCCCAG ctctctgcagATGACAACAT tcccgtgcagCCTGGTTCAC ccctgccttcCAGATGCAAG ggcctcacagGATTCTGGAT actccaccagGATGACAGCA tcctgataagGTTGTACCAG gccttttcagCAAAAAATGG tcctatacagGGGCCAGCAT
基
因
基因：是位于染色体上的遗传功能单位，是编码蛋白质（酶）或RNA的一 段双链DNA片段。
基因座（locus/loci）：每一对基因分别位于来自双亲的染色体的同一位 置上，这个位置称为~。 等位基因：一对同源染色体同一基因座上的一对基因称为一对等位基因 （allele）。 复等位基因：在一个群体中，每一个基因座位上可以有2个以上等位基因， 这就是复等位基因（multiple allele ）。 假基因（pseudo gene）：与功能基因相似的序列，但由于突变等原因， 不能转录或能转录但不能剪接形成成熟mRNA分子。这些序列称为~。 超基因（super gene）: 是指作用于一种性状或作用于一系列相关性状的 几个紧密连锁的基因。
11
12 13
168
87 153
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RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内， RNA是遗传信息的载体。RNA一般是单链线形分子;也有双链
的如呼肠孤病毒RNA；环状单链的如类病毒RNA；1983年还发
现了有支链的RNA分子。
RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子 由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤，G鸟嘌 呤，C胞嘧啶，U尿嘧啶。其中，U（尿嘧啶）取代了DNA中的T（胸腺 嘧啶）而成为RNA的特征碱基。
地中海贫血的产前诊断和遗传咨询工作奠定基础。方法 应用PCR技术对9例α地中海
贫血患者及1例风险胎儿进行缺失检测;应用等位基因扩增突变不应系统 （amplification refractory mutation system，ARMS）技术对25个β地中海贫血家系（其
中22例产前诊断）及7例散发病例的β珠蛋白基因nt-28（A→G）、CD17（A→T）、
G-C
常见的DNA符号
gDNA（基因组DNA） plasmid DNA（质粒DNA） mtDNA（线粒体DNA） ssDNA(鲑鱼精DNA) cDNA(互补DNA) rDNA (核糖体DNA, rDNA 就是可以转录产生 rRNA的基因 )
T-DNA(也叫三螺旋DNA，是指一种由三股ssDNA旋转螺旋行成的一种
1. 课题设计与实验方法的选择
检测的目的：
检测突变、基因多态性、基因的表达、基因定位、
基因表达调控、蛋白相互作用等
方法的选择：先了解目前检测都有哪些方法，
根据实验目的、实验时间、经费选择合适的方法。
2. 实验取材与保存：
实验材料：组织、血液/体液、细胞、病毒等。 取材注意事项:
(1) 取材时动作要迅速，材料尽可能新鲜； (2)注意无菌操作； (3)尽快放入液氮或保存液中； (4)取病理材料时，应加对照等。
速发展，该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术，是
目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸/ 基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信
息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。
中心法则（centraldogma）是其理论体系的核心。
中心法则
DNA
RNA 蛋白质
CD41-42（-CTTT）、CD71-72（+A）、IVS-2nt654（C→T）进行检测。结果 α地贫 10例标本中9例检测到了大片段缺失。β地贫中，nt-28（A→G）2例，CD17（A→T） 11例，CD41-42（-CTTT）21例，CD71-72（+A）0例，IVS-2nt654（C→T）23例。结 论 在就诊患者中，β地贫主要以点突变为主，其中有三个突变热点，分别为CD41-42 （-CTTT）、IVS-2nt654、CD17（A→T）。α地贫的基因改变主要是以大片段缺失为 主。该研究将有助于开展地中海贫血病的遗传咨询工作，为进行产前诊断和遗传优 生工作奠定基础。
蛋白质的氨基酸序列是由对应基因所编码。
3.细胞信号转导的分子生物学
细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。
构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外
界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将 这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白
三、分子生物学基本技术
PCR 检测DNA RT-PCR 检测mRNA Northern blot 检测mRNA Southern blot 检测DNA Western blot 检测蛋白质 组织原位杂交 检测mRNA IP 检测蛋白质之间的相互作用 Pull-down 检测蛋白质之间的相互作用 酵母双杂交 检测蛋白质之间的相互作用
在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类: tRNA（转运RNA） rRNA（核糖体RNA） mRNA（信使RNA）
mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是
mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA 是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。
常见的RNA符号
mRNA 信使RNA
tRNA
rRNA
转运RNA
核糖体RNA
cRNA(互补RNA, 可用分子作杂交探针) hnRNA(基因转录初产物,在细胞核内不稳定) RNAi, shRNA miRNA (真核生物内源性的小分子单链RNA，通常18-25 nt长，能