分子生物学实验设计实验

分子生物学实验

设计实验

题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ）

学院：生命科学学院

专业：生态学

教师：吴传芳

姓名/学号：余光辉/20 方成/20

一、实验目的

在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白

二、实验流程

三、实验试剂、材料及步骤

(一)质粒DNA的提取

1.原理

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌

体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，

质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染

色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和

RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常

规亚克隆及探针标记等要求

2.试剂

LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，

琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。

溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖，

10mmol/ EDTA-Na，

25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)

溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ，

2% SDS

临用前1：1配制。

溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml

冰醋酸11.5ml

双蒸水28.5ml

卡那霉素(20mg/mL)

抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ）

无水乙醇

70%乙醇

TE缓冲液或ddH2O

3.材料

含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液

1.5ml塑料离心管

EP管架

微量取液器和取液器吸头

常用玻璃器皿

4.实验步骤

（1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜

（2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液

（3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min

（4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min

（5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min

（6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中

（7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中

（9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h

（10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体

（11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min

（12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用

5.注意

（1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL

（2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用

(二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测

1.原理

在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、

开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。

当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开

环。

但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核

酸染料含量有关。

2.试剂

Gold view（DNA染料）

0.5×TBE缓冲液

上样缓冲液（6×）

3.材料

提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，

剪刀，取液器吸头

4.步骤

（1）琼脂糖凝胶板的制备：称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL0.5×TBE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。待胶液冷却到650C（不烫手

为宜），加入1μL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，（如右图）缓

慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。静置

30min左右，轻轻晃动拔出梳子。

（2）加样：胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入0.5×TBE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL Loading Buffer

（6×）混匀，加入胶板的样品小槽内

（3）电泳：将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳

（4）观察、拍照：将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带

(三)DNA的限制性内切酶酶切

1.原理

限制性内切酶能识别并切割特异的双链DNA序列，其中：

Bam HⅠ切割识别序列后产生的粘性末端：

5'⋯ G↓GATCC ⋯3' →5'⋯G GATCC⋯3'

3'⋯ CCTAG↑G ⋯5' →3'⋯CCTAG G⋯5'

Not I切割识别序列后产生的粘性末端：

5'⋯GC↓GGCCGC⋯3'→5'⋯GC GGCCGC⋯3'

3'⋯CGCCGG↑CG⋯5'→3'⋯CGCCGG CG⋯5'

2.试剂

Not I, Bam HI, ddH2O，10×buffer，琼脂糖，Gold view

3.材料

提取的质粒pEGFP-N3和pET-28a ，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套

4.步骤

（1）分别去两支0.2mlEP管做上记号：如①②

（

（3）将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37℃酶切3h

（4）取5μL ①②EP管的酶切反应液，同时取5μL原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果

（5）按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段

(四)DNA的连接

1.原理

ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮ